INTITUTO DE PESQUISA E ENSINO EM SAÚDE

DE SÃO PAULO

Flávia Cremonesi de Oliveira

Título

CARACTERIZAÇÃO DO EFEITO DA MEDITAÇÃO NA CONCENTRAÇÃO

SOROLÓGICA DO HORMÔNIO CORTISOL PELA TÉCNICA DE

RADIOIMUNOENSAIO COM MEDIÇÃO DA RADIOTIVIDADE

Projeto de Pesquisa para a Conclusão do Curso de Biologia Molecular e Citogenética

Pelo Instituto de Pesquisa e Ensino em Saúde de São Paulo

SÃO PAULO

2006

Índice:

1. Resumo 32. Introdução 43. Objetivos 84. Materiais e Métodos 8

4.1 Materiais 84.2 Metodologia 9

4.2.1 Coleta do Material 94.2.2 Metodologia Técnica 11

5. Orçamento 126. Cronograma 147. Referências Bibliográficas 15

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1. Resumo

O estresse é hoje uma desordem comum na sociedade capitalista em que vivemos, nas últimas

décadas, a expressiva mudança em todos os níveis da sociedade passou a exigir do ser humano

uma grande capacidade de adaptação. O estresse é uma reação bioquímica e comportamental que

têm sua origem na reação de lutar-ou-fugir, uma expressão do instinto de conservação e

comporta três fases consecutivas: alarme, resistência e esgotamento; é na última fase, onde há o

déficit das reservas energéticas e que começam a falhar os mecanismos de adaptação, nesta fase,

podem surgir doenças como hipertensão arterial, úlcera péptica, artrites, lesões no miocárdio, etc.

As pesquisas relacionam que em concentrações elevadas o cortisol, um hormônio esteróide

glicocorticóide, age como o principal agente do estresse. Medidas devem ser tomadas para que

haja uma reeducação preventiva desta desordem abrangendo a população geral e também uma

mudança na conduta fragmentada da medicina, buscando uma aplicação holística desta ciência.

A meditação é uma técnica Oriental milenar e apesar de existirem variações destas técnicas,

todas conduzem a um estado de atenção e relaxamento profundo. Atualmente cresce o interesse

científico por estas técnicas, que vêm provando ter eficácia nos tratamentos de ansiedade

generalizada, pânico, pânico com agorafobia, pressão sangüínea, entre outras. O objetivo deste

trabalho é a caracterização do efeito da meditação na concentração do cortisol na circulação

sangüínea de um grupo de pessoas praticantes de meditação e um grupo controle. Serão colhidas

amostras de sangue dos dois grupos antes de depois da meditação. As amostras serão analisadas

quantitativamente usando a técnica de radioimunoensaio e a radiotividade medida com um

contador de cintilação gama calibrado para Iodo 125. Paralelamente, será aplicado um

questionário para analisar estados de humor antes e após a meditação e relaxamento.

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2. Introdução

Nas últimas décadas, a expressiva mudança em todos os níveis da sociedade passou a exigir do

ser humano uma grande capacidade de adaptação. As pessoas encontram-se em freqüentes

situações de conflito diante da grande exigência imposta pela mudança nos ritmos da economia e

do mercado. Conseqüentemente, as extremas necessidades de adaptações acabam por expor às

emoções de ansiedade, angústia e desestabilização emocional.

A síndrome da tensão crônica foi descrita pela primeira vez por Selye, na década de 30 e está

associada à constante exposição a situações de estresse, que pode causar efeitos físicos adversos

pela liberação hormonal (rev. Cabral et al, 1997; Braz, 2001).

Há algum tempo a ciência tem conhecimento de que o estresse crônico, denunciado pelo

hormônio cortisol, debilita o sistema imunológico e o corpo fica mais suscetível ás infecções

(Kraft, 2006).

O estresse é uma reação bioquímica e comportamental que tem sua origem na reação de lutar-ou-

fugir, uma expressão do instinto de conservação. Como a vida atual apresenta muitos desafios,

tensões e fatores estressantes, tanto física quanto psicologicamente, esta reação tende a se repetir

com freqüência, desencadeando a síndrome da tensão crônica (Cabral at al , 1997; Braz, 2001, ).

Cabral et al (1997) e Elias (2001), descreveram a ocorrência do Estresse, a qual comportava três

fases sucessivas: reação de alarme, de resistência e de esgotamento. Após a fase de esgotamento,

observava o surgimento de algumas doenças, tais como a úlcera péptica, hipertensão arterial,

artrites, lesões miocárdicas, fadiga, falta de ar, dor de cabeça, redução da imunidade, diarréias,

distúrbios do sono, perda/ganho de peso, ansiedade, depressão, dores crônicas entre outras.

Estas desordens ocorrem na fase de esgotamento, onde começam a falhar os mecanismos de

adaptação e ocorre déficit das reservas de energia.

O estímulo agudo do estresse provoca a secreção no hipotálamo do hormônio “corticotrophin

releasing hormone” (CRH), que por sua vez determina a liberação de ACTH da adeno-hipófise,

além de outros neuro-hormônios e peptídeos cerebrais, como as beta-endorfinas, STH, prolactina

etc (Cabral et al, 1997). O ACTH desencadeia a síntese e a secreção de glicocorticóides pelo

córtex da supra-renal. Estabelece-se então um mecanismo de feedback negativo com os

glicocorticóides atuando sobre o eixo hipotálamo-hipofisário (Cabral et al, 1997; Lodish at al,

2002; Constanzo, 1999, Braz, 2001).

Os principais sinais fisiológicos das emoções são decorrentes da estimulação do sistema nervoso

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simpático, que recebe estimulação mediante fatores estressores. Esta ativação prepara o

organismo para luta ou a fuga. A composição dos hormônios liberados em situações de estresse

suprime o sistema imunológico, além de causar efeitos sobre o organismo como a constrição dos

vasos periféricos, o aumento da pressão sangüínea e da freqüência cardíaca, com conseqüente

irrigação dos músculos e do cérebro em detrimento da irrigação das vísceras, dilatação dos

bronquíolos, a inibição da contração da bexiga e dilatação pupilar (Vilela, 2006; Simon, 2006,

Cabral at al 1997, Elias, 2001).

O sistema nervoso central e o sistema imunológico compartilham um hormônio fundamental

para esta interação, trata-se do hormônio liberador da corticotropina (CRH). Produzido pelo

hipotálamo e várias outras regiões do cérebro, ele une as respostas ao estresse e imunológicas. O

hipotálamo libera o CRH num circuito especializado da corrente sanguínea, que conduz o

hormônio à hipófise, localizada logo abaixo do cérebro. O CRH faz a hipófise liberar o hormônio

adenocorticotrópico (ACTH), levando a glândula supra-renal a produzir o cortisol, o mais

conhecido hormônio do estresse (Sternberg e Gold, 2005, Cabral at al, 1997).

Hormônios são substâncias químicas secretadas na circulação sangüínea em pequenas

quantidades e levados até os tecidos-alvo, onde produz uma resposta fisiológica. São sintetizados

e secretados por células endócrinas. Os hormônios esteróides são sintetizados a partir do

colesterol e ao contrário dos hormônios protéicos, são lipofílicoss e não ficam armazenados,

sendo liberados conforme são sintetizado e têm ação lenta, demandando horas (Vulcani, 2004;

Junqueira e Carneiro, 1999; Constanzo, 1999).

Um grupo importante de hormônios liberados em resposta ao estresse é o dos glicocorticóides.

secretados pela glândula adrenal, eles muitas vezes agem como sua prima mais famosa, a

epinefrina (também conhecida como adrenalina). Ela age em segundos; os glicorticóides apóiam

esta atividade ao longo de minutos ou horas (Sapolsky, 2005, Cabral at al, 1997).

O cortisol aumenta freqüência e a intensidade dos batimentos cardíacos, sensibiliza os vasos

sangüíneos à ação da noradrenalina (um hormônio similar à adrenalina) e afeta muitas funções

metabólicas, que ajudam o corpo a enfrentar uma situação estressante. Além disso o cortisol é

um potente imuno-regulador e agente antiinflamatório, cujo papel é crucial para evitar que o

sistema imune reaja exageradamente a danos e lesões nos tecidos (Sternberg e Gold, 2005;

Cabral at al, 1997, Elias, 2001).

O sistema cerebral de resposta ao estresse é ativado em situações de perigo. O sistema

imunológico responde automaticamente aos patógenos e as moléculas desconhecidas. Os dois

são os principais recursos do corpo para manter o equilíbrio dinâmico do meio interno,

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denominado homeostase. Parte substancial da máquina celular humana se dedica à sua

manutenção. Quando a homeostase é perturbada ou ameaçada, um repertório de respostas

moleculares, celulares e comportamentais é acionado para neutralizar as forças perturbadoras e

restabelecer o equilíbrio dinâmico. Estas respostas podem ser específicas para um invasor ou

estresse definido, ou generalizadas e não específicas quando a ameaça à homeostase ultrapassa

um certo limiar. As respostas adaptativas podem se transformar em fatores estressantes capazes

de causar doenças (Sternberg e Gold, 2005; Cabral et al, 1997; Constanzo, 1999).

A função do sistema imunológico é barrar patógenos estranhos ao corpo e reconhecer e destruir

aqueles que penetram sua barreira. É também neutralizar toxinas potencialmente perigosas,

facilitar o reparo de tecidos danificados e eliminar células anormais. Essas respostas são tão

poderosas que requerem regulação constante, para não serem excessivas ou indiscriminadas, e se

manterem eficazes. Quando o sistema imunológico se desregula, surgem doenças inflamatórias,

auto-imunes ou síndromes de imunodeficiência (Sternberg e Gold, 2005).

Sternberg e Gold (2005) descreve os sistema imunológico como vários tipos de glóbulos brancos

(leucócitos), encontrados no baço, timo, gânglios linfáticos e circulantes na corrente sangüínea,

que são comandados pelo cérebro e pelos hormônios, de forma indireta, e de forma direta pelos

nervos e neuroquímicos.

Cabral at al (1997) e Braz (2001) explicam a relação existente entre o estresse e o câncer: o

estresse pode aumentar a exposição do indivíduo a carcinógenos, permitir a expressão de um

potencial genético latente por meio de mudança hormonal e bloquear as células imunológicas. É

possível predizer a doença baseando-se na quantidade de estresse pelas pessoas na vida

cotidiana.

Segundo Sternberg e Gold (2005) e Delmonte (1984), nosso estado mental pode influenciar a

forma como resistimos ou nos recuperamos de processos inflamatórios ou infecciosos.

Relaxamento é um ato de equilíbrio da natureza contra o excesso de reações lutar-ou-fugir,

constituindo-se de uma série de mudanças internas que ocorrem quando a mente e o corpo se

tranqüilizam (Golemam, 2005). Algumas técnicas podem ser utilizadas para evocar este

potencial, como o relaxamento, a respiração profunda, meditação, yoga, mantras, visualizações

de imagens, entre outras. O objetivo da utilização destas técnicas é o equilíbrio e não a supressão

da emoções, buscando um destacamento do cotidiano, do corpo e das preocupações mais

imediatas do viver. (Valle, 2001).

A meditação é uma técnica Oriental milenar e apesar de existirem variações destas técnicas,

todas conduzem a um estado de atenção e relaxamento profundo. Meditação e relaxamento são 6

coisas diferentes: em essência, a meditação é o esforço para reexercitar a atenção. É isso que dá a

meditação os efeitos incomparáveis de obtenção de conhecimentos, aumento da concentração e

capacidade de relacionar-se com empatia. A meditação é, porém, mais usada como uma técnica

rápida e fácil de relaxamento (Goleman, 2005).

Existem técnicas que suscitam uma resposta de relaxamento, que parece desempenhar um papel

na redução das respostas corporais ao estresse. Entretanto a resposta de relaxamento não é

automática como a resposta de luta e fuga. Seu desenvolvimento exige prática com determinadas

técnicas mentais, antes de poder ser evocada para evitar o estresse. (Elias, 2001) Uma rápida

recuperação do estresse é uma característica típica dos que costumam meditar (Goleman, 2005).

Em 1992, Kabat-Zinn et al, concluiu que um programa de técnicas de meditação pode reduzir

efetivamente sintomas de ansiedade e pânico e pode auxiliar a manter estas reduções em

pacientes com ansiedade generalizada, pânico e pânico com agorafobia; ele verificou também

que a meditação consciente, junto com a yoga, reduziu a necessidade do uso de analgésicos e

diminuiu a dor em quem sofria de problemas crônicos (Goleman, 2005). Segundo Poyares et al

(2005)e Demonte (1984), alguns autores defendem que tanto a acupuntura, como a prática de

yoga e meditação aumentariam a secreção de melatonina com melhora da insônia e ansiedade.

Programas realizados em Harvard e na Universidade de Massachusetts indicam sucesso no uso

da meditação com centenas de hipertensos. E um simpósio no Instituto Nacional do Coração,

Pulmão e Sangue recomendou que, para as pessoas que têm ou estão no limite da hipertensão,

deve ser usado, primeiramente, o tratamento sem remédios. Eles só devem ser receitados se esse

tipo de tratamento não der certo (Goleman, 2005).

Segundo Ornish (2005), a meditação foi utilizada como uma das técnicas no controle do estresse,

num conjunto de 93 voluntários com câncer na próstata, com PSA variando de 4 a 10 ng/ml. Os

resultados demonstraram uma diminuição de 4% do PSA do grupo experimental e aumentou 6%

no grupo de controle.

A importância da execução desta pesquisa, é a de esclarecer o papel da meditação na regulação

dos níveis de cortisol circulantes, já que este hormônio em níveis elevados, está associado ao

aparecimento e agravamento do estresse a as doenças co-relacionadas.

Também é de extrema importância que se conheça métodos alternativos para controle do

estresse, e os estudos vêm evidenciando que as práticas de meditação possui propriedades anti-

estresse , anti-hipertensiva e auxilia na melhora da resposta imune.

Na determinação do cortisol livre, será utilizado o método radioimunológico que emprega

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anticorpo altamente específico. Esta técnica é sensível para detectar níveis mínimos de cortisol

como de 5 picogramas por decilitro (ng/d) no volume da amostra sorológica equivalente a 0,1ml

(Silva, 2002).

3. Objetivos

O objetivo desta pesquisa é o de fazer um estudo comparativo dos níveis do hormônio cortisol

livre soro sanguíneo de pessoas praticantes de meditação (GE), utilizando um grupo controle de

pessoas não praticantes (GC). Esse estudo buscará analisar comparativamente os níveis do

hormônio livre no soro do sangue colhido de todos participantes (GE e GC) antes da meditação

e a outra amostra de soro será colhido após meditação do grupo de meditadores (GE) e

relaxamento do grupo controle (GC).

É também objetivo deste estudo, fazer uma análise dos questionários preenchidos pelos

participantes para confrontá-los com os dados obtidos das amostras.

4. Materiais e Métodos

4.1. Materiais

Os materiais necessários para para a análise quantitativa do hormônio cortisol no soro sangüíneo

são:

● Impressora HP Deskjet 1920 ;

● Pacote 500 folhas de papel sulfite;

● Vale lanche;

● Vale transporte;

● Freezer;

● Seringas;

● Agulhas;

● Garrotes;

● Luvas descartáveis;

● Pacote de algodão;

● Alcool etílico 70 %;

● Tubos secos;

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● Geladeira;

● Freezer;

● Centrífuga Bio-Eng – Be 4000;

● Micropipetas de precisão com capacidade de 20 uL;

● Pipetador semi-automático para dispensação exata de 500 uL;

● Pipeta com dispensação positiva para 1000 uL (extração);

● Dispensador de reagente para 1mL (lavagem) e 5 mL (extração);

● Água destilada;

● Diclorometano, NaOH 0,1 M;

● Tampão Tris-HCL 0,1 M pH 7,4 com 0,2% de BSA;

● Gás nitrogênio;

● Agitador tipo Vortex;

● Papel absorvente;

● Banho de água (+37° C);

● Tubos-teste plásticos descartáveis;

● Parafilme;

● Contador de Cintilação gama calibrado para Iodo 125;

● Kit para Radioimunoensaio, contendo:

● Tubos revestidos (Anticorpos policlonais de coelho para cortisol fixados no fundo do tubo);

● 125 I-CORTISOL (Cortisol marcado com I 125 em tampão Tris 0,08%, Timerosal, NaN3,

aditivo de cor vermelha);

● Padrões 0 a 4 liofilizados (Soro humano e 0,1% de azida sódica e Kathon – 0 / 20 / 75 /

500 / 2000 nmol/L.

● Cortisol de referência para controle positivo;

● Colchonetes;

● Aparelho de Som com CD;

● CD's com músicas de relaxamento.

4.2. Metodologia

4.2.1 Coleta do Material:

O experimento será conduzido no Departamento de Biologia Molecular e no Departamento

de Psicobiologia (onde outras pesquisas sobre Meditação estão sendo conduzidas) da Universidade

Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina.

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A pesquisa quantitativa será feita com a participação de dois grupos:

1. Grupo de Estudo (GE) – participarão 50 pessoas de idade entre 30 a 40 anos, que não possua

hábitos como, fumo, álcool ou uso de qualquer entorpecente. Também não serão aceitos

indivíduos que façam uso regularmente de medicamentos e hormônios. Neste grupo,

somente participarão os indivíduos que sejam praticantes de Meditação.

2. Grupo Controle (GC) – participarão 50 pessoas de idade entre 30 a 40 anos, que não possua

hábitos como, fumo, álcool ou uso de qualquer entorpecente. Também não serão aceitos

indivíduos que façam uso regularmente de medicamentos e hormônios. Neste grupo, os

indivíduos não deverão conhecer as técnicas de meditação. Metodologia adaptada de

Goleman (2005) e Vieira (2002).

Previamente, será feita uma divulgação em escolas de Meditação e Yoga, convidando aos

alunos praticantes à participarem do experimento, também será divulgado na Universidade

Federal de São Paulo e nas proximidades, com a intenção de recrutar as pessoas que participarão

do grupo controle.

A seleção será feita com uma entrevista prévia, onde serão selecionados os perfis supracitados.

Após seleção, será feita uma palestra para esclarecimentos a respeito da pesquisa e uma carta

de autorização será entregue para cada participante, por fim serão agendadas as datas para o

experimento (Braz, 2001).

Os dados preenchidos pelos questionários serão armazendos e ao fim da análise de todas

amostras, as informações declaradas pelos participantes serão confrontadas com os resultados de

suas amostras.

Os dois grupos de 50 serão subdivididos em 5 subgrupos de 10 pessoas de cada grupo,

totalizando 20 pessoas por dia, estas serão submetidas a um questionário de avaliação (dados

gerais e também serão questionados sobre como se sentem, estressados, ansiosos, tranqüilos,

alegres), depois será feita a primeira coleta de sangue periférico por punção venosa e a amostra

será dispensada em tubos secos e serão armazenados à -20° C.

Depois da coleta, o grupos GE e GC serão conduzidos a uma sala espaçosa com colchonetes

individuais para deitarem e ao som de músicas instrumentais buscarem o relaxamento

(indivíduos não praticantes de meditação) e meditação (indivíduos praticantes) (metodologia 10

adaptada de Goleman, 2005).

O procedimento será iniciado as 7:00hs da manhã, pois devido ao ritmo circadiano, entre 7 e 8

horas da manhã, ocorrem os maiores picos de cortisol no sangue (Protocolo CIS Bio

International, 2006), a duração da meditação e relaxamento será de 45 minutos (procedimento

adaptado de Goleman, 1998). Ao fim será repetida a colheita do sangue periférico por punção

venosa e a amostra será dispensada em tubos secos identificados e serão armazenados à - 20° C

e posteriormente, as amostras serão divididas em lotes para as futuras análises.

Os participantes deverão relatar no mesmo questionário inicial o estado emocional que se

encontram após a meditação/relaxamento. Serão distribuídos os vale-lanches e os vale-

transportes para então serem dispensados. Metodologia adaptada de Fernades, 2006.

Todos os participantes terão acesso aos resultados da pesquisa via email ou carta.

4.2.2 Medologia Técnica

Após coleta de todos os grupos, totalizando 200 amostras, será iniciado a pesquisa com a técnica

de radioimunoensaio com contador de cintilação gama calibrado para Iodo 125. O material

armazenado a -20° C será descongelado e centrifugado a 3.200 RPM por 10 minutos. O soro da

amostra será separado e será utilizado de acordo protocolo relatado abaixo.

O ensaio para calibração requer o seguinte grupo de tubos:

● Grupo de padrões, para estabelecer a curva de calibração (contém concentrações de 0, 20,

75, 500, 2000 nmol/L);

● Grupo T, para a determinação da atividade total;

● Grupo de referência, para os controles externos (o cortisol para controle positivo será

doado pelo setor de Bioquímica da UNIFESP) ;

● Grupo Sx, para o teste das amostras;

● Grupo S para controle negativo.

Todos os reagentes devem ser aquecidos à temperatura ambiente (18 a 25° C) por no mínimo

30 minutos antes do uso. A dispensação dos reagentes é também realizado à temperatura

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ambiente.

Trinta minutos antes dos primeiros ensaios, os padrões serão reconstituídos com 0,5 mL de água

destilada e os frascos serão invertidos suavemente para que haja a mistura e a completa

dissolução do material liofilizado .

O ensaio será realizado em duplicatas para o grupo de padrões, controles positivo e negativo e

amostras.

Será dispensado 20 uL dos padrões, controles e amostras a serem ensaiadas nos tubos revestidos

marcados correspondentes. A cada tubo (inclusive o Tubo T) serão adicionados 500uL de 125 I-

cortisol. Os tubos serão agitados levemente no Vortex e serão incubados por 2 horas a 37° C,

deverão estar cobertos com parafilme.

Após o período de incubação, o líquido de cada tubo de ensaio será dispensado e a parte

superior dos tubos serão firmemente batidas contra em um papel absorvente (exceto Tubo T).

Os tubos serão lavados uma vez com 1 mL de água destilada, agitando a estante com as mãos, e

após este procedimento, os tubos serão esvaziados e novamente batidos firmemente no papel

absorvente. Os tubos serão deixados virados para baixo durante 2 – 3 minutos (exceto Tubo T).

A radioatividade remanescente ligada nos tubos com um contador de

cintilação gama calibrado para Iodo 125. (Protocolo CIS Bio International,

2006).

5. Orçamento

Descrição Quantidade Valor

Contador de Cintilação gama calibrado para Iodo 125

1 R$ 8.000,00

Pipeta com dispensação positiva para 1000 uL

(extração)

1 R$1387,50

Dispensador de reagente para 1mL (lavagem) e 5 mL

(extração)

1 R$988,00

Agitador tipo Vortex 1 R$ 440,00

Impressora Jato de Tinta HP DeskJet 1920

1 R$155,00

Centrígura Hettich Mikro 110V 1 R$ 6835,68

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Descrição Quantidade Valor

Micropipeta 5-50uL 1 R$ 500,00

Micropipeta 100-1000uL 1 R$ 500,00

Micropipeta 1-5mL 1 R$ 500,00

Papel absorvente 1 caixa R$4,60

Tubos-teste plásticos descartáveis

2 Caixas com 500 R$10,00

Parafilme 1 Caixa R$ 90,00

Água destilada 100 L R$ 267,00

Tubos Secos Caixa com 500 R$ 7,70

Diclorometano, NaOH 0,1M 10 L R$ 300,00

Tampão Tris-HCL 0,1 M pH 7,4 com 0,2% de BSA

10 L R$ 1000,00

Papel Sulfite Pacote com 500 folhas R$9,00

Colchonete 25 R$ 450,00

Scalp23 300 R$ 411,00

Garrote 1,0 m R$ 1,10

Álcool Etílico 70GL 10 L R$ 32,90

Seringa 10 mL 3 pacote com 100 R$ 59,10

Luva Latex de Procedimento 7 caixas R$ 105,00

Algodão Hidrófilo Topz 5 caixa 25g R$ 8,25

Sub Total Permanente R$ 19.306,18

Sub Total Consumo R$ 2.755,65

Total Geral R$ 22.061,83

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6. Cronograma

Apresentamos na figura 1 o diagrama de Gantt com o cronograma de atividades e o relacionamento entre as etapas do projeto dividido entre as semanas de execução.

Fig.1 – Cronograma do Projeto

Segue um detalhamento de cada etapa do cronograma de atividades:

Revisão Bibliográfica: 03/07/2006 a 03/08/2006

Elaboração de folder de convite: 03/08/2006 a 10/08/2006

Elaboração do questionário: 03/08/2006 a 10/08/2006

Distribuição dos convites: 10/08/2006 a 29/08/2006

Entrevista dos participantes: 29/08/2006 a 12/09/2006

Cadastro em banco de dados: 12/09/2006 a 27/09/2006

Coleta de sangue: 27/09/2006 a 03/09/2006

Realização do Radioimunoensaio:03/10/2006 a 01/12/2006 Análise e correlacionamento dos dados: 01/12/2006 a 02/02/2007

Relatório de conclusão: 02/02/2007 a 02/03/2007

Divulgação dos resultados: 02/03/2007 a 09/03/2007

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7. Referências Bibliográficas

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