Mutações

INSTABILIDADE DO GENOMA HUMANO REPARO DO DNA

Genética Humana Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

SOBREVIVÊNCIA E REPRODUÇÃO ESTABILIDADEGENÉTICA

REPLICAÇÃO PRECISA DO DNA

REPARO DO DNA

Aberrações cromossômicas: mudança no genoma

Mutações no DNA: doenças genéticas (câncer)

Falhas

MUTAÇÃO: qualquer mudança na sequência de nucleotídeos ou

arranjo do DNA

Células germinativas: Mutação herdável

Células somáticas: Mutação somática

•Mutações genômicas: numéricas (aneuploidias)

•Mutações cromossômicas: estruturais

•Mutações gênicas: mutação de ponto

OVOCITOGÊNESE: ovócitos formados até 5o mês: número de divisões celulares do zigoto até oócito fertilizado constante: 24-31 divisões → erro de não-disjunção com aumento da idade (aneuploidias)

ESPERMATOGÊNESE: 30-31 divisões celulares até puberdade + 5 div. p/espermatogênese (23 ciclos/ano): centenas de divisões celulares dependendo da idade: 30+5[23x(25-13)]= 310 divisões

•divisões celulares contínuas → risco maior de erros de replicação do DNA → 1/10 espermatozóide → mutação deletéria nova

Exemplos: Neurofibromatose

Acondroplasia

Hemofilia B

(avô materno: fonte da mutação nova)

MUTAÇÕES – LINHAGEM GERMINATIVA

BASE MOLECULAR DAS BASE MOLECULAR DAS MUTAÇÕES GÊNICASMUTAÇÕES GÊNICAS

Mutações Mutações espontâneasespontâneas

Mutações Mutações induzidasinduzidas

Agente Agente mutagênmutagên

icoico

naturnaturaisais

MUTAÇÃO ESPONTÂNEA

ausência de um tratamento com mutágeno: fonte de variação genética

Frequência baixa: uma célula em 105 a 108

Mecanismos:erros na replicação do DNA lesões espontâneas: depurinação, desaminação

e danos oxidativos (radicais superóxido-O2;

peróxido de hidrogênio- H2O2; radicais hidroxila-OH)

elementos genéticos de transposição

•PERDA DE BASES:

Depurinação: 5.000 bases púricas (A e G)/dia/célula

Desaminação: 100 bases C >U/dia/célula

•REPLICAÇÃO: DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb

•REVISÃO DE PROVA “PROOFREADING”: corrige 99,9% dos erros de replicação

•TAXA DE MUTAÇÃO (erros de replicação): muito baixa 10-10 por pb/divisão

•GENOMA DIPLÓIDE HUMANO: ~ 6x109 pb do DNA → menos 1 mutação de pb/divisão

LESÕES ESPONTÂNEAS: ERROS DE REPLICAÇÃO DO DNA

PREVENÇÃO DE ERROS

Alguns sistemas enzimáticos neutralizam compostos potencialmente danosos, antes que reajam com o DNA

Exemplos: desintoxicação de radicais superóxido produzidos durante os danos oxidativos

a-  Enzima superóxido dismutase catalisa a conversão dos radicais superóxido peróxido de hidrogênio

b-  Enzima catalase converte peróxido de hidrogênio em água

MUTAÇÕES INDUZIDAS

Agentes químicos:

•Análogos de bases: 5-BrdU

•Alcilantes: EMS

•Intercalantes: acridina orange

Agentes físicos:

•Radiação UV

•Radiação ionizante: raios X, gama

Agentes biológicos:

•Vírus mutação insercional

RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA

Absorção da luz UV

Estado excitado de uma

base púrica ou pirimídica

Ligação covalente entre

duas pirimidinas adjacentes

Anel ciclobutano: dímeros de timina (TT)

mais estável dímeros menos estáveis: CT,

CC, TU e UU

1. Substituição de Bases: Mutação de Ponto

Mutação de sentido trocado (missense)

Mutação sem sentido (nonsense)

Mutação de processamento de RNA:destroem sítios consenso de corte; cap, poliadenilação, criam sítios crípticos: códons finalizadores e mudança de matriz de leitura (frameshift)

Mutações reguladoras: afetam a ligação de fator de transcrição e controle transcricional

TIPOS DE MUTAÇÕES: DOENÇAS GENÉTICAS HUMANAS

2. Deleções/Inserções:

Adição/deleção: pouco no. bases

Deleções maiores: Distrofina

Inserção L1 ou Alu: hemofilia A (L1); neurofibromatose (Alu)

Deleção/Duplicação (recombinação)

Crossing-over desigual

Expansão trinucleotídeos repetidos

Repetição CAG: D. Huntington

Repetição CGG: S. do X frágil

TIPOS DE MUTAÇÕES: DOENÇAS GENÉTICAS HUMANAS

POLIMORFISMO X MUTAÇÃO

POLIMORFISMO: variações no DNA

•ocorrência de dois ou mais alelos relativamente comuns para um único lócus.•Variação do DNA na qual cada sequência possível está presente em pelo menos 1% da população.•Ocorre comumente e está associado a um fenótipo normal.

Polimorfismo em sequência codificadora (5% DNA): variante protéica → fenótipos distintos

Polimorfismos de proteínas:

•Grupos sanguíneos ABO e RH

•Sistema de alfa1-antitripsina (1-AT): doença pulmonar, vários alelos (frequência de 10-75%)

•Proteínas de destoxificação de xenobióticos: CYP, GST, NAT

•Proteínas de reparo do DNA: XPD, XRCC1, XRCC2, XRCC3

Polimorfismo em sequência não-codificadora (95% DNA): intergênica ou dentro de íntrons →

ESTIMATIVA DE BASES POLIMÓRFICAS: 1:1000 pb

sem consequência para o funcionamento do gene

sem alterar proteínas

POLIMORFISMOS GENÉTICOS

RFLP SNP SSLP

Minissatélite

VNTR

Microssatélite

STR

TIPOS DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS

•Utilização como marcador genético: análise de ligação

•Diagnóstico pré-natal de doenças genéticas

•Detecção de portador heterozigoto

•Avaliação de pessoas com risco de predisposição a doenças complexas: câncer, doenças coronarianas e diabete

•Teste de paternidade e aplicações forenses

•Tipagem tissular para transplante de órgão

RFLP: Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos de Restrição

•Alelos 1 e 2: diferentes polimorfismos alteram sítios de restrição

Alelo 1: sítio R (cortado pela enzima restrição)

Alelo 2: nucleotídeo X perda R (sem corte)

•Amplificação (PCR):

primers que flanqueiam o sítio de restrição

Digestão do produto de PCR com enzima R

•Eletroforese: gel de agarose

POLIMORFISMO DE COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA SIMPLES (SSLP):

- arranjos de sequências repetidas com variação no comprimento devido diferentes números de unidades repetidas (multi-alélicos).

MINISSATÉLITES (VNTR): Número Variável de Repetições em Tandem

-unidades repetidas de DNA com 10-100 pb (30pb),

MICROSSATÉLITES (STR): Repetições em Tandem Curtas

• unidades repetidas de 2-4 pb

MINISSATÉLITES (VNTR): unidades repetidas de DNA com 10-100 pb (30pb), resultam de inserção em tandem. Encontrados preferencialmente nas regiões teloméricas (geralmente não transcritas) → sítio p/ recombinação homóloga.

Utilizados como marcadores polimórficos: datiloscopia de DNA (DNA fingerprinting)

http://www.fathom.com/course/21701758/session1.html

http://www.usask.ca/biology/rank/316/genomics/genomics.htm

Formação de unidades repetitivas

http://www.scq.ubc.ca/?p=250

Família com filhos biológicos e adotivos: Teste de Paternidade

Filha D2: o pai é de casamento anterior

Filho S2: adotado

Vítima de abuso sexual:

suspeitos 1 e 2 comparados com DNA do esperma encontrado na vítima

MICROSSATÉLITES (STR):

•unidades repetidas de 2-4 pb:

CACA...CA;

CAACAA...CAA;

AAATAAAT...AAAT.

• Existem 6,5x105 microssatélites no genoma humano.

•Lócus de microssatélite é multi-alélico: cada pessoa deve ser heterozigota em mais de 70%

•Espalhados por todo o genomaUtilizados como marcadores polimórficos: datiloscopia de

DNAhttp://www.usask.ca/biology/rank/316/genomics/genomics.htm

Doença Ligada ao X (recombinação=0)

Diagnóstico de Doença Genética

POLIMORFISMO DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO – SNP:

•Mudanças de um único nucleotídeo distribuídas por todo o genoma.

•Aproximadamente 1:1350 pb no genoma

•Cerca de 1.42 milhões de SNPs no genoma

•Polimorfismos com dois alelos

•Aplicações: marcadores de mapeamento genético; antropologia molecular (evolução) e comparação entre diferentes populações (epidemiologia molecular)

•Detecção: Chips de DNA (hibridização de nucleotídeos)

REPARO DO DNAREPARO DO DNA

Reparar danos no DNA surgidos Reparar danos no DNA surgidos espontaneamente ou induzidos por espontaneamente ou induzidos por mutágenosmutágenos

• Reparo de pareamento errôneoReparo de pareamento errôneo

• Reparo diretoReparo direto

• Reparo de excisão de basesReparo de excisão de bases

•Reparo de excisão de nucleotídeosReparo de excisão de nucleotídeos

• Reparo de quebras de fita dupla no Reparo de quebras de fita dupla no DNA DNA

LESÕES RETARDAM PROGRESSÃO DO CICLO CELULAR

Danos DNA

Bloqueio do

ciclo celular

(Checkpoint)

Reparo do DNA

Apoptose

Proteína ATMIdentifica lesão no DNA

Sinal p/ p53 → Ativar Genes Reparo DNA

• reparo pós-replicação: bases incorporadas erroneamente no DNA durante a replicação (DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb)REVISÃO DE PROVA “PROOFREADING”: corrige 99,9% dos erros de replicação

• eliminação de bases mal pareadas e alças de deleção/inserção• atua na cadeia recém-sintetizada

•genes MSH, MLH e PMSDeslizamentos da DNA Deslizamentos da DNA polimerase: regiões de polimerase: regiões de microssatélitemicrossatélite

REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO

MISMATCH REPAIR - MMRMISMATCH REPAIR - MMR

Câncer de cólon não-poliposo Câncer de cólon não-poliposo familial: familial: instabilidade de instabilidade de microssatélitesmicrossatélites-70 a 85% de risco70 a 85% de risco- mutações em mutações em MLH1 e MLH2MLH1 e MLH2 são são mais comunsmais comuns

REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEOREPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO

GG

AA

5’ 3’

Cadeia filhaCadeia filha

Cadeia Cadeia parentalparental

Base errada

MSH3

Reconhecimento Reconhecimento do dano e corte do dano e corte na cadeia filhana cadeia filha

GG

AAMSH2MSH2

MSH6

AA

GG Excisão de Excisão de fragmento de 100 fragmento de 100

a 1000pb a 1000pb contendo a base contendo a base

incorretaincorreta

Fita reparadaFita reparadaTT

AA

MLH2 PMS2

Síntese de DNA e Síntese de DNA e ligação da fita ligação da fita reparadareparada

AA

DNA pol DNA pol //

DNA ligase

Reconhecimento do dano e corteReconhecimento do dano e corte na cadeia filha na cadeia filha

• reversão ativa da lesão → sem retirar a reversão ativa da lesão → sem retirar a base danificadabase danificada

• OO66-metilguanina -metilguanina → transição G:C para A:T→ transição G:C para A:T (produzida endogenamente ou mutagênicos (produzida endogenamente ou mutagênicos químicos)químicos)

•Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase)Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase) → → remove o grupo metilremove o grupo metil

• alto custo energético → uma molécula alto custo energético → uma molécula da enzima é inativada para cada lesão da enzima é inativada para cada lesão corrigidacorrigida

REPARO DIRETOREPARO DIRETO

REPARO DIRETOREPARO DIRETO

GG

CC

Agente Agente alquilaalquilantente

GG

CC

CHCH33

O6-Metilguanina

GG

CC

MGMMGMTT

CHCH33

DNA DNA restaurado e restaurado e

enzima enzima inativainativa

GG

CC

CHCH33Reconhecimento Reconhecimento

da base alterada e da base alterada e transferência do transferência do grupo metil para grupo metil para

resíduo de resíduo de cisteína da MGMTcisteína da MGMT

Reparo Reparo DiretoDireto

MGMMGMTT

ETAPAS COMUNS

etapa 1 = incisão (endonuclease) e excisão (exonuclease)

etapa 2 = ressíntese do DNA (DNA polimerases β, δ, ε)

etapa 3 = ligação das extremidades (DNA ligases)

REPAROS DE EXCISÃO

REPARO POR EXCISÃO DE REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BERBASES - BER

• reparo de danos causados por agentes endógenos (hidrólises, oxigênio reativo) que modificam a estrutura das bases

• reparo de danos induzidos por radiação ionizante e agentes alcilantes

• rrealizado pelas DNA glicosilases quebram ligações base-açúcar liberando as bases e gerando sítios apurínicos ou apirimidínicos (sítios AP) reparado por endonucleases específica

•cada DNA glicosilase reconhece uma base alterada no DNA e catalisa sua remoção por hidrólise

•Etapas: remoção da base danificada (DNA glicosilase) sítio AP incisão do sítio AP (endonuclease) excisão e remoção gerando lacuna síntese DNA (DNA polimerase) ligação da cadeia (DNA ligase)

REPARO POR EXCISÃO DE REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BERBASES - BER

*

Base danificada

DNA DNA glicosilasglicosilas

ee

ReconhecimenReconhecimento e formação to e formação

do sítio APdo sítio AP

APE1

ReconhecimenReconhecimento e incisão 5’ to e incisão 5’

do sítio APdo sítio AP

XRCCXRCC11

DNA DNA polpol

Excisão da Excisão da porção açúcar-porção açúcar-P e síntese de P e síntese de

DNADNA

XRCCXRCC11

DNA DNA ligase ligase

IIIIII

Ligação da Ligação da cadeiacadeia

Short-patch Short-patch

Quebra de cadeia simples

XRCCXRCC11

PARPPARPReconhecimReconhecim

ento da ento da quebraquebra

PNKPNK Incisão 5’Incisão 5’

PCNPCNAA

DNA polDNA pol

FENFEN11 Síntese Síntese

DNA e DNA e excisãoexcisão

DNA DNA ligase Iligase I

Long-patchLong-patch

Ligação Ligação da da

cadeiacadeia1 nucleotídeo

2-13 nucleotídeos

REPARO POR EXCISÃO DE REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NUCLEOTÍDEOS - NERNER

• remoção de adutos no DNA remoção de adutos no DNA distorção da distorção da dupla hélicedupla hélice

• dímeros de pirimidina, HAP, cisplatinadímeros de pirimidina, HAP, cisplatina

• fatores ambientaisfatores ambientais

• principal mecanismo de reparoprincipal mecanismo de reparo

• deficiência: doenças genéticasdeficiência: doenças genéticas

•realizado pelo complexo multienzimático XPA-XPG

• remove 24-32 nucleotídeos

Xeroderma Pigmentoso Xeroderma Pigmentoso

-Mutações em XPA-XPGMutações em XPA-XPG

- 1000 a 4000X o risco de câncer de pele 1000 a 4000X o risco de câncer de pele exposição solar ou irradiação UVexposição solar ou irradiação UV

Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)

TFIIH: complexo da RNA pol II com atividade de helicase

ERCC1-XPF: endonuclease que corta a fita em 5’

XPG: endonuclease que corta a fita em 3’

DNA pol, PCNA, RPA e RFC: síntese da fita nova

Ligase

REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA DUPLA

• DSB (quebra fita dupla):DSB (quebra fita dupla): lesão espontânea lesão espontânea induzida por radicais de Oinduzida por radicais de O22 livres, replicação livres, replicação do DNA e agentes genotóxicos como a do DNA e agentes genotóxicos como a radiação ionizanteradiação ionizante

• causa de aberrações cromossômicascausa de aberrações cromossômicas

• Reparo homólogo (RH) Reparo homólogo (RH) pareamento com o cromossomo homólogo intacto

• Reparo de ligação das extremidades não- Reparo de ligação das extremidades não- homologa (NHEJ) homologa (NHEJ) religação direta das extremidades quebradas

REPARO HOMÓLOGOREPARO HOMÓLOGO

Radiação ionizante

CromátidCromátides irmãses irmãs

Quebra de Quebra de cadeia cadeia dupladupla

Degradação Degradação 5’-3’5’-3’Rad5Rad522

Rad

50 MRE1

1NBS1

BRCA1BRCA1 Rad54Rad54

Invasão Invasão da cadeiada cadeia

BRCABRCA22 Rad51Rad51

DNA DNA polpol

DNA DNA ligaseligase

Síntese de Síntese de DNA e ligação DNA e ligação das cadeiasdas cadeias

Reparo Reparo DNA com DNA com fidelidadefidelidade

d. Reparo posterior à d. Reparo posterior à duplicaçãoduplicação

por recombinação por recombinação semelhante à conversão semelhante à conversão gênicagênica

Uma das fitas vermelhas apresenta uma quebra

DNA polimerase desloca a fita

ligação dos fragmentos

duplicação posterior do DNA resulta em 3 alelos e 1 alelo

Resultado final: um alelo verde foi convertido em um vermelho

heteroduplex

ProcessamenProcessamento das to das

extremidadeextremidadess

LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-HOMÓLOGASHOMÓLOGAS

DNA fita duplaDNA fita dupla

Agente Agente danificantedanificante

Quebra de cadeia Quebra de cadeia dupladupla

DNA DNA PKc1PKc1

KU80KU70

KU80KU70

XRCC4XRCC4

DNA ligase DNA ligase IVIV Ligação das Ligação das

extremidadextremidadeses

DNA reparado DNA reparado com baixa com baixa fidelidadefidelidade

http://www.sbbq.org.br/revista/mtdidaticos/Env.pdf

Xeroderma Pigmentoso

Síndrome de Cockaine

Tricotiodistrofia

Anemia de Fanconi

Ataxia telangiectasia

Síndrome de Bloom

SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA

defeitos nos mecanismos de reparo e replicação do DNA

freqüência aberrações cromossômicas

incidência câncer

AR

Clínica

manifestações cutâneas (1,5 anos)

anomalias oculares (4 anos)

anomalias neurológicas (6 meses)

Xeroderma (pele seca)

Incidência:1/250.000 (USA); 1/40.000 (Japão)

Células XP: sensíveis a radiação UV indivíduos incapazes reparar dímeros TT: risco ↑ câncer de pele (2000x)

XP: defeito no reparo de excisão de nucleotídeos (NER)

XERODERMA PIGMENTOSO (XP)

grupos de complementação: XPA-XPG diferenças clínicas

defeitos enzimáticos incapacidade de excisar danos induzidos pela luz UV e mutagênicos químicos

diagnóstico exposição a luz solar

tratamento proteção da pele da luz solar

chapéus

óculos que absorvem luz UV

bloqueadores solares

roupas protetoras

acompanhamento periódico por dermatologista

AR

Clínica

anemia

alterações da pigmentação da pele (64%)

baixa estatura (62%)

malformações do rádio (50%)

anomalias oculares (41%), renais (34%),

microcefalia (37%), deficiência mental (25%)

90% anemia aplástica

ANEMIA DE FANCONI (FA)

incidência: 1/22.000 a 1/476.000 indivíduos

8 grupos de complementação: FANCA a FANCG (heterogeneidade genética)

células FA: sensíveis à agentes químicos que causam ligações cruzadas entre as fitas de DNA:

-mitomicina C (MMC), diepoxibutano (DEB), mostarda nitrogenada (NM), cisplatina , ...

freqüência de neoplasias: leucemias e tumores hepáticos

quebras cromossômicas espontâneas, figuras tri, quadri e multiradiais,

figuras radiais endorreduplicação

AR

Clínica

peso ao nascimento

retardo de crescimento pré e pós-natal

(145 cm H; 130 cm M)

telangiectasias e fotossensibilidade (borboleta)

cabeça alongada, microcefalia, inteligência normal

imunodeficiência: infecções (respiratórias e gastrointestinais)

SÍNDROME DE BLOOM (SB)

Incidência: 1/58.000 judeus

asquenazim

figuras quadrirradiais

mutações no gene BLM 15q26.1 DNA helicase ( RecQ) papel na replicação e reparo do DNA

Risco maior de câncer: carcinomas, leucemias e linfomas

AR

Clínica

-ataxia cerebelar (12-14 meses) disfunção neuromotora

-telangiectasia olhos e pele (3 e 5 anos) retardo de crescimento (70%)

incidência neoplasias (linfoma e leucemia linfóide) e imunodeficiências

incidência: 1/40.000

risco câncer de mama heterozigotos AT

ATAXIA TELANGIECTASIA (AT) SÍNDROME DE LOUIS-BAR

células AT sensíveis a radiação ionizante e agentes radiomiméticos (N-acetoxi-N-2-acetil-2-aminofluoreno - 4-NQO)

linfócitos AT rearranjos espontâneos dos cromossomos 7 e 14

4 grupos de complementação: A, C, D e E mutações gene ATM

gene ATM (11q22-23) diversas vias

controle transdução de sinal

checkpoint ciclo celular

resposta celular ao dano no DNA induzido por radiação

gene ATM interage p53 na checagem G1-S e mutações no gene ATM abolem mecanismo de reparo pré-síntese de DNA

defeito mecanismo de reparo do DNA ou defeito na replicação DNA