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Universidade Federal de Ouro Preto
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas – NUPEB
Departamento de Ciências Biológicas
Programa de Pós Graduação em Biotecnologia
Prospecção de peptídeos bioativos com potencial modulatório
sobre a atividade quimotripsina símile do proteassoma 20S
Simone Gonzaga do Carmo
Ouro Preto
2015
Universidade Federal de Ouro Preto
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas – NUPEB
Departamento de Ciências Biológicas
Programa de Pós Graduação em Biotecnologia
Prospecção de peptídeos bioativos com potencial modulatório
sobre a atividade quimotripsina símile do proteassoma 20S
Autora: Simone Gonzaga do Carmo
Orientador: Prof. Dr. William de Castro Borges
Co-Orientador: Prof. Dr. Marcos Aurélio de Santana
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em
Biotecnologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como
parte integrante dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Biotecnologia, Área de concentração: Genômica e
Proteômica.
Ouro Preto
2015
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
C287p Carmo, Simone Gonzaga.
Prospecção de peptídeos bioativos com potencial modulatório sobre a atividade
quimotripsina símile do proteassoma 20S [manuscrito] / Simone Gonzaga
Carmo. - 2015.
97f.: il.: color; grafs; tabs.
Orientador: Prof. Dr. William Castro-Borges. Coorientador: Prof. Dr. Marcos Aurélio Santana.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas - NUPEB. Departamento de Ciências Biológicas. Programa de Pós Graduação em Biotecnologia.
Área de Concentração: Genômica e Proteômica.
1. Inibidores enzimaticos proteoliticos. 2. Peptídeos. 3. Proteômica. I. Castro-Borges, William. II. Santana, Marcos Aurélio. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.
CDU: 606:577.212
Carmo, S.G. Ata Defesa
I
Carmo, S.G. Colaboradores
II
Colaboradores
Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade
Laboratório de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos
Carmo, S.G. Auxílio
III
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Enzimologia e Proteômica –
ICEB/NUPEB/UFOP, com auxílio da Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais
(FAPEMIG).
Carmo, S.G. Epígrafe
IV
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de
água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.”
Madre Teresa de Calcutá
Carmo, S.G. Agradecimentos
V
Agradecimentos
A minha mãe, por toda força, carinho, dedicação e apoio.
Obrigada por sempre acreditar em mim e sempre ter feito de tudo para
que as dificuldades se tornassem mais fáceis.
Ao meu pai e irmão pelo carinho.
A Iza, Joel, Lucas e Franciele pelo apoio que nunca me faltou.
Ao Moises pela paciência e incentivo durante todo este tempo.
Ao Prof. Dr. William de Castro Borges pela oportunidade,
orientação, disponibilidade, paciência e confiança. Obrigada por todo
ensinamento, foram muitos e importantes para meu crescimento
acadêmico.
Ao Prof. Dr. Marcos Aurélio de Santana pela co-orientação,
disponibilidade e apoio.
Ao Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade pela
oportunidade e ajuda.
Ao técnico José Henriques Braga Fortes, pela amizade, risadas e
toda ajuda durante esses anos.
Aos colegas do LEP que se tornaram grandes amigos durante esta
caminhada. Leandro, Ananda, Gustavo, Karina, André, Thalita,
Fernanda, Sonaly e os demais que convivi, obrigada por toda
disponibilidade, auxílio, apoio, companheirismo e desabafos.
A Ananda, Leandro e Gustavo, pela grande ajuda na conclusão
deste trabalho, foi fundamental, serei sempre grata.
Ao Zorel pela ajuda e paciência.
Aos laboratórios LBTM e LBBM por permitirem o uso dos
equipamentos para realização do trabalho.
Obrigada a todos que contribuíram de alguma forma para que
este trabalho fosse concretizado.
Carmo, S.G. Índice
VI
Índice
Lista de Figuras ..................................................................................................................... IX
Lista de Tabelas .................................................................................................................... XI
Lista de Abreviaturas .......................................................................................................... XII
Resumo ................................................................................................................................. XIV
Abstract................................................................................................................................. XV
1. Introdução ............................................................................................................................ 1
1.1. Homeostase Proteica .............................................................................................. 1
1.2. Via proteolítica intracelular dependente de Ubiquitina e Proteassoma ................. 3
1.3. Proteassoma 20S .................................................................................................... 6
1.3.1. Montagem do Proteassoma............................................................................ 10
1.3.2. Partículas regulatórias ................................................................................... 11
1.3.2.1. 19S/PA700 .............................................................................................. 12
1.3.2.2. 11S/PA28 ................................................................................................ 13
1.3.2.3. PA200 ..................................................................................................... 14
1.4. Modificações pós traducionais ............................................................................. 14
1.5. Inibidores de Proteassoma.................................................................................... 16
2. Justificativa......................................................................................................................... 22
3. Objetivos ............................................................................................................................. 23
3.1. Objetivo geral ....................................................................................................... 23
3.2. Objetivos específicos ........................................................................................... 23
4. Materiais e Métodos........................................................................................................... 24
4.1. Purificação do proteassoma 20S .......................................................................... 24
4.1.1. Extração de proteínas a partir de fígados de camundongos .......................... 24
4.1.2. Cromatografia por exclusão molecular ......................................................... 25
Carmo, S.G. Índice
VII
4.1.3. Ensaios de atividade peptidásica ................................................................... 25
4.1.4. Cromatografia por afinidade .......................................................................... 26
4.1.5. Eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida ................................. 27
4.1.6. Dosagem de proteínas e ensaios de atividade específica ............................... 28
4.1.7. Identificação das subunidades do proteassoma 20S por espectrometria de
massas ...................................................................................................................... 28
4.2. Ensaios de modulação da atividade do proteassoma 20S a partir dos peptídeos
análogos ao PR-11 ...................................................................................................... 32
4.3. Geração de peptídeos através de tripsinólise de proteínas séricas ....................... 33
4.4. Ensaios de modulação da atividade do proteassoma 20S a partir dos peptídeos
obtidos por tripsinólise de proteínas séricas................................................................ 35
4.5. Ensaios de ligação dos peptídeos trípticos ........................................................... 36
4.6. Análise Estatística ................................................................................................ 38
5. Resultados ........................................................................................................................... 39
5.1. Purificação do proteassoma 20S .......................................................................... 39
5.1.1. Primeira etapa cromatográfica: Exclusão molecular em Sephacryl S-400HR
................................................................................................................................. 39
5.1.2. Segunda etapa cromatográfica: Troca iônica em Hidroxiapatita .................. 41
5.1.3. Terceira etapa cromatográfica: Recromatografia por exclusão molecular em
Sephacryl S-400HR ................................................................................................. 43
5.1.4. Ensaio de atividade específica do proteassoma 20S ......................................... 45
5.1.5. Identificação de proteínas por espectrometria de massas .............................. 46
5.2. Ensaios de modulação da atividade do proteassoma 20S a partir dos peptídeos
análogos ao PR-11 ...................................................................................................... 53
5.3. Ensaios de modulação da atividade do proteassoma 20S a partir de peptídeos
gerados por tripsinólise de proteínas séricas ............................................................... 55
5.3.1. Ensaios de ligação peptídeos trípticos e proteassoma 20S ............................ 58
6. Discussão ............................................................................................................................. 61
Carmo, S.G. Índice
VIII
7. Conclusões .......................................................................................................................... 70
8. Perspectivas ........................................................................................................................ 72
9. Referência Bibliográfica .................................................................................................... 73
10. Apêndices .......................................................................................................................... 83
10.1. Geração de peptídeos trípticos ........................................................................... 83
10.2. Tabela Suplementar ............................................................................................ 84
Carmo, S.G. Lista de Figuras
IX
Lista de Figuras
Figura 1: Esquema de degradação pela via dependente de ubiquitina e proteassoma. ................. 5
Figura 2: Estrutura do proteassoma 20S de Eucarioto e Archaea ................................................. 7
Figura 3: Apresentação de peptídeos antigênicos gerados por degradação proteassomal. ........... 9
Figura 4: Montagem do complexo proteolítico 20S.. ................................................................. 10
Figura 5: Diversidade das partículas regulatórias do complexo proteassoma 20S ..................... 12
Figura 6: Subunidades de Proteassoma 20S. ............................................................................... 16
Figura 7: Estrutura dos inibidores de proteassoma aprovados pela FDA para uso terapêutico .. 19
Figura 8: Esquema representative da purificação do proteassoma 20S ...................................... 31
Figura 9: Depleção de proteínas em ProteoMiner (BioRad) ....................................................... 34
Figura 10: Obtenção de peptídeos trípticos via tripsinólise de proteínas séricas. ....................... 37
Figura 11: Gráfico das medidas de atividade peptidásica e cromatograma de frações
enriquecidas a 280 nm ................................................................................................................. 39
Figura 12: Perfil eletroforético da fração contendo atividade proteassomal obtida por filtração
em Sephacryl S-400HR ............................................................................................................... 41
Figura 13: Perfil eletroforético das frações obtidas por eluição em Hidroxiapatita. ................... 42
Figura 14: Perfil eletroforético das frações eluídas em Sephacryl S-400 HR ............................. 44
Figura 15: Atividade quimotripsina símile específica ao longo da purificação do proteassoma
20S .............................................................................................................................................. 46
Figura 16: Dados obtidos durante a eluição em espectrômetro de massas dos peptídeos gerados
pela digestão das frações contendo atividade quimitripsina símile do proteassoma 20S e
proteínas ligadas .......................................................................................................................... 48
Figura 17: Espectro de fragmentação do peptídeo m/z: 712.39 da subunidade α5 do proteassoma
20S. ............................................................................................................................................. 52
Figura 18: Atividade quimotripsina símile residual do proteassoma 20S frente à atividade
inibitória de PR-11 e peptídeos análogos .................................................................................... 54
Figura 19: Perfil eletroforético comparativo para avaliação da capacidade do Proteominer® na
depleção de proteínas séricas ...................................................................................................... 56
Carmo, S.G. Lista de Figuras
X
Figura 20: Atividade quimotripsina simile do proteasssoma 20S murino na presença de
peptídeos séricos totais (PST) e MG-132.................................................................................... 57
Figura 21: Contagem de íons e cromatogramas obtidos nos ensaios de ligação de peptídeos
trípticos ao proteassoma 20S ....................................................................................................... 59
Figura 22: Espectro de peptídeos não ligantes (A) e ligantes de proteassoma 20S (B). ............. 60
Figura 23: SDS PAGE 10% para digestão em gel ...................................................................... 83
Carmo, S.G. Lista de Tabelas
XI
Lista de Tabelas
Tabela 1: Sequência e concentrações utilizadas de inibidores de proteassoma 20S .................. 32
Tabela 2: Concentrações utilizadas de inibidores do proteassoma 20S ..................................... 33
Tabela 3: Rendimento Proteassoma 20S ao longo da purificação ............................................. 45
Tabela 4: Identificação de subunidades constituintes do proteassoma 20S ............................... 49
Tabela 5: Identificação de proteínas co-eluídas com o proteassoma 20S .................................. 50
Carmo, S.G. Resumo
XII
Lista de Abreviaturas
ATP - Adenosina trifosfato
BCA - Bicinchoninic acid
Da - Dalton
DTT - Ditiotreitol
DUB - Subunidade desubiquitinadora
E1 - Enzimas ativadoras
E2 - Enzimas conjugadoras
E3 - Enzimas ligases
EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid
FDA - Food and Drugs Administration
FGF - Fatores de crescimento de fibroblastos
HIF-1α - Fator de hipóxia induzido
HPLC - High Performance Liquid Chromatography
HSP - Proteína de choque térmico
Iκβ - Inibidor da NFkβ
INF - Interferons
kDa - kilodalton
M - Molar
mM - Milimolar
mg - Miligramas
MHC I - Complexo de histocompatibilidade de classe I
NFkβ - Fator nuclear kappa β
Nm - Nanômetros
PA700 - Proteasome activator 700 kDa
PAB - Proteasome biogenesis-associated
PAC - Proteasome assembly chaperones
PBS - Phosfate buffered saline
pH - Potencial hidrogeniônico
PI 31 - Protein inhibitor of 31 kDa
PIP - Proteasome interactin proteins
Carmo, S.G. Resumo
XIII
RPN - Regulatory particle non-ATPase
RPT - Regulatory particle ATPase
SDS - Duodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS
TAP - Transportadores associados ao processamento de antígenos
TFA - Ácido trifluoroacético
TNF α - Fator de necrose tumoral
Tris - Tris (hidroximetil) aminometano
Ub - Ubiquitina
V - Volts
VEGF - Fator de crescimento endotelial vascular
µM - Micromolar
µg - Micrograma
µL - Microlitro
Aminoácido Abreviatura Símbolo
Alanina Ala A
Arginina Arg R
Asparagina Asn N
Aspartato Asp D
Cisteína Cys C
Fenilalanina Phe F
Glicina Gly G
Glutamato Glu E
Glutamina Gln Q
Histidina His H
Isoleucina Ile I
Leucina Leu L
Lisina Lys K
Metionina Met M
Prolina Pro P
Serina Ser S
Tirosina Tyr Y
Treonina Thr T
Triptofano Trp W
Valina Val V
Carmo, S.G. Resumo
XIV
Resumo
A busca de peptídeos bioativos com potencial capacidade de interação e modulação da
atividade proteolítica do proteassoma 20S constitui tema de grande interesse em
biologia celular. O uso de inibidores de proteassoma já vem sendo aplicado no
tratamento de doenças como o câncer, e várias moléculas encontram-se atualmente em
fase de testes clínicos. O presente trabalho teve como objetivos a purificação do
proteassoma 20S e a avaliação do potencial inibitório de peptídeos sobre a atividade
quimotripsina-símile do complexo 20S. Neste intuito duas abordagens distintas foram
utilizadas: 1) análise do potencial inibitório de moléculas análogas ao inibidor de
proteassoma PR-11, e 2) obtenção de novos alvos com capacidade de interação e
modulação da atividade proteassomal por meio de tripsinólise de proteínas séricas. Para
purificação do proteassoma 20S utilizou-se de filtração molecular e troca iônica, as
quais proporcionaram a obtenção de dois perfis distintos do complexo 20S, após análise
por eletroforese unidimensional. A confirmação das identidades das subunidades do
proteassoma e a identificação de proteínas co-eluídas foram realizadas por
espectrometria de massas. Quanto ao potencial inibitório dos análogos do PR-11, foram
selecionados os peptídeos F12, G9F12 e I9F12. Esses demonstraram eficácia nas taxas
de inibição da atividade proteolítica do proteassoma 20S com destaque para o F12 o
qual foi capaz de inibir em cerca de 70 e 53% a atividade quimotripsina símile, quando
utilizado na concentração de 0,25 e 0,125 µM respectivamente. Para a identificação de
novos alvos moduladores de atividade do proteassoma, proteínas séricas foram
digeridas com tripsina seguido de avaliação do potencial inibitório dos peptídeos
resultantes. Os ensaios de atividade demonstraram cerca de 40 e 10% de inibição
quando os peptídeos trípticos totais foram empregados nas concentrações de 50 µM e
6,25 µM, respectivamente. A identificação dos peptídeos trípticos ligantes de
proteassoma por espectrometria de massas necessitará de novas abordagens técnicas
para ligação e recuperação da fração peptídica ligada. Os resultados obtidos neste
trabalho permitiram concluir que análogos estruturais do PR-11 representam moléculas
inibidoras de alta potência e ainda que a técnica de tripsinólise sérica utilizada, é capaz
de fornecer peptídeos alternativos para modulação da atividade proteassomal.
Carmo, S.G. Abstract
XV
Abstract
The search for bioactive peptides endowed with modulatory capability over the activity
of 20S proteasomes is a subject of major interest in cell biology. Proteasome inhibitors
have been applied in the treatment of diseases such as cancer, and several new
molecules are currently under investigation. This study aimed the purification of the
20S murine proteasome and the evaluation of potential inhibitory peptides over its
chymotrypsin-like activity. To accomplish these goals two different approaches were
used: 1) analysis of the inhibitory activity of three PR-11 derivatives, and 2) generation
of new proteasome target molecules through trypsinolysis of serum proteins. 20S
proteasome purification was achieved by gel filtration and ion exchange. These
chromatographic steps resulted in two distinct and highly homogeneous 20S complexes
as judged by one-dimensional gel electrophoresis. Confirmation of the identities for
alpha and beta proteasome subunits and co-eluted proteins was made by mass
spectrometry. The inhibitory potential of three PR-11 analogs F12, G9F12 and I9F12
was then evaluated. These PR-11 derivatives proved to be efficient 20S proteasome
inhibitors highlighting that F12 was able to inhibit approximately 70 and 53% of the
chymotrypsin-like activity when used at a concentration of 0.25 and 0.125 µM
respectively. For the identification of new target modulators of proteasome activity,
serum proteins were digested with trypsin, followed by evaluation of the inhibitory
potency of the resulting peptides. Activity assays showed approximately 40 and 10%
inhibition when total tryptic peptides were used at concentrations of 50 and 6.25 µM,
respectively. The identification of such novel proteasome ligands by mass spectrometry
will require the utilization of new approaches for binding and recovering of the bound
peptide fraction. The results of this study indicate that structural analogues of PR-11
represent inhibitory molecules endowed with high potency and serum trypsinolysis may
offer alternative molecules for modulating proteasome activity.
1. Introdução
Carmo, S.G. Introdução
1
1. Introdução
1.1. Homeostase Proteica
Todas as células utilizam da ação de mecanismos diversos e coordenados que
regulam a homeostase proteica por meio de processos de síntese, degradação e
translocação no interior dos compartimentos celulares (MORIMOTO; CUERVO, 2009).
Alterações nestes mecanismos se relacionam a patogênese de doenças humanas, como
por exemplo, as doenças neurodegenerativas e câncer (BEN-NISSAN; SHARON,
2014). As proteínas constituem os componentes mais dinâmicos da célula, assim, tanto
a síntese quanto a degradação proteica estão envolvidos em diversos processos
celulares. A abundância de proteínas no meio intracelular é regulada de acordo com as
necessidades fisiológicas do meio, o que se torna essencial na manutenção da
viabilidade e funcionalidade celular (JUNG; GRUNE, 2012; MORIMOTO; CUERVO,
2009).
A proteólise é o mecanismo mais comum de degradação envolvido na
homeostase e sua falha pode afetar as funções celulares (TURK, 2006). Este processo
está envolvido no controle de qualidade celular, removendo proteínas anormais
resultantes de mutações, com problemas conformacionais ou que tenham sido
danificadas posteriormente, evitando dessa forma, o acúmulo irregular de proteínas no
interior da célula (MORIMOTO; CUERVO, 2009). Na regulação dos níveis de
proteínas intracelulares estão envolvidas as proteases, um grupo de enzimas de extrema
importância, com função catalítica realizada através da hidrólise de ligações peptídicas
(TURK, 2006).
As proteases representam cerca de 2% do total de proteínas celulares, estão
adaptadas a condições variadas em organismos complexos (TURK, 2006), desenvolvem
papéis diversos e com alto grau de especificidade aos substratos, abrangendo desde
funções digestivas à remoção de proteínas danificadas e, resultando consequentemente,
em amplas implicações biológicas e vitais (EHRMANN; CLAUSEN, 2004). Outro
princípio referente às proteases ainda, é a forma na qual são encontradas no meio
intracelular, isto é, algumas proteases se apresentam na forma de zimogênio, forma
Carmo, S.G. Introdução
2
precursora inativa da enzima, até que sejam convertidas em enzimas ativas por meio de
hidrólise (KOBLINSKI; AHRAM; SLOANE, 2000; TURK, 2006). Como exemplo,
tem-se a tripsina, sintetizada na forma de tripsinogênio, forma latente, a qual é ativada
pela clivagem proteolítica (EHRMANN; CLAUSEN, 2004; LAZURE, 2002).
As enzimas podem ser classificadas de acordo com a posição da ligação
peptídica a ser clivada e com o mecanismo de ação nos sítios catalíticos. Quando a
protease realiza a hidrólise nas porções C-terminal ou N-terminal, são denominadas
exopeptidases, enquanto aquelas que realizam a clivagem na região interna são
denominadas endopeptidases. Já a classificação de acordo com os sítios ativos é
dividida em cinco grupos: serino-proteases, cisteíno-proteases, treonino-proteases,
metalo-proteases e aspártico-proteases (KOBLINSKI et al., 2000; TURK, 2006).
Muitas proteases degradam o substrato de forma independente, outras,
encontram-se envolvidas em vias de degradação que necessitam de diversas etapas para
que ocorra a degradação do substrato (TURK, 2006). Dessa forma, durante a evolução,
diversas formas de degradação foram desenvolvidas, sendo o primeiro sistema de
degradação intracelular descrito, o endossômico-lisossoma, no qual as proteínas são
endocitadas e degradadas por catepsinas lisossomais (DE DUVE, 1983; DE DUVE et
al., 1955). Mais tarde, na década de 70, foi descrita uma das mais importantes rotas de
degradação, a via intracelular dependente de ubiquitina e proteassoma (UPS – Ubiquitin
Proteasome System), que pode ser encontrada tanto no citosol quanto no núcleo das
células eucarióticas. A compartimentalização desta faz com que ela seja crucial na
biologia celular, e que se diferencie em relação à via lisossomal, que por sua vez realiza
a degradação no interior de organelas (ETLINGER; GOLDBERG, 1977). A via
proteolítica é constituída pelo proteassoma 26S (~ 2,5 MDa), o qual é formado por dois
subcomplexos: o proteassoma 20S e a partícula regulatória 19S ligada as extremidades
do centro catalítico 20S (JUNG; CATALGOL; GRUNE, 2009; LOWE et al., 1995;
STADTMUELLER; HILL, 2011).
Carmo, S.G. Introdução
3
1.2. Via proteolítica intracelular dependente de Ubiquitina e Proteassoma
A via proteolítica mediada por ubiquitina e proteassoma é o principal sistema de
degradação dependente de ATP, exerce funções como a degradação de proteínas
inativas e controle de qualidade de proteínas recém-sintetizadas, estando assim,
envolvido na regulação do ciclo celular, expressão de genes, respostas imune e de stress,
reparo do DNA e carcinogênese (JUNG; GRUNE, 2012). Cerca de 70% a 90% das
proteínas inativas ou que não são mais necessárias no meio celular, são direcionadas a
fim de serem degradadas pela mesma (ROCK et al., 1994). Em mamíferos, o
proteassoma, que é uma protease multicatalítica constituinte da via, pode representar
1% das proteínas totais em células hepáticas e renais, e pode ainda, ser encontrado tanto
no citosol quanto no núcleo celular, no retículo endoplasmático e em associação ao
citoesqueleto (JUNG; GRUNE, 2012; PETERS, 1994).
A alta especificidade da via é resultado da utilização de um sistema de marcação
das proteínas inativadas ou mal formadas, que utiliza a ubiquitina (Ub) como
modificação pós-traducional. A ubiquitina é uma proteína constituída por 76
aminoácidos com massa de 8 kDa, altamente conservada nas diversas espécies
(KOMANDER; RAPE, 2012). O processo de ubiquitinação dos substratos alvos
envolve uma cascata de reações e ocorre por intermédio de outras três enzimas ligases
com funções de ativação, conjugação e transferência. O primeiro passo envolve a
ativação da Ub, por meio da enzima ativadora E1, a qual se liga a porção carboxila da
mesma gerando consumo de ATP. Em seguida, a molécula de Ub é transferida para o
resíduo de lisina da enzima E2 responsável pela conjugação que atua junto a enzima
ligase E3, a enzima específica do processo que tem função de reconhecimento do
substrato. Com a identificação da proteína alvo, a enzima E3 irá realizar a adição do
monômero de ubiquitina na porção N-terminal do resíduo lisina do substrato direta ou
indiretamente (DESHAIES; JOAZEIRO, 2009; MATYSKIELA; MARTIN, 2013). A
adição é feita de forma direta ou indireta ao substrato devido a existência de duas
famílias com domínios distintos de enzimas E3, sendo elas o domínio denominado E3
Ring Finger e o domínio E3 HECT (homologous to E6AP C-terminus). A E3 Ring
Finger realiza a transferência de forma direta, isto é, da E2 para o substrato. Já o
domínio E3 HECT é responsável pela adição indireta, realizando assim, uma ligação
Carmo, S.G. Introdução
4
intermediária com a Ub, para depois adicioná-la ao substrato (GLICKMAN;
CIECHANOVER, 2002). O processo é repetido sucessivamente, formando assim uma
cadeia de poli-ubiquitinas que serão reconhecidas no processo de degradação
(MATYSKIELA; RODRIGO-BRENNI; MORGAN, 2009).
Ao serem modificadas com uma cadeia constituída de ao menos quatro
moléculas de Ub, os substratos ubiquitinados são reconhecidos por subunidades da
partícula 19S. Em seguida, é realizada a remoção das Ub por subunidades
desubiquitinadoras (DUB) e por fim, o desenovelamento através das subunidades
ATPases (LOWE et al., 1995; STADTMUELLER; HILL, 2011). O processo de
desenovelamento é importante para que os sítios de clivagem do substrato se tornem
acessíveis ao proteassoma. Após tais processos, o substrato é direcionado ao centro
catalítico através de uma abertura presente nas extremidades do proteassoma 20S, para
que ocorra então, a degradação por meio de hidrólises sucessivas. Os produtos típicos
gerados pela degradação proteassomal são oligopeptídeos de 2 a 35 aminoácidos
(Figura 1) (BHATTACHARYYA et al., 2014; WEISSMAN; SHABEK;
CIECHANOVER, 2011).
Carmo, S.G. Introdução
5
Figura 1: Esquema de degradação pela via dependente de ubiquitina e proteassoma. A ubiquitina é
ativada pela enzima ativadora E1 (1), e transferida para a enzima conjugadora E2 (2), que se liga a E3
juntamente com o substrato, transferindo a ubiquitina para este (3). Sucessivas moléculas podem ser
conjugadas formando a cadeia de poliubiquitinas (4). O substrato ligado a cadeia de poliubiquitina é
reconhecido pelas subunidades do proteassoma 26S, degradado em peptídeos (5) e a cadeia de ubiquitina
é removida pela DUB e reciclada (6). Fonte: Adaptado de CIECHANOVER (2005).
Normalmente, para que a degradação ocorra através do sistema proteassomal, é
importante que as ubiquitinações de substratos ocorram por meio de conjugação da
ubiquitina via resíduos de lisina 48 (K48). Após o processo de ubiquitinação e
direcionamento do substrato ao proteassoma, as Ub são recicladas por DUBs e podem
Carmo, S.G. Introdução
6
ser utilizadas em um novo processo de marcação (KOMANDER; RAPE, 2012;
WEISSMAN et al., 2011). Recentemente, foi demonstrado também, que o proteassoma
é capaz de degradar proteínas de forma independente à presença de marcação por
ubiquitina. O requisito principal para este tipo de degradação é a presença de uma
região desestruturada no substrato devido a oxidação, mutação, envelhecimento ou
mesmo regiões desdobradas (ASHER et al., 2005; BEN-NISSAN; SHARON, 2014).
1.3. Proteassoma 20S
O centro catalítico da via proteassomal, proteassoma 20S, recebe tal
denominação devido ao seu coeficiente de sedimentação, sendo a nomenclatura
proposta por ARRIGO et al. (1988). O proteassoma 20S (~ 700 a 750 kDa) possui
estrutura conservada e similar entre as espécies, variando apenas entre as funções
catalíticas principais ou subunidades constitutivas. É composto por 28 subunidades com
massas variando de 20 a 30 kDa, que constituem dois anéis α com função estrutural e
dois anéis β com funções catalíticas, arranjados de forma sobreposta gerando uma
estrutura cilíndrica α-β-β-α com cerca de 100 x 160 Å (JUNG; GRUNE, 2012).
Os anéis α e β são constituídos por sete subunidades cada um, sendo codificados
um único tipo de subunidade α e um único tipo de subunidade β em Archaebacteria e
Eubacteria, enquanto em Eucariotos, as subunidades são codificadas por 14 genes
distintos (Figura 2) (KISH-TRIER; HILL, 2013). Três das sete subunidades β possuem
resíduos ativos de treonina (Thr-1) localizados na porção amino-terminal, os quais são
responsáveis pelo ataque catalítico de ligações peptídicas, já que a hidroxila da cadeia
lateral do grupo Thr-1 age como nucleófilo sobre as ligações peptídicas do substrato
(JUNG; GRUNE, 2012; LUPAS; KOSTER; BAUMEISTER, 1993). As principais
subunidades catalíticas do proteassoma 20S são β1, β2, e β5, que se associam a
atividades distintas, sendo elas: β1 semelhante à caspase, clivando ligações peptídicas
após aminoácidos ácidos, β2 associada a atividade semelhante à tripsina, clivando
ligações peptídicas após aminoácidos básicos e β5 a atividade semelhante à
quimotripsina, clivando ligações peptídicas após aminoácidos hidrofóbicos (TANAKA,
KEIJI, 2013).
Carmo, S.G. Introdução
7
Figura 2: Estrutura do proteassoma 20S de Eucarioto e Archaea. A figura mostra o modelo básico de
proteassoma 20S, à esquerda o proteassoma eucarioto composto por diferentes subunidades α e β,
enquanto à direita, o proteassoma procarioto, possui apenas um tipo de subunidade α e um tipo de
subunidade β. Adaptado de JUNG; GRUNE (2012).
As subunidades α, com função estrutural, possuem sequências N-terminais que
se projetam para o centro do anel, formando assim, uma rede que restringe o acesso do
substrato à cavidade interna (GALLASTEGUI; GROLL, 2010). Após o contato com o
substrato, a conformação das subunidades α é induzida, de forma a controlar e regular o
acesso do mesmo ao canal. A restrição ao canal é induzida pelas porções N-terminais
das subunidades α2, α3 e α4, porém outra forma de modulação da entrada de substratos,
são as partículas regulatórias, que requer um rearranjo das subunidades α e exercem a
especificidade no reconhecimento destes (GROLL et al., 2000; JUNG; GRUNE, 2012).
Subunidades constitutivas do proteassoma 20S podem ainda ser modificadas
através da indução dos Fatores de necrose tumoral (TNF α) e Interferons (INF γ)
(GACZYNSKA; ROCK; GOLDBERG, 1993), o que proporciona um aumento na
complexidade de sua composição (KNIEPERT; GROETTRUP, 2014). Tal indução
pode ocorrer nos proteassomas constitutivos recém sintetizados, em praticamente todos
os tecidos em resposta a estímulos específicos, tais como processos virais, fúngicos ou
infecção bacteriana. Diante da indução, a nova forma de proteassoma gerada é
denominada imunoproteassoma e este pode realizar funções na regulação da homeostase
e ciclo celular, processos metabólicos como o proteassoma constitutivo, bem como a
Carmo, S.G. Introdução
8
apresentação de antígenos mediada pelo complexo de histocompatibilidade de classe I
(MHC I) (LIEPE et al., 2014). Quando a indução ocorre, as subunidades β catalíticas
ativas dos proteassomas recém sintetizados são substituídas por subunidades homólogas
denominadas β1i (LMP2), β2i (MECL-1), e β5i (LMP7) que são incorporadas ao
mesmo. Em células expostas ao INF γ, a expressão das novas subunidades aumenta de
acordo com o aumento de moléculas induzidas pelo INF γ (GROETTRUP; KIRK;
BASLER, 2010; KNIEPERT; GROETTRUP, 2014). A substituição também altera a
especificidade catalítica do imunoproteassoma, onde a subunidade homóloga LMP2
favorece a clivagem de peptídeos após resíduos hidrofóbicos (atividade semelhante à
quimotripsina), o que garante os requisitos de ligação ao sítio de MHC I, que no caso de
humanos, se liga a resíduos básicos e hidrofóbicos, enquanto em camundongos, se liga
apenas em resíduos hidrofóbicos. O imunoproteassoma não é capaz de criar um grande
fluxo de ligantes de MHC I a ponto de produzir uma reposta completa e independente,
porém são capazes de produzir epítopos exclusivos que exercem papel importante no
processo. As hipóteses da utilização do imunoproteassoma pela via MHC I são de que
diferentes complexos de proteassomas produzidos em diferentes células podem produzir
diferentes peptídeos, garantindo assim o processamento dos antígenos de formas
diversas (KHAN et al., 2001).
A degradação de proteínas via proteassoma ou imunoproteassoma, libera
diversos peptídeos no citosol, mitocôndria e núcleo celular, sendo que os mesmos
podem exercer funções como a apresentação de antígenos, regulação de funções
celulares, metabolismo, transcrição gênica, sinalização celular, entre outras (FERRO;
HYSLOP; CAMARGO, 2004). Os produtos gerados por meio do imunoproteassoma,
normalmente contendo de 8 a 10 aminoácidos, penetram no lúmen do retículo
endoplasmático através de transportadores associados a processamento de antígenos
(TAP) dependentes de ATP. O peptídeo é então complexado ao MHC I e o complexo
formado, é secretado para fora da célula a fim de serem apresentados às células T CD8+
(Figura 3) (GACZYNSKA et al., 1993). Outro papel reconhecido no que se refere aos
peptídeos livres no citosol, é que estes produtos proteassomais podem ainda se tornar
substrato de outras peptidases intracelulares, já que são rapidamente reduzidos a
aminoácidos, e servem também como matéria prima para síntese de novas proteínas,
tendo em vista que muitas vezes a oferta de aminoácidos exógenos é limitante
Carmo, S.G. Introdução
9
(ORLOWSKI, 1993). Os peptídeos gerados pela degradação proteassomal ainda, são
capazes de se ligarem a outras proteínas e atuarem como inibidores ou ativadores de
enzimas, modulando as atividades enzimáticas por competitividade (FRUITIER-
ARNAUDIN et al., 2002).
Figura 3: Apresentação de peptídeos antigênicos gerados por degradação proteassomal. As
proteínas são degradadas pelo imunoproteassoma gerando peptídeos que serão transportados ao retículo
endoplasmático por intermédio do transportador TAP, processo no qual, ocorre dependente de hidrólise
de ATP. O peptídeo se liga ao MHC I, são transportados até a membrana celular, onde são apresentados
para as células T CD8+. Adaptado de YEWDELL; REITS; NEEFJES (2003).
Devido à sua importância, o proteassoma de diversos organismos já foram
utilizados para estudo, como por exemplo o proteassoma de Termoplasma acidophilum
Carmo, S.G. Introdução
10
(DAHLMANN et al., 1989), Leishmania mexicana (ROBERTSON, 1999),
Trypanossoma cruzi (DE DIEGO et al., 2001) e Schistosoma mansoni (CASTRO-
BORGES et al., 2007; GUERRA-SA et al., 2005).
1.3.1. Montagem do Proteassoma
A montagem do proteassoma em organismos eucariotos exige um processo
bastante regulado a fim de garantir que todas as subunidades sejam acopladas
corretamente, já que este possui subunidades com funções distintas. Os componentes
são montados e desmontados, de forma que os níveis de proteassoma aumentam em
resposta ao estresse, o que em longo prazo exige a remoção de proteínas inativas ou que
não são mais necessárias (JUNG; GRUNE, 2012). Dessa forma, o processo é
coordenado por diversas “chaperonas de montagem do proteassoma” a fim de evitar
oligomerizações inespecíficas, as mesmas são conhecidas como PAC (proteasome
assembly chaperones) no caso de humanos e Pab (proteasome biogenesis-associated)
em leveduras (MURATA; YASHIRODA; TANAKA, 2009).
Figura 4: Montagem do complexo proteolítico 20S. As subunidades α e β são unidas por meio da
mediação de chaperonas em forma dímeros e da proteína UMP1. Ao final do processo de montagem, os
complexos mediadores são degradados. Fonte: Adaptado de MURATA et al. (2009).
As chaperonas formam os heterodímeros PAC1-PAC2 e PAC3-PAC4, formas
nas quais, se encontram estáveis (MURATA et al., 2009). O primeiro está envolvido no
acoplamento do anel α, de onde é iniciada a montagem do proteassoma, e o segundo
heterodímero, envolvido no acoplamento das subunidades β. O heterodímero PAC1-
Carmo, S.G. Introdução
11
PAC2 liga-se as subunidades α5 e α7 inicialmente, e em seguida incorpora as demais
subunidades α, gerando o anel. Por fim, PAC3-PAC4 dá início a incorporação das
subunidades β uma a uma, iniciando pela β2, β3 e β4, gerando o complexo 13S. As
demais subunidades β são incorporadas, formando um complexo intermediário
denominado “half proteasome” proteoliticamente inativo (FRENTZEL et al., 1994;
HIRANO et al., 2005; MURATA et al., 2009).
Por intermédio do fator de maturação denominado UMP1 (Ubiqutin-mediated
proteolysis), dois complexos “half proteasome” são unidos gerando o proteassoma 20S.
Dada a formação do centro catalítico, a UMP1 é degradada como primeiro substrato do
proteassoma recém formado, em seguida, os heterodímeros PAC1-PAC2 e PAC3-PAC4
também são degradados (Figura 4) (JUNG; GRUNE, 2012).
1.3.2. Partículas regulatórias
A fim de prevenir a degradação proteica de forma descontrolada ou desregulada
no meio intracelular, um conjunto de partículas regulatórias surgiu durante a evolução,
com funções nos processos de reconhecimento e degradação dos substratos proteicos
(JUNG; GRUNE, 2012). A atividade do proteassoma 20S pode ser modulada e
determinada por interações com proteínas reguladoras. Em revisão recente, foi
demonstrado que cerca de 50% do proteassoma 20S são encontrados na forma livre,
enquanto aproximadamente 30% são associados à partícula regulatória 19S, sendo o
restante associado a outras partículas como o 11S ou PA200 (BEN-NISSAN;
SHARON, 2014). A diversidade destas moléculas é ampla, de tal forma que os vários
reguladores possuem estruturas, funções e mecanismos de ação distintos e variados
(JUNG; GRUNE, 2012; STADTMUELLER; HILL, 2011).
Carmo, S.G. Introdução
12
Figura 5: Diversidade das partículas regulatórias do complexo proteassoma 20S. A) Partícula
regulatória 19S ou PA700 (substratos ubiquitinados); B) 11S ou PA28αβ (imunoproteassoma); C) 11S ou
PA28γ; D) PA200. Adaptado de BOUSQUET-DUBOUCH et al. (2011).
1.3.2.1. 19S/PA700
Dentre as diversas partículas regulatórias temos a 19S, também conhecida como
PA700 (Figura 5A), que associado às extremidades do centro catalítico 20S forma o
proteassoma 26S. O 19S exerce diversas funções na regulação do proteassoma 26S,
dentre elas, coordena o processo de degradação através do reconhecimento de substratos
poliubiquitinados, removendo as Ub’s, desenovelando e translocando-os para o interior
do complexo 20S, onde serão degradados em oligopeptídeos (GLICKMAN;
CIECHANOVER, 2002; TANAKA, K., 2009).
A partícula regulatória 19S possui massa molar de aproximadamente 700 kDa, e
é dividida em dois compartimentos que são denominados “tampa” que tem como
funções principais a desubiquitinação dos substratos, e a “base”, responsável pelo
desenovelamento do substrato e abertura do canal que dará acesso ao centro catalítico
(COUX; TANAKA; GOLDBERG, 1996). O sub-complexo base é composto por 10
subunidades no total, sendo divididas entre seis subunidades ATPases (Rpt1-6) as quais
formam um anel nas extremidades das subunidades α do proteassoma 20S e quatro
subunidades não-ATPase (Rpn1 e Rpn2, Rpn10 e Rpn13). Já a tampa contém nove
subunidades não-ATPase (Rpn3, Rpn5–Rpn9, Rpn11, Rpn12, e Rpn15) (JUNG;
GRUNE, 2012).
Dentre as subunidades, destacam-se a Rpn10 e Rpn13, responsáveis pelo
reconhecimento e remoção de Ub, sendo que a Rpn10 se localiza entre a base e a tampa
e é conhecida também por estabilizar a ligação entre ambas (VERMA et al., 2002).
Ainda, as subunidades Rpt2, Rpt3 e Rpt5 são responsáveis pela abertura das
Carmo, S.G. Introdução
13
subunidades α do proteassoma 20S (LANDER; MARTIN; NOGALES, 2013). Após o
processo de remoção das cadeias de poli-ubiquitinas as enzimas desubiquitinadoras
(DUBs) realizam hidrólises liberando as moléculas de ubiquitina para que sejam
reaproveitadas posteriormente (GLICKMAN; CIECHANOVER, 2002).
1.3.2.2. 11S/PA28
Assim como as subunidades β1i (LMP2), β2i (MECL-1), e β5i (LMP7) são
induzidas pelo IFN-γ, a associação do proteassoma 20S a partículas regulatórias
também podem sofrer tal indução. O 11S também denominado PA28, é uma importante
partícula regulatória que possui em organismos eucariotos três diferentes isoformas α, β
e γ (RECHSTEINER; HILL, 2005), sendo que as duas primeiras, são altamente
conservadas e estão envolvidas com a produção de peptídeos ligantes de MHC I
(JUNG; GRUNE, 2012).
O PA28αβ (Figura 5B) é um complexo heteroheptamérico estável formado pelo
PA28α e PA28β, descrito pela primeira vez em células de sangue de mamíferos
(LUPAS et al., 1993), possui localização preferencialmente citoplasmática e massa
molecular aproximada de 200 kDa. O complexo se associa de forma reversível às
subunidades α do proteassoma 20S formando o imunoproteassoma cuja associação é
induzida também pelo IFN-γ (JUNG; GRUNE, 2012; SONG et al., 1996). Os
heptâmeros PA28α e PA28β isolados são instáveis, porém o PA28α foi capaz de
estimular a atividade do proteassoma 20S in vitro, ao contrário do PA28β (JUNG;
GRUNE, 2012; LI; RECHSTEINER, 2001). Esta partícula regulatória ainda é a
responsável pela origem do proteassoma híbrido, junto a partícula regulatória 19S,
possibilitando a difusão de pequenos substratos ou polipeptídeos desestruturados, uma
vez que o ativador 11S atua de forma independente de ATP (GROETTRUP et al.,
2010). Ao contrário do proteassoma 26S, o imunoproteassoma não degrada proteínas
intactas e de alta massa molecular, este exerce o papel de hidrólise apenas em moléculas
menores, o que sugere um efeito cooperativo entre o proteassoma e o
imunoproteassoma, onde por exemplo, os produtos gerados pelo proteassoma, podem
vir a ser degradados posteriomente pelo imunoproteassoma (DUBIEL et al., 1992;
GLICKMAN; CIECHANOVER, 2002).
Carmo, S.G. Introdução
14
Já o PA28γ (Figura 5C) possui localização nuclear e massa molecular de
aproximadamente 31 kDa. Alguns trabalhos relacionam o PA28γ ao estímulo da
atividade semelhante à tripsina (JUNG; GRUNE, 2012; REALINI et al., 1997),
enquanto outros, já o relacionam as outras três atividades proteolíticas do proteassoma
20S (WILK; CHEN; MAGNUSSON, 2000).
1.3.2.3. PA200
O PA200 (Figura 5D) presente em humanos, também conhecido como Blm10
em leveduras, é um ativador do proteassoma 20S bem conservado, semelhante em
ambas espécies, com massa molecular de aproximadamente 250 kDa. O mesmo é capaz
de formar complexos híbridos junto a outros ativadores, ligados a extremidades opostas
(SCHMIDT; FINLEY, 2014). Assim como outros ativadores, o PA200 estimula a
hidrólise de pequenos peptídeos apenas, uma vez que a passagem de proteínas íntegras
através do canal é impossibilitada (RECHSTEINER; HILL, 2005; STADTMUELLER;
HILL, 2011). Estudos vêm mostrando o envolvimento do PA200 no reparo do DNA e
de danos oxidativos, embora suas funções fisiológicas e mecanismos não sejam ainda
bem descritos (SCHMIDT; FINLEY, 2014).
1.4. Modificações pós traducionais
As modificações pós traducionais constituem um importante mecanismo
envolvido na montagem de proteassomas, diversificação funcional, modulação da
atividade proteolítica, estabilidade, tempo de meia vida, preferência do substrato e
localização celular. O avanço das tecnologias na área de proteômica tem possibilitado a
caracterização sistemática da regulação do proteassoma via modificações pós
traducionais, sendo já identificada uma ampla gama de modificações, situada em sítios
diversos e com diferentes funções. Entre as modificações já descritas para as
subunidades do proteassoma estão, por exemplo, a fosforilação, acetilação, oxidação,
glicosilação, ubiquitinação e sumorilação (SCRUGGS et al., 2012).
Carmo, S.G. Introdução
15
As modificações podem ocorrer de formas distintas, sendo reversíveis ou
irreversíveis. Nas modificações irreversíveis, pode ocorrer a clivagem do proteassoma
por outras proteases por exemplo. Já como exemplo de modificação reversível, uma das
mais estudadas é a fosforilação. Esta é encontrada em diversas subunidades, sendo
associada à montagem do proteassoma 26S quando associadas a Rpt6 (SATOH et al.,
2001) e α7 (BOSE et al., 2004) e à atividade catalítica quando presente nas subunidades
Rpt5 (UM et al., 2010), Rpt6 (ZHANG et al., 2007), α4 (LIU et al., 2006), α3 e α2
(FENG; LONGO; FERRIS, 2001). Outra modificação é a acetilação N-terminal das
subunidades, que em proteassoma cardíaco de camundongos demonstrou relação com a
estabilidade, função e degradação do mesmo (GOMES et al., 2006). A acetilação foi
descrita em diversas subunidades tanto do centro catalítico 20S quanto da partícula
regulatória 19S, e trabalhos que utilizaram lisados de cérebro de pacientes portadores da
Doença de Alzheimer’s sugeriram relação entre a acetilação do proteassoma com
doenças neurodegenerativas (GILLARDON et al., 2007).
Modificações do tipo O-glicosilação demonstraram inibir a atividade do
proteassoma 26S, através da regulação da atividade da subunidade Rpt2 do 19S
(ZHANG et al., 2003). As modificações oxidativas por sua vez, são prejudiciais na
função proteolítica. O aumento de modificações do tipo oxidativas presentes em
proteassoma, vem sendo relacionado a isquemias (BULTEAU et al., 2001) e
cardiomiopatias (PREDMORE et al., 2010). Em revisão por SCRUGGS et al. (2012), é
possível observar uma série de modificações pós traducionais encontradas em
proteassoma cardíaco, descritas na literatura de acordo com o sítio de ligação, bem
como suas funções e abordagem proteômica utilizada para identificação das mesmas.
Em trabalho realizado por CASTRO-BORGES et al. (2007), é mostrada a diversidade
de proteassomas encontrados a partir de extrato purificado de Schistosoma mansoni
(Figura 6A), assim como em ZONG et al. (2008), que avaliou proteassoma murino
(Figura 6B). Em ambos, foram observados uma heterogeneidade de isoformas para as
diversas subunidades, sugerindo estas serem originadas de modificações pós
traducionais (CASTRO-BORGES et al., 2007; ZONG et al., 2008).
Carmo, S.G. Introdução
16
Figura 6: Subunidades de Proteassoma 20S. A) Diversidade estrutural do proteassoma 20S de S.
mansoni: Heterogeneidade de isoformas para as diferentes subunidades do proteassoma 20S de formas
adultas do verme; B) Diversidade estrutural do proteassoma 20S murino. Adaptado de CASTRO-BORGES
et al. (2007) e ZONG et al. (2008).
Além disso, um dos importantes mecanismos da regulação da proteólise é a
interação do proteassoma com proteínas intracelulares, as chamadas PIP (Proteasome
interactin proteins). Diversos estudos utilizando purificação e espectrometria de massas
têm sido desenvolvidos para compreender as funções e realizar um mapeamento de tais
interações (WANG; HUANG, 2008). Essas proteínas podem ser classificadas em dois
grupos: o primeiro grupo como fatores proteicos relacionados ao sistema de
ubiquitinação, e o segundo grupo como fatores auxiliares que regulam a função do
proteassoma (TANAKA, K., 2009). O desafio na identificação de moléculas que se
associam ao proteassoma refere-se à distinção entre componentes transitórios e
componentes estáveis, uma vez que o método de purificação por afinidade tradicional
pode vir a preservar interações transitórias. Em trabalho realizado utilizando o método
SILAC, o qual consiste na utilização de isótopo estável, foram encontradas cerca de 110
proteínas, as quais consistiam em proteínas de choque térmico (heat shock), histonas,
ubiquitina, fatores de elongação, entre outros ligados ao proteassoma 26S (WANG;
HUANG, 2008).
1.5. Inibidores de Proteassoma
Devido ao envolvimento do proteassoma em processos imunológicos e
fisiológicos diversos, bem como na manutenção da homeostase celular, o uso de
Carmo, S.G. Introdução
17
inibidores de proteassoma vêm sendo empregado como potencial alvo terapêutico em
muitas patologias. Ao serem utilizados, são capazes de induzir por exemplo, a apoptose
de células tumorais, o que ocorre, devido a importância do complexo nos processos
celulares. Os inibidores vêm demonstrando eficácia no tratamento de mieloma múltiplo
e linfoma, e diversas moléculas estão sendo avaliadas para o tratamento de várias
doenças malignas (RUSCHAK et al., 2011).
Os efeitos biológicos induzidos pelo tratamento das células com inibidores do
proteossoma são diversos, e dependem do tipo de célula, nível de proliferação, natureza
e quantidade de inibidor utilizado, bem como seu tempo de exposição (GROLL;
HUBER, 2004). Exemplos do efeito do uso de inibidores podem ser destacados, como
por exemplo, na progressão do ciclo celular. Para que ocorra a progressão do ciclo
celular, é necessária a síntese e degradação de ciclinas, moléculas estas, que constituem
alvo de degradação proteassomal. Dessa forma, dado o uso de inibidores de
proteassoma, a progressão do ciclo se torna impossibilitada, uma vez que não ocorrerá
degradação de ciclinas (KING et al., 1996). Quando inibida, a proliferação de células
tumorais é comprometida, dessa forma, o uso de inibidores de proteassoma torna-se útil
em doenças dependentes da intensa divisão celular. Trabalhos que utilizaram células de
diferentes tipos de cânceres para o tratamento com o uso de inibidores, demonstraram
uma rápida apoptose, e ainda, de forma seletiva às células mutadas, o que se torna
benéfico frente a preocupação dos possíveis danos citotóxicos que o uso destes
inibidores poderiam causar em células normais (KISSELEV; GOLDBERG, 2001).
Outro exemplo ainda é a influência na atividade do p53, conhecido por
desenvolver importante papel no controle do ciclo celular, reparo do DNA e indução da
apoptose celular. Em situações de estresse, como no dano do DNA, a proteína p53
bloqueia o ciclo celular, podendo levar ao reparo ou a apoptose. Sendo esta proteína
alvo de degradação pelo proteassoma, e dada a inibição da atividade deste, ocorrerá por
sua vez, um acúmulo de p53 e consequente apoptose (PAGANO et al., 1995). A
degradação de proteínas alteradas relacionadas com o ciclo celular, desequilíbrio de
proteínas apoptóticas e pró-apoptóticas, inibição da angiogênese, reparo do DNA
também tem sido relacionadas a contribuição para o efeito de apoptose no uso de
inibidores de proteassoma em células tumorais (KISSELEV; VAN DER LINDEN;
OVERKLEEFT, 2012).
Carmo, S.G. Introdução
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Os inibidores do proteassoma incluem moléculas que podem se dividir em
diferentes classes, (RUSCHAK et al., 2011), sendo elas: peptídeos aldeídicos, peptídeos
vinilsulfonas, peptídeos boronatos, peptídeos epoxicetonas, peptídeos semicarbazonas,
sirbactinas, beta-lactonas, falvonóides, triterpenóides, derivados de enxofre, derivados
de TMC-95, peptídeos naturais, pseudo-peptídeos e por fim, compostos organo-
metálicos (DE BETTIGNIES; COUX, 2010). Estes compostos se diferenciam além da
sua estrutura, na forma de interação, atuando diretamente no sítio catalítico por
competitividade ou alostericamente, e podem ainda realizar ligações dos tipos
reversíveis ou irreversíveis (RUSCHAK et al., 2011).
Os inibidores do tipo aldeídicos são clássicos, dando origem a partir deles, a
diversos outros inibidores. O MG-132 (Z-LLL-al) é um exemplo de inibidor reversível
da subunidade β5 do proteassoma 20S, possui capacidade de entrada rápida na célula,
alta taxa de dissociação, permite que seus efeitos sejam revertidos após sua remoção,
dessa forma, é um dos inibidores mais utilizados nos estudos relativos as funções e
mecanismos do proteassoma (DE BETTIGNIES; COUX, 2010; GOLDBERG, 2012;
ROCK et al., 1994). O uso do inibidor MG-132 demonstrou papel preventivo na
transformação de formas tripomastigotas de Trypanossoma cruzi em amastigotas em
estudo realizado por GONZALEZ et al. (1996). Em Entamoeba invadens e Entamoeba
histolitica, os inibidores MG-132 e Lactocistina bloquearam o crescimento do parasito e
previniram encistação (MAKIOKA et al., 2002), assim como em Leishmania mexicana
(ROBERTSON, 1999). Após incubação de formas larvais de Schistosoma mansoni,
seguido de infecção de camundongos, o MG-132 comprometeu a transição da fase de
cercária a esquistossômulo (GUERRA-SA et al., 2005).
Dentre os inibidores competitivos tem-se o Bortezomib (Velcade), um
dipeptídeo do tipo boronato (Figura 7A) o qual se liga de forma reversível à subunidade
β5 do proteassoma 20S. O Bortezomib foi o primeiro inibidor de proteassoma aprovado
para o uso em humanos no tratamento de mieloma múltiplo e linfoma pela Food and
Drugs Administration (FDA) em 2003 (FISHER et al., 2006; RICHARDSON et al.,
2003). Seu efeito de inibição está envolvido com o rompimento da adesão celular, da
supressão da atividade do NFκβ (DEMO et al., 2007; HIDESHIMA et al., 2002) e da
inibição da angiogênese (DEMO et al., 2007; ROCCARO et al., 2006). Em 2012, outro
inibidor de proteassoma passou a ser comercializado para o tratamento da mesma
Carmo, S.G. Introdução
19
doença, o PR-171, conhecido como Carfilzomib (Figura 7B), um tetrapeptídeo do tipo
epoxicetona, que se liga também ao resíduo de treonina da subunidade β5 de
proteassomas constitutivos e imunoproteassomas, porém de forma irreversível (KUHN
et al., 2007; PARLATI et al., 2009). O seu uso quando comparado ao Bortezomib é
considerado mais seletivo, visto que exerce pouca ou nenhuma atividade sobre outras
proteases, além de promover o acúmulo de substratos e a apoptose de forma mais eficaz
(DEMO et al., 2007; RUSCHAK et al., 2011).
Figura 7: Estrutura dos inibidores de proteassoma aprovados pela FDA para uso terapêutico. A)
Bortezomib (Velcade); B) Carfilzomib. Adaptado de KISSELEV et al. (2012).
Ao contrário dos inibidores competitivos, existem os peptídeos com capacidade
de inibir a atividade proteassomal de forma alostérica, isto é, se ligam externamente ao
proteassoma, alterando sua conformação. Como exemplo, têm-se os peptídeos ricos em
prolina e arginina, que se ligam externamente as subunidades α do proteassoma,
desestabilizando a interação proteassoma-partícula regulatória (OSMULSKI;
GACZYNSKA, 2013).
O PR-39 é um peptídeo que atua de forma alostérica e reversível, é constituído
por 39 aminoácidos, cuja sequência possui 49% de resíduos de prolina e 24% arginina
(RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP). O peptídeo foi isolado
inicialmente do intestino de suínos para uso como agente antimicrobiano, é secretado
por macrófagos e tem efeito angiogênico e anti-inflamatório através da inibição da
degradação de HIF-1α (fator de hipóxia induzido) e Iκβ respectivamente pela via
proteassomal (GAO et al., 2000). Quando incubado com proteassoma isolado ou em
extrato de células, foi demonstrado que o PR-39 impediu a formação do proteassoma
Carmo, S.G. Introdução
20
26S, já que interrompe a associação da partícula regulatória 19S e do proteassoma 20S
ao interagir com a subunidade α7 deste. Ao se ligar à subunidade, altera a conformação
do complexo 20S, causando uma consequente interferência na atividade proteolítica do
mesmo. Estudos in vivo, demonstraram efeitos anti-inflamatórios dado o uso do
peptídeo no bloqueio da degradação do fator Iκβ, inibidor da atividade de NFkβ. O Iκβ é
alvo da via proteassomal, e sua degradação permite que o fator NFkβ seja ativado,
desencadeando assim, uma série de transcrição de genes, com funções de codificar
moléculas como citocinas, fatores de crescimento e moléculas de adesão que
contribuem para proliferação celular. Dessa forma, a inibição da degradação do fator,
impede o desencadeamento de tais moléculas, reduzindo assim, o estado inflamatório.
Já a angiogênese tem como um de seus desencadeadores, o HIF-1α, que exerce papel
essencial na resposta adaptativa das células em situações de hipóxia, através do controle
da expressão de moléculas como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e
fatores de crescimento de fibroblastos (FGF). A inibição de degradação do HIF-1α,
aumenta os níveis de VEGF e FGF, os quais apresentam importantes funções
relacionadas à angiogênese (GAO et al., 2000; LI et al., 2000)
Com o intuito de avaliar a região do peptídeo PR-39 responsável pela inibição
do proteassoma, foi constatado que a sequência correspondente aos 11 aminoácidos N-
terminais do PR-39, denominada PR-11, confere capacidade de inibitória sobre a
atividade do proteassoma (GACZYNSKA et al., 2003; LI et al., 2000). Da mesma
forma, foi avaliado em trabalho realizado por ANBANANDAM et al. (2008), a
capacidade inibitória de diversos análogos do PR-11, através de modificações em
aminoácidos específicos do peptídeo. Obteve-se que o PR-11 requer pelo menos dois
resíduos de arginina ou prolina carregados positivamente na região N-terminal e a
presença de resíduos hidrofóbicos na região C-terminal, para possibilitar a interação
com a subunidade α7 e ocorrência de consequente inibição do proteassoma 20S. Dentre
os análogos testados, obteve-se uma capacidade inibitória maior que o PR-11 quando
utilizados os peptídeos W12 (RRRPRPPYLPRW) e o A8W12 (RRRPRPPALPRW).
Assim, os inibidores alostéricos vem ganhando atenção como candidatos a
fármacos inibidores de proteassoma, isto porque exibem vantagens sobre os inibidores
competitivos, uma vez que oferecem uma ampla gama de ações que interferem com a
proteólise. Dentre suas vantagens estão a maior especificidade, menor propensão a
Carmo, S.G. Introdução
21
induzir resistência, capacidade de alterar a conformação estrutural do proteassoma a fim
de impedir o acoplamento de partículas regulatórias, além da possibilidade de obter-se
análogos com grau de inibição satisfatório (RUSCHAK et al., 2011).
O uso de inibidores de proteassoma vem sendo associado ao tratamento de
tumores bem como ao tratamento de doenças auto-imunes, uma vez que células T
necessitam de imunoproteassomas para atuarem em um ambiente pró-inflamatório. O
tratamento de camundongos com o inibidor específico para subunidade β5i, o ONX-
0914, demonstrou efeito de prevenção no desenvolvimento ou progressão de artrite,
lúpus e encefalite auto-imune em modelos experimentais (KISSELEV; GROETTRUP,
2014). Além destes compostos, encontram-se atualmente em fase I de teste, os
inibidores Marizomib, também denominado NPI-0052, um potente inibidor que afeta as
atividades das três subunidades β catalíticas, e o MLN9708, um segundo composto, que
age inibindo a subunidade β5 do proteassoma, está sendo testado em pacientes com
câncer. Ambos têm demonstrado ocasionar um acúmulo de proteínas ubiquitinadas e
apoptose de células de tumorais (WEATHINGTON; MALLAMPALLI, 2014).
A identificação de moléculas ligantes e inibidoras de proteassoma torna-se de
grande importância, dada sua influência de forma positiva ou negativa sobre as taxas de
degradação dos substratos diversos pelo complexo proteolítico e seu envolvimento nos
processos celulares e patogênicos.
2. Justificativa
Carmo, S.G. Justificativa
22
2. Justificativa
O proteassoma é constituinte de uma das principais vias de degradação que
contribuem para a homeostase celular, e dada sua influência na regulação de uma série
de funções, o mesmo tem sido considerado um alvo potencial na terapêutica de diversas
patologias. Assim, a busca de peptídeos bioativos com atividade intrínseca sobre este
complexo proteolítico é de grande interesse na pesquisa básica. Trabalhos vêm
demonstrando a utilização de peptídeos diversos na modulação e inibição da atividade
proteassomal. Em estudos realizados por Anbanandam et al., 2008, foi demonstrado que
análogos à porção N-terminal do peptídeo natural PR-39, inibem fortemente o
proteassoma 20S humano. Sabendo que o PR-11, peptídeo composto pelos 11
aminoácidos terminais do PR-39, requer resíduos de arginina ou prolina carregados
positivamente na região N-terminal e resíduos hidrofóbicos na região C-terminal, para
possibilitar a ocorrência de inibição do proteassoma 20S, modificações sutis são capazes
de alterar seu potencial inibitório. O uso de triptofano por exemplo, na região N-
terminal do PR-11, aumentou significativamente a capacidade inibitória do peptídeo.
Assim, a avaliação da capacidade inibitória de novas moléculas derivadas destes
análogos, por modificações estruturais, torna-se relevante, uma vez que as atividades
inibitórias observadas para o proteassoma podem se diferenciar quando utilizadas
estruturas distintas. Tal avaliação de análogos vem sendo mostrada na literatura e
estudada pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Enzimologia e Proteômica, onde
diversos peptídeos análogos foram sintetizados previamente e utilizados neste trabalho.
Além de modificações estruturais em peptídeo com capacidade inibitória já conhecida, a
descoberta de novos alvos inibidores por meio da utilização de técnica que possibilite
grande variedade de peptídeos candidatos, é também ponto importante. Como técnica
para geração de peptídeos diversos, este trabalho propõe o uso de tripsinólise de
proteínas séricas, uma vez que a variedade de proteínas contidas no plasma é
considerável, e pode fornecer peptídeos alvos com capacidade de interação e modulação
de atividade do proteassoma 20S.
3. Objetivos
Carmo, S.G. Objetivos
23
3. Objetivos
3.1. Objetivo geral
O objetivo geral do trabalho consiste na avaliação da capacidade inibitória e de
modulação da atividade do proteassoma 20S murino por meio de ensaios de atividade
peptidásica de peptídeos análogos do PR-11 e peptídeos gerados por tripsinólise de
proteínas séricas.
3.2. Objetivos específicos
A) Purificar o proteassoma 20S alto grau de homogeneidade, a partir de fígados de
camundongos Balb/c;
B) Avaliar a capacidade inibitória dos peptídeos F12, I9F12 e G9F12, análogos do PR-
11, sobre a atividade quimotripsina símile do proteassoma 20S;
C) Gerar peptídeos diversos por meio de tripsinólise plasmática de soro fetal bovino;
D) Avaliar a capacidade de modulação de atividade dos peptídeos trípticos sob o
proteassoma 20S;
E) Avaliar e identificar por espectrometria de massas os peptídeos com capacidade de
interação ao proteassoma 20S.
4. Materiais e Métodos
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
24
4. Materiais e Métodos
O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética no uso Animal da UFOP (CEUA-
UFOP), catalogado sob o número de protocolo 2014/43.
A metodologia do trabalho será descrita em partes separadas, sendo a primeira
referente a purificação do proteassoma 20S, a segunda pertinente a avaliação da
capacidade inibitória dos peptídeos peptídeos análogos ao PR-11, e a última sobre a
geração de peptídeos por meio de tripsinólise de proteínas séricas e avaliação do
potencial de interação e modulação destes peptídeos sobre a atividade proteassomal.
4.1. Purificação do proteassoma 20S
4.1.1. Extração de proteínas a partir de fígados de camundongos
O protocolo para extração de proteínas bem como o protocolo para purificação
do proteassoma 20S, foram modificados de acordo com as metodologias utilizadas por
Abramova, 2004 e Castro-Borges, 2007.
Para obtenção de fígados a serem utilizados como fonte proteica, dez animais
com aproximadamente 10 semanas de idade, foram obtidos no Centro de Ciência
Animal da Universidade Federal de Ouro Preto. Os mesmos foram sacrificados após
administração da associação de anestésico e relaxante muscular por via intraperitoneal
(Cloridrato de Quetamina 160 mg/kg e Cloridrato de Xilazina 40 mg/kg). Os fígados
foram perfundidos com solução Salina Citratada (Cloreto de sódio 0,85%, Citrato de
sódio 0,75%) para remoção de sangue. Os órgãos foram lavados em tampão fosfato
salino (PBS) 0,1 M pH 7,4 e homogeneizados em tubo Potter por cerca de 10 minutos
em banho de gelo, na presença de tampão A (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, Ditiotreitol
(DTT) 1 mM, MgCl2 5 mM e 250 mM de Sacarose) contendo 1x Coquetel Inibidor de
Proteases (Sigma-Aldrich). O homogenato foi centrifugado inicialmente a 2000 x g por
15 minutos para remoção de debris celulares, em seguida a 6000 x g por 30 minutos
para remoção de mitocôndrias e finalmente a 46000 x g durante 2 horas para
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
25
clarificação do extrato. As centrifugações foram realizadas em Centrifuga Sorvall RC
5C a uma temperatura de 4°C.
Após a sequência de centrifugações, o sobrenadante foi recuperado e precipitado
inicialmente em sulfato de amônio na faixa de 0 a 40%, sendo a precipitação dividida
em três etapas: adição de sal sob agitação lenta e constante, manutenção do extrato em
repouso, e centrifugação a 16000 x g (Centrifuga Sorvall RC 5C). Cada uma destas
etapas teve a duração de 20 minutos. O precipitado foi descartado, e as proteínas
solúveis precipitadas com Sulfato de Amônio na faixa de 40 a 70% seguindo as mesmas
etapas descritas anteriormente. Ao final da precipitação, o sobrenadante foi descartado,
e o precipitado ressuspenso em 1 mL de Tampão B (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 250
mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 5 mM e Glicerol 10%).
4.1.2. Cromatografia por exclusão molecular
A cromatografia por exclusão molecular foi montada em suporte de dimensões
1,2 cm x 71 cm, utilizando resina Sephacryl S-400HR (GE Healthcare). A mesma foi
acoplada em HPLC (Akta Explorer GE Healthcare), e equilibrada em Tampão B. Cerca
de 40 mg de proteínas obtidas do homogenato foram submetidas a separação. A eluição
ocorreu sob fluxo constante de 12 mL/hora, foram coletadas frações de 2 mL e as
mesmas foram avaliadas em Espectrofotômetro (Shimadzu UV-1601) em comprimento
de onda 280 nm.
4.1.3. Ensaios de atividade peptidásica
Ao final da primeira etapa cromatográfica, ensaio de atividade peptidásica
utilizando substrato específico Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Sigma-Aldrich) para
quimotripsina foi realizado, a fim de detectar a presença de proteassoma nas frações
enriquecidas. Assim, três condições distintas foram avaliadas, sendo elas:
a) Atividade quimotripsina símile na presença de substrato;
b) Atividade quimotripsina símile na presença de substrato + Dodecil sulfato de
sódio (SDS) 0,02% (Sigma-Aldrich);
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
26
c) Atividade quimotripsina símile na presença de substrato + MG-132 10 µM
(Enzo Life Sciences).
Para isso, alíquotas de 10 µL das frações foram pré-incubadas durante 15
minutos junto ao tampão de reação Tris-HCl 50 mM pH 7,5, DTT 20 mM, MgCl2 5 mM
na temperatura de 37ºC. Após a incubação, o substrato foi então adicionado para a
concentração final de 25 µM em volume final de 125 µL. A reação ocorreu por 1 hora e
as leituras foram realizadas em fluorímetro de placa Victor X (Perkinelmer) nos
comprimentos de onda 405 nm (excitação) e 460 nm (emissão).
A avaliação da atividade de frações contendo proteassoma se deu através do
aumento de atividade quimotripsina símile apresentada por aquelas na presença de
substrato + SDS 0,02%, ao mesmo tempo que apresentaram forte inibição da atividade
na presença de substrato + MG-132 10 µM. Dessa forma, as frações que seguiram este
padrão, foram reunidas a fim de serem submetidas a nova etapa cromatográfica.
4.1.4. Cromatografia por afinidade
A segunda etapa cromatográfica se deu por afinidade e interação iônica em
coluna de Hidroxiapatita (Bio-Rad) de dimensões 1,6 cm x 5 cm. A mesma foi acoplada
a HPLC (Akta Explorer GE Healthcare) e equilibrada em Tampão 40 mM Fosfato de
Potássio pH 7,5 contendo DTT 1 mM, MgCl2 5 mM e Glicerol 10%. A concentração de
MgCl2 nas amostras reunidas contendo atividade proteassomal foi ajustada para 10 mM.
Utilizou-se ainda, o mesmo tampão para remoção das proteínas não ligadas. As frações
foram monitoradas por leitura em Espectrofotômetro (Shimadzu UV-1601) em
comprimento de onda 280 nm. Após remoção das proteínas não ligadas, iniciou-se um
gradiente crescente até 400 mM de Fosfato de Potássio pH 7,5 durante 50 minutos, onde
frações de 2 mL foram coletadas sob fluxo de 1 mL/min. As frações proteicas foram
avaliadas quanto a presença de proteassoma e quanto ao grau de pureza em gel de
poliacrilamida 12%.
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
27
4.1.5. Eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida
Para avaliação das frações, foram utilizados géis de separação 12% e géis de
concentração 5% em condições desnaturantes, segundo o método descrito por Laemmli,
1970. Os géis foram confeccionados utilizando as soluções tampão Tris-HCl 1,5 M pH
8,8 para os géis de separação e Tris-HCl 0.5 M pH 6,8 para os géis de concentração,
acrilamida 29%, Bis-Acrilamida 1%, solução SDS 10%, solução Persulfato de Amônio
10%, TEMED e água ultra pura (q.s.p. 10 mL).
Alíquotas de 20 µL das frações eluídas foram diluídas em Tampão de Amostra
(Tris-HCl 125 mM pH 6,8, SDS 4%, Glicerol 20% e Azul de Bromofenol 0,002%) na
proporção 1:1, e as proteínas desnaturadas em água fervente durante cinco minutos.
Após o preparo das amostras, estas foram submetidas a eletroforese sob corrente
constante de 20 mA por gel, na presença de Tampão de Corrida (Tris 25 mM pH 7,5,
Glicina 190 mM e SDS 0,1%), durante o tempo necessário para separação das proteínas
de acordo com a massa molecular. Utilizou-se ainda, como padrão de massa molecular
o Molecular Weight Marker Kit (Sigma Aldrich).
Após a eletroforese, os géis foram corados pelo método de prata, sendo
inicialmente fixados em Etanol 40%, Ácido Acético 7% overnight. Após a fixação,
realizou-se a sensibilização em solução Etanol 30%, Acetato de Sódio 6,8%, Tiossulfato
de Sódio 0,2% por 30 minutos e por fim, a coloração com solução Nitrato de Prata
0,25% durante 20 minutos ao abrigo da luz. O excesso de solução foi removido com
lavagem em água ultra pura realizada por 3 vezes de 5 minutos, e a revelação se deu em
solução Carbonato de Sódio 2,5%, Formaldeído 5% durante o tempo necessário para
visualização das bandas proteicas.
As frações que apresentaram perfil característico de bandas enriquecidas entre
20-30 kDa, indicativas da presença de proteassoma, foram reunidas e transferidas para
membrana de celulose cut-off 12000 Da (Sigma) e imerso em sacarose até redução do
volume (~ 1 mL) para que pudessem ser submetidas a nova etapa cromatográfica. Em
seguida, o pool foi aplicado em Sephacryl S-400HR (GE Healthcare), e ao final da
eluição, foram realizados ensaios de atividade peptidásica quimotripsina símile e
eletroforese. Tanto a cromatografia, ensaios de atividade e eletroforese foram realizados
conforme descrito anteriormente.
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
28
4.1.6. Dosagem de proteínas e ensaios de atividade específica
Ao final da purificação, alíquotas provenientes de cada uma das etapas foram
dialisadas em Tampão 20S (Tris-HCl 25 mM pH 7,5, DTT 1 mM, Glicerol 5%) e as
dosagens de proteínas determinadas por meio da utilização do kit BCA Protein Assay
(Pierce). As dosagens foram realizadas seguindo as recomendações do fabricante. Dessa
forma, 25 µL de amostra foram utilizados e acrescidos de 200 µL dos reagentes A e B
(50 : 1). A reação foi incubada a 37°C durante 30 minutos, e a leitura foi realizada a 570
nm em leitor de Elisa. As concentrações das frações foram obtidas de acordo com a
curva padrão de BSA.
Para o ensaio de atividade específica quimotripsina símile, foram realizados
ensaios conforme descrito no item 4.1.3 na presença de substrato específico para
quimotripsina.
4.1.7. Identificação das subunidades do proteassoma 20S por espectrometria de
massas
A) Digestão de proteínas em solução
Ao final das etapas cromatográficas, as frações obtidas foram então, submetidas
a espectrometria de massas para confirmação das identidades das subunidades do
proteassoma bem como de proteínas que estariam supostamente ligadas a ele. Dessa
forma, cerca de 5 µg de cada uma das frações finais foram digeridas em solução para
identificação. Ambas foram reduzidas em DTT 2 mM à 56°C durante 15 minutos e
alquiladas em solução de Iodoacetamida 4,5 mM por mais 15 minutos à temperatura
ambiente e ao abrigo da luz. As amostras foram diluídas 2,5 vezes em água ultra pura e
a solução de NH4HCO3 ajustada para 100 mM. A digestão das proteínas ocorreu durante
18 horas na presença de Tripsina (Promega) na proporção 1:25 (enzima:proteína), a qual
foi mantida a 37°C.
A reação foi interrompida com a acidificação da amostra por meio da adição de
ácido acético glacial ultra puro 4% (J. T. Baker). Os peptídeos foram purificados via
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
29
extração em fase sólida, utilizando coluna C18-E (55 µm, Phenomenex), seguindo as
etapas:
a) Higienização da coluna em 50% Acetonitrila, 0.1% Ácido Fórmico;
b) Equilíbrio da coluna em 0,1% Ácido Fórmico;
c) Aplicação de peptídeos e remoção da fração não ligada com 0,1% Ácido
Fórmico;
d) Eluição dos peptídeos em 50% Acetonitrila, 0,1% Ácido Fórmico.
O volume foi reduzido em speedvac (Thermo) durante o tempo necessário para
concentração total dos peptídeos. Ao final do processo, os peptídeos foram
ressuspendidos em Ácido Trifluoroacético (TFA) 0,1%.
B) Análise por espectrometria de massas
Cerca de cinco µL da solução contendo os peptídeos foram injetados utilizando
o sistema UHPLC UltiMate® 3000 (Thermo Scientific, Bremen, Alemanha) equipado
com coluna Nano-Trap Acclaim PepMap100 C18 (75 µm i.d. × 2 cm, 3 µm, 100 Å;
Thermo Scientific) e coluna capilar Acclaim PepMap100 C18 RSLC (75 µm i.d. × 15
cm, 2 µm, 100 Å; Thermo Scientific). Os peptídeos retidos na coluna guarda foram
lavados durante 3 minutos com 2% Acetonitrila, 0,05% TFA, a uma vazão de 5 µL/min
previamente à passagem do fluxo pela coluna capilar. A separação dos peptídeos foi
realizada a temperatura de 40°C utilizando gradiente de combinação de solventes, sendo
eles:
- A (0.1% Ácido Fórmico);
- B (80% Acetonitrila, 0,1% Ácido Fórmico).
O gradiente foi iniciado com 4% de solvente B e foi aumentado para 55% em 60
minutos, alcançando 90% em 80 minutos e sendo mantido dessa forma por 10 minutos.
Ao final do gradiente, retornou-se às condições iniciais na qual B permaneceu em 4%
durante 10 minutos. O sistema nanoUHPLC interfaceado com o instrumento Q-Exactive
(Thermo Scientific, Bremen, Alemanha) através da fonte Nanospray Flex Ion (Thermo
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
30
Scientific), possibilitou a análise por espectrometria de massas dos peptídeos eluídos. A
fonte equipada com emitter de aço-inixidável nano-bore (150µm o.d. × 30µm i.d.,
Proxeon, Thermo Scientific), operou sob voltagem de 1,9 kV, no modo positivo e
temperatura de 250°C. A varredura no modo scan foi realizada à uma resolução de
70.000 com tempo máximo de injeção de 100 ms e acúmulo de íons no valor de 3×106.
Os 12 íons mais intensos monitorados na faixa de 300-2.000 m/z, com carga ≥ 2 foram
isolados em uma faixa de 2 m/z antes de serem fragmentados via higher-energy
collisional dissociation (HCD), com energia de colisão normalizada em 30 V. Os
espectros MS/MS foram adquiridos com resolução de 17.500, tempo máximo de injeção
de 150 ms e acúmulo de íons no valor de 2×105 íons. O tempo de exclusão utilizado foi
de 60 segundos.
C) Processamento dos Dados
Os espectros de massas foram submetidos à busca em banco de dados utilizando
o software Proteome Discoverer (versão 1.4, Thermo Scientific). O workflow
selecionado utilizou o sistema de busca SequestHT e Event detector. Os parâmetros de
busca incluíram:
A) enzima: tripsina/P;
B) número máximo de sítio de clivagem perdidos: 2;
C) carbamidometilação (C);
D) oxidação de metionina e acetilação N-terminal, como modificações
dinâmicas;
E) tolerância de massa de 10 ppm para íons parentais e de 0,1 Da para MS/MS.
A busca foi realizada utilizando o banco de dados de Mus musculus do provedor
UniProt, contendo 25.124 sequências e 14.663.781 resíduos. Foram consideradas como
identificadas apenas as proteínas com a presença de pelo menos um peptídeo de alta
confiabilidade.
O processo de purificação do proteassoma 20S é ilustrado na Figura 8.
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
31
Figura 8: Esquema representative da purificação do proteassoma 20S
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
32
4.2. Ensaios de modulação da atividade do proteassoma 20S a partir dos peptídeos
análogos ao PR-11
Para avaliação do efeito de modulação da atividade quimotripsina símile do
proteassoma 20S, foram utilizados MG-132, o peptídeo PR-11 e três análogos
estruturais de PR-11 previamente sintetizados pelo grupo de pesquisa do Laboratório de
Enzimologia e Proteômica da UFOP. Os peptídeos, a sequência de cada um deles e as
diferentes concentrações utilizadas, podem ser observados na Tabela 1.
Tabela 1: Sequência e concentrações utilizadas de inibidores de proteassoma 20S
Peptídeos Sequência Concentrações (µM)
PR-11 RRRPRPPYLPR 0,675 1,25 2,5 5 10 20 40
F-12 RRRPRPPYLPRF 0,675 1,25 2,5 5 10 20 40
I9F12 RRRPRPPYIPRF 0,675 1,25 2,5 5 10 20 40
G9F12 RRRPRPPYGPRF 0,675 1,25 2,5 5 10 20 40
MG-132 ZLLLV 0,675 1,25 2,5 5 10 20 40
Os ensaios de atividade quimotripsina símile de todos os peptídeos foram
realizados na presença de substrato Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Sigma-Aldrich)
conforme descrito no item 4.1.3. Foram utilizados como controles comparativos o
ensaio na presença do substrato específico 1,25 mM, substrato 1,25 mM + MG-132 e
substrato 1,25 mM + PR-11.
As leituras foram realizadas a cada 15 minutos em fluorímetro de placa Victor X
(PerkinElmer). Ao final das leituras os resultados foram avaliados de acordo com os
diferentes inibidores nas dosagens utilizadas. Diante dos resultados, um segundo ensaio
utilizando concentrações menores dos peptídeos F-12, G9F12 e PR-11 foi realizado,
conforme descrito na Tabela 2.
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
33
Tabela 2: Concentrações utilizadas de inibidores do proteassoma 20S
Peptídeos Concentração (µM)
PR-11 0,125 0,25 0,5 1,0 2,0
F-12 0,125 0,25 0,5 1,0 2,0
G9F12 0,125 0,25 0,5 1,0 2,0
4.3. Geração de peptídeos através de tripsinólise de proteínas séricas
Para geração de peptídeos diversos a serem testados frente a modulação de
atividade bem como ligação do proteassoma 20S, foi utilizado soro fetal bovino
comercial. A dosagem do soro foi determinada por meio do kit BCA Protein Assay
(Pierce) conforme descrito no item 4.1.6. Dessa forma, as proteínas do soro (50 µg/µL)
foram normalizadas para manter uma homogeneidade na composição com o uso de
biblioteca combinatorial (ProteoMiner™ Protein Enrichment Kit - BioRad), seguindo
as recomendações do fabricante. Para isso, a amostra foi adicionada à resina e incubada
por 2 horas a temperatura ambiente. Em seguida, foram realizadas centrifugações de 30
segundos a 1000 x g para remoção de proteínas não ligadas. A amostra foi eluída em
condições adstringentes por meio de solução SDS 4%, DTT 25 mM. O esquema com as
etapas que envolvem a normalização pode ser observado na Figura 9.
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
34
Figura 9: Depleção de proteínas em ProteoMiner (BioRad). Adaptado: Boletim técnico da BioRad –
ProteoMiner Protein Enrichment Technology.
Após a normalização em ProteoMiner, a amostra obtida foi submetida a
eletroforese em gel SDS-PAGE 12% para quantificação em software Quantity-One
(BioRad) e avaliação do grau de depleção das proteínas abundantes por meio do perfil
eletroforético. Dada a depleção e quantificação, 25 µg de proteínas foram submetidas a
uma nova eletroforese em gel SDS PAGE 10% durante cerca de 10 minutos, tempo
necessário para que todas proteínas penetrassem no gel. Tal acompanhamento foi feito
utilizando padrão de peso molecular pré-corado (Sigma).
O gel foi corado com Coomassie Coloidal G-250 para visualização das bandas a
serem excisadas. Para isso, inicialmente o gel foi imerso em solução de Ácido
Ortofosfórico 2%, Etanol 30% e mantida overnight. A segunda etapa, consistiu da
lavagem do gel em solução Ácido Ortofosfórico 2% por 3 vezes durante 10 minutos, e
em seguida, o mesmo foi equilibrado em solução contendo Ácido Ortofosfórico 2%,
Etanol 18%, Sulfato de Amônio 15% durante 30 minutos. Por fim, a coloração se deu
em solução Ácido Ortofosfórico 2%, Etanol 18%, Sulfato de Amônio 15% e Coomassie
Coloidal G-250 2% durante 24 horas.
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
35
Após a coloração e visualização das bandas proteicas, as mesmas foram
excisadas e mantidas a 37° C, em solução descorante (40% Metanol, 7% Ácido
Acético), até a descoloração completa para início da digestão de proteína em gel. Foram
adicionados às bandas DTT 50 mM e incubadas a 65°C por 30 minutos. O DTT foi
removido, e adicionado então, Iodoacetamida 100 mM, sendo este mantido ao abrigo da
luz por 1 hora. As bandas foram lavadas por 3 vezes de 20 minutos com solução
NH4HCO3 20 mM, Acetonitrila 50% e o excesso removido em SpeedVac. Em seguida,
0,5 µg de tripsina foram adicionadas e incubadas a temperatura ambiente por 20
minutos. O excesso foi removido, os géis acrescidos de tampão NH4HCO3 20 mM e
incubados novamente por cerca de 18 horas a 37° C. O sobrenadante foi recuperado e
para extração dos peptídeos do interior do gel, foram adicionados 50 µL de Ácido
Trifluoracético 0,1%, Acetonitrila 50%, sendo mantidos por 30 minutos em temperatura
ambiente. Este último foi recuperado e unido ao primeiro, e foram concentrados
novamente em SpeedVac. Ao final do processo, os peptídeos foram ressuspendidos em
TFA 0,1%, e verificados os peptídeos gerados pela tripsinólise em espectrômetro de
massas.
4.4. Ensaios de modulação da atividade do proteassoma 20S a partir dos peptídeos
obtidos por tripsinólise de proteínas séricas
Para avaliação do efeito modulatório da atividade do proteassoma 20S a partir
dos peptídeos gerados, foram avaliadas as atividades quimotripsina símile na presença
de substrato Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC e dos peptídeos em concentrações de 50 e 6,25
µM, sendo considerada a massa média de 1500 g dos peptídeos trípticos para realização
dos cálculos de molaridade. A reação se deu conforme descrito no item 4.1.3. Foram
utilizados como controles comparativos o ensaio na presença do substrato 1,25mM e
substrato 1,25mM + MG-132 10 µM.
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
36
4.5. Ensaios de ligação dos peptídeos trípticos
Após os ensaios de atividade, um novo ensaio para avaliar a possível interação
dos peptídeos com o proteassoma 20S foi realizado. Para isso, uma alíquota de 600 µL
da fração de proteassoma foi dialisado em Tampão 20S e concentrada em Vivaspin
(Cut-off 3000 Da - GE Healthcare) para o volume final de 100 µL. Os peptídeos foram
adicionados em concentrações de 60 µM e 30 µM e incubados a 37°C durante 30
minutos. Para remoção dos peptídeos não ligados, foi feita utilizada solução tampão
Tris-HCL 1 mM pH 7,5. Em seguida, a fim de romper as interações existentes, foi
realizada alteração de pH, com a utilização de tampão Glicina 100 mM pH 3,0. Ao
final do ensaio, as frações referentes aos peptídeos não ligados e eluições foram
submetidas a purificação em coluna C-18E conforme descrito no item 4.1.7.(A), para
análise dos peptídeos ligantes em espectrômetro de massas.
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
37
Figura 10: Obtenção de peptídeos trípticos via tripsinólise de proteínas séricas.
Carmo, S.G. Materiais e Métodos
38
4.6. Análise Estatística
A análise estatística foi realizada utilizando o software Graph Pad Prism 5.0
para Windows. Utilizou-se análise de variância bi-variada (Two-way) com pós-teste
Bonferroni, para avaliação das diferenças significativas entre as atividades peptidásicas
e atividades residuais do proteassoma 20S frente ao uso dos inibidores análogos e o PR-
11, bem como o MG-132 e os peptídeos gerados pela tripsinólise de proteínas séricas. O
nível de significância utilizada foi de p < 0,05.
5. Resultados
Carmo, S.G. Resultados
39
5. Resultados
5.1. Purificação do proteassoma 20S
5.1.1. Primeira etapa cromatográfica: Exclusão molecular em Sephacryl S-400HR
A fim de identificar as frações enriquecidas com o proteassoma 20S, obtidas por
meio da cromatografia por exclusão molecular descrita no item 4.1.2, foram coletadas
frações de 2 mL, as quais foram monitoradas a 280 nm, a faixa de frações na qual
estavam presentes proteínas. Dessa forma, pode-se notar na Figura 11, a detecção de
maior presença de proteínas entre as frações 25 a 54, as quais foram avaliadas quanto a
atividade quimotripsina símile. Para isso, três condições distintas foram utilizadas, o que
possibilitou a identificação das frações com atividade quimotripsina-símile indicativa de
presença de proteassoma entre as frações 26 e 34.
Figura 11: Gráfico das medidas de atividade peptidásica e cromatograma de frações enriquecidas a
280 nm. UAF: Unidade arbitrária de fluorescência; AQS: Atividade quimotripsina símile, AQS + SDS
0.02%: Atividade quimotripsina símile + SDS 0.02%; AQS + MG-132 10 µM: Atividade quimotripsina
símile + MG-132 10 µM.
Nas condições estabelecidas, a determinação da presença do proteassoma se deu
quando ocorreu aumento da atividade na presença de SDS 0,02%, ao mesmo tempo em
que se observou inibição de cerca de 96% da atividade quimotripsina símile, quando
Carmo, S.G. Resultados
40
comparados à condição controle, que por sua vez, utilizou-se apenas proteassoma e
substrato específico. As frações com estas características foram reunidas, e junto a
fração precipitada em (NH4)2SO4 na faixa de 40 a 70% foram submetidas à eletroforese.
O perfil obtido na Figura 12 demonstrou a exclusão de uma variedade de bandas
proteicas nas frações ativas quando comparado ao perfil eletroforético do extrato inicial.
Carmo, S.G. Resultados
41
Figura 12: Perfil eletroforético da fração contendo atividade proteassomal obtida por filtração em
Sephacryl S-400HR. A) Fração 40-70% (NH4)2SO4; B) Pool ativo eluído em Sephacryl S-400HR. Mr:
massa relativa em kDa. Coloração por prata.
5.1.2. Segunda etapa cromatográfica: Troca iônica em Hidroxiapatita
As frações ativas provenientes da eluição em Sephacryl S-400HR, foram
submetidas a cromatografia em coluna de Hidroxiapatita conforme descrito em 4.1.4.
Após a remoção total das proteínas não ligadas à coluna, foi iniciado um gradiente
crescente de tampão fosfato de potássio que variou de 40 mM a 400 mM, durante o
tempo de 50 minutos e coletadas frações de 2 mL. A Figura 13 mostra o perfil de fração
Carmo, S.G. Resultados
42
não ligada à coluna e a fração contendo bandas proteicas de 20 a 30 kDa, características
às subunidades do proteassoma 20S.
Figura 13: Perfil eletroforético das frações obtidas por eluição em Hidroxiapatita. FNL: Fração não
ligada; FL: Fração ligada. Mr: Massa relativa em kDa. Coloração com prata.
Ao observar o conteúdo em destaque no retângulo vermelho, é possível notar
inicialmente a ausência de bandas proteicas compatíveis com as das subunidades α e β
do proteassoma 20S na FNL, enquanto no segundo perfil referente a FL, é possível
observar a presença de bandas proteicas entre 20 e 30 kDa. As bandas proteicas
presentes na faixa citada são compatíveis com as massas moleculares das subunidades
Carmo, S.G. Resultados
43
do proteassoma 20S e com o perfil que foi obtido em trabalho realizado por CASTRO-
BORGES et al. (2007) e (SAVULESCU et al., 2011). O perfil demonstrado foi obtido
nas frações compreendidas entre 12 e 16, o que corresponde ao intervalo do gradiente
entre 126 mM e 155 mM de tampão fosfato de potássio, fornecendo um volume de
amostra de 10 mL. Essas frações foram reunidas e concentradas em sacarose, e
realizada nova cromatografia em coluna de exclusão molecular, a fim de obter um maior
grau de enriquecimento do proteassoma 20S.
5.1.3. Terceira etapa cromatográfica: Recromatografia por exclusão molecular em
Sephacryl S-400HR
A recromatografia em exclusão molecular foi realizada nas mesmas condições
descritas inicialmente no item 4.1.2. Ao final da eluição, o perfil das frações obtidas foi
analisado em SDS-PAGE 12%, sendo aplicadas alíquotas de 35 µL das frações, onde é
possível notar na Figura 14, a obtenção de dois perfis distintos.
Carmo, S.G. Resultados
44
Figura 14: Perfil eletroforético das frações eluídas em Sephacryl S-400 HR. A) Perfil contendo
bandas proteicas características de subunidades α e β do proteassoma 20S; B) Perfil contendo bandas
proteicas características de subunidades α e β do proteassoma 20S + bandas com alta massa molecular.
Mr: Massa relativa em kDa. Coloração por prata.
Em ambos os perfis demonstrados em A e B, observa-se a existência de bandas
proteicas entre 20 e 30 kDa assim como na Figura 13 (FL), remetendo a um perfil
semelhante as subunidades α e β constituintes de proteassoma. Avaliando os perfis
separadamente, pode ser notado em A, a ausência de bandas proteicas referentes a
proteínas de alta massa molecular, enquanto em B, destacadas pelas setas vermelhas, é
possível observar o surgimento de bandas proteicas co-eluídas com o proteassoma 20S
que podem sugerir proteínas ligantes de proteassoma. Dessa forma, ambas as amostras
Carmo, S.G. Resultados
45
foram submetidas a análise em espectrômetro de massas a fim de confirmar as
identidades das subunidades do proteassoma 20S e identificar as proteínas co-eluídas
com o proteassoma. Os resultados da análise são demonstrados no tópico 5.1.5.
5.1.4. Ensaio de atividade específica do proteassoma 20S
Ao final da purificação, as frações obtidas em cada etapa foram dialisadas em
Tampão 20S para que pudessem ser dosadas utilizando kit BCA Protein Assay (Pierce) e
realizados ensaios de atividade peptidásica quimotripsina símile a fim de avaliar a
atividade específica obtida em cada fração. Na Tabela 3 podemos observar a dosagem e
quantidade total de proteínas ao longo da purificação, bem como o fold obtido de forma
satisfatória. As etapas de purificação utilizadas forneceram um rendimento final de
cerca de 1,07%, uma vez que proporcionaram proteassoma 20S com alto grau de
enriquecimento.
Tabela 3: Rendimento Proteassoma 20S ao longo da purificação
Fração Concentração
(mg/mL)
Atividade
específica
Fold
purificação
Volume
(mL)
Proteína
total (mg)
Total 7 142843 1,0 40 280
(NH4)2SO4 40 – 70% 24,4 613930 4,3 4.5 109,8
Sephacryl 1 0,6 3443298 24,1 54 32,4
Hidroxiapatita 0,5 5140029 36,0 12 6
Sephacryl 2 0,3 6722003 47,1 10 3
Na Figura 15 são demonstradas as atividades quimotripsina símile específicas
obtidas ao longo da purificação. Como pode ser notado, a atividade quimotripsina símile
proteassomal foi aumentada ao final de cada etapa de purificação, demonstrando o
enriquecimento do mesmo, uma vez que são removidas outras proteínas do extrato.
Carmo, S.G. Resultados
46
Figura 15: Atividade quimotripsina símile específica ao longo da purificação do proteassoma 20S.
UAF/mg x 60 minutos: unidade arbitrária de fluorescência/ mg de proteína em 60 minutos. Média +/- erro
padrão.
5.1.5. Identificação de proteínas por espectrometria de massas
Para confirmação das identidades das subunidades constituintes do proteassoma,
bem como identificação das proteínas de alta massa apresentadas no perfil eletroforético
(Figura 14), foi realizada digestão em solução das amostras conforme descrito no item
4.1.7. A caracterização foi feita por meio de espectrômetro de massas (Thermo
Scientific) em gradiente de 80 minutos. Os dados obtidos através dos espectros foram
analisados utilizando o software Proteome Discoverer (versão 1.4, Thermo Scientific) e
banco de dados de Mus musculus.
Avaliando a contagem total de íons na Figura 16, é possível observar uma
distribuição uniforme dos peptídeos ao longo do gradiente de Acetonitrila, o que
possibilitou uma identificação mais efetiva, devida a redução de peptídeos co-eluídos.
Tal fato é comprovado pelo perfil a 214 nm, onde percebe-se a definição dos picos.
Carmo, S.G. Resultados
47
Todas as proteínas identificadas apresentaram homologia com Mus musculus e estão
dispostas nas Tabelas 4 e 5.
Carmo, S.G. Resultados
48
Figura 16: Dados obtidos durante a eluição em espectrômetro de massas dos peptídeos gerados pela digestão das frações contendo atividade quimitripsina
símile do proteassoma 20S e proteínas ligadas. A) Cromatograma a 214 nm; B) Contagem total de íons.
Carmo, S.G. Resultados
49
Tabela 4: Identificação de subunidades constituintes do proteassoma 20S
Nº Acesso Anotação Mr (kDa) % Cobertura Peptídeos únicos *[M+H]+(Da) Carga **ΔM (ppm)
Q9Z2U1 Proteasome subunit alpha type-5 26.4 17.01
AIGSASEGAQSSLQEVYHK 1961.94211 +3 -7.27
LFQVEYAIEAIK 1423.78069 +2 -1.77
GVNTFSPEGR 1063.51482 +2 -1.82
P99026 Proteasome subunit beta type-4 29.1 13.26
FDGGVVIAADMLGSYGSLAR 1998.98979 +2 -2.8
EVLEKQPVLSQTEAR 1726.93657 +2 1.79
QPVLSQTEAR 1128.59966 +2 -1.02
Q9Z2U0 Proteasome subunit alpha type-7 27.8 11.69 LTVEDPVTVEYITR 1634.85588 +2 -4.75
NYTDDAIETDDLTIK 1726.79595 +2 -3.71
Q9QUM9 Proteasome subunit alpha type-6 27.4 10.98 ILTEAEIDAHLVALAERD 1979.03899 +2 -2.79
LYQVEYAFK 1160.58904 +2 -8.29
O70435 Proteasome subunit alpha type-3 28.4 10.20 AVENSSTAIGIR 1217.64446 +2 -3.32
SLADIAREEASNFR 1578.77263 +2 -9.19
Q9R1P1 Proteasome subunit beta type-3 22.9 8.78 LYIGLAGLATDVQTVAQR 1889.04119 +2 -4.23
O09061 Proteasome subunit beta type-1 26.4 7.50 DVFISAAERDVYTGDALR 1997.98734 +3 -2.73
P49722 Proteasome subunit alpha type-2 25.9 5.98 GYSFSLTTFSPSGK 1478.70867 +2 -5.12
O55234 Proteasome subunit beta type-5 28.5 5.30 ATAGAYIASQTVK 1280.68059 +2 -3.09
ATAGAYIASQTVKK 1408.78008 +2 0.40
P70195 Proteasome subunit beta type-7 29.9 5.05 ATEGMVVADKNcSK 1509.70195 +2 -1.14
Q9R1P3 Proteasome subunit beta type-2 22.9 3.98 RNLADcLR 1017.52526 +2 -0.61
Q60692 Proteasome subunit beta type-6 25.4 3.78 DGSSGGVIR 847.42558 +2 -1.52
Carmo, S.G. Resultados
50
Tabela 5: Identificação de proteínas co-eluídas com o proteassoma 20S
Nº Acesso Anotação Mr (kDa) % Cobertura Peptídeos únicos *MH+(Da) Carga **ΔM
(ppm) P01942 Hemoglobin subunit alpha 15.1 10.56 IGGHGAEYGAEALER 1529.73186 +2 -1.64
P15105 Glutamine synthetase 42.1 8.58 VQAMYIWVDGTGEGLR 1794.87175 +2 -7.06
TcLLNETGDEPFQYKN 1928.87029 +2 0.39
P02088 Hemoglobin subunit beta-1 15.8 8.16 VVAGVATALAHK 1136.68144 +2 2.43
Q9EPL4 Methyltransferase-like protein 9 36.4 6.60 SLYVNmTSGPGGPAAAAGGGK 1878.91033 +2 4.67
O09173 Homogentisate 1,2-dioxygenase 49.9 6.52 SLRPGVAIADFVIFPPR 1855.05210 +3 -3.71
DFLIPVAWYEDR 1523.75127 +2 -1.12
P21107-2 Isoform 2 of Tropomyosin alpha-3 chain 29.0 6.05 SLYVNmTSGPGGPAAAAGGGK 1770.89971 +2 4.67
P00329 Alcohol dehydrogenase 1 39.7 4.27 KFPLDPLITHVLPFEK 1894.07682 +3 -3.67
O35490 Betaine--homocysteine S-methyltransferase 1 45.0 3.93 iSVmGGEQAATVLATVAR 1861.94768 +2 2.25
Q3ULD5 Methylcrotonoyl-CoA carboxylase beta chain 61.3 3.20 SLYVNmTSGPGGPAAAAGGGK 1831.96245 +2 4.67
Q8C985 Neurexin-3-beta 62.3 3.17 QLTIFNTQAQIAIGGKDK 1946.06548 +2 -2.65
Q8BWT1 3-ketoacyl-CoA thiolase 41.8 2.52 ITAHLVHELR 1188.68022 +2 -3.86
Q9CPY7-2 Isoform 2 of Cytosol aminopeptidase 52.7 2.46 TIQVDNTDAEGR 1318.62309 +3 -0.24
Q9D5D8 Chromodomain Y-like protein 2 56.1 1.79 QAGASKLLR 943.56798 +2 -0.44
Q6V3W6 Coiled-coil domain-containing protein lobo
homolog 103.2 1.26 LSQSSVESNPR 1203.60771 +2 9.36
P11499 Heat shock protein HSP 90-beta 83.2 1.24 YIDQEELNK 1151.55412 +2 -3.31
Q80SU7 Interferon-induced very large GTPase 1 280.6 0.58 eKAQTVMALLEEYK 1694.87638 +3 5.52
* MH+: massa do íon; ** ΔM: diferença entre a massa real e a massa encontrada.
Carmo, S.G. Resultados
51
Na Tabela 4 foram identificadas as subunidades do proteassoma 20S, presente
em ambas as amostras, enquanto na Tabela 5, são demonstradas as identidades das
proteínas co-eluídas com o mesmo, como por exemplo a HSP90, conhecida por ser uma
proteína ligante do proteassoma, bem como outras proteínas de alta massa molecular, o
que corrobora com as bandas proteicas presentes no perfil obtido na Figura 14 (B).
Abaixo, na Figura 17 pode ser observado o espectro de fragmentação obtido
durante a análise em espectrômetro de massas, referente ao peptídeo m/z = 712,39 de
carga +2 da subunidade a subunidade α5 do proteassoma 20S. Por meio do espectro de
massas do peptídeo de sequência LFQVEYAIEAIK, da subunidade α5 do proteassoma
20S, observa-se que foram identificados tanto resíduos que formam a série y quanto a
série b. No total, a análise demonstrou 17% de cobertura para a subunidade α5 do
proteassoma 20S.
Carmo, S.G. Resultados
52
Figura 17: Espectro de fragmentação do peptídeo m/z: 712.39 da subunidade α5 do proteassoma 20S. Carga: +2Da, MH+: 1423,78 Da, RT: 36,84 min, sendo
M/Z: massa/carga, MH+: massa do íon e RT: tempo de retenção.
y₉⁺
1035.56860
y₁₀²⁺-H₂O, y₅⁺
573.36749
b₁₀²⁺-NH₃
574.24622
y₆⁺
644.39642
y₈⁺
936.49847
y₇⁺
807.46027
y₆²⁺-NH₃, y₃⁺-NH₃
314.17001
y₈²⁺-NH₃, y₄⁺
460.27551
b₂⁺
261.15875
y₁⁺
147.11209
200 400 600 800 1000 1200 1400
m/z
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Inte
nsity [co
un
ts] (1
0^6
)
Pre+H, Precursor, Precursor-H₂O, Precursor-H₂O-NH₃, Precursor-NH₃, Pre-H y, y-H₂O, y-NH₃
b, b-H₂O, b-NH₃
Extracted from: C:\Users\Administrator\Documents\RAW data & Search Results\Simone\26092014\proteassoma+bandas_altas.raw #10022 RT: 36.84 FTMS, [email protected], z=+2, Mono m/z=712.39398 Da, MH+=1423.78069 Da, Match Tol.=0.1 Da
Carmo, S.G. Resultados
53
5.2. Ensaios de modulação da atividade do proteassoma 20S a partir dos peptídeos
análogos ao PR-11
Obtido o proteassoma purificado, o mesmo foi submetido a ensaios de atividade
junto ao PR-11 e análogos a fim de avaliar o potencial de modulação dos peptídeos nas
diversas concentrações estabelecidas. Para isso, o proteassoma foi incubado junto aos
peptídeos em diferentes concentrações durante 15 minutos a temperatura de 37°C, e em
seguida, foram adicionados o substrato específico para avaliação da atividade
peptidásica conforme item 4.1.3. Para este ensaio, foram realizadas triplicatas e a leitura
foi realizada após 1 hora de reação. O efeito dos peptídeos sobre a atividade residual do
proteassoma 20S pode ser observado na Figura 18.
Carmo, S.G. Resultados
54
Figura 18: Atividade quimotripsina símile residual do proteassoma 20S frente à atividade inibitória
de PR-11 e peptídeos análogos. A) Os peptídeos foram avaliados nas diversas concentrações
estabelecidas inicialmente; B) Os peptídeos PR-11, F12 e G9F12 foram avaliados em baixas
concentrações. As linhas em vermelho demonstram o IC50 do F12 comparado ao PR-11
Os peptídeos F12 e G9F12 apresentaram maior efeito inibitório que o PR-11
demonstrado em A, dessa forma, optou-se por avaliar estes peptídeos em concentrações
menores, como mostrado em B. Assim, pode ser notada em B, a maior capacidade
inibitória do F12 quando comparado ao PR-11, uma vez que o IC50 demonstrado pelas
Carmo, S.G. Resultados
55
linhas vermelhas, isto é, a quantidade de peptídeos necessários para inibir 50% da
atividade do complexo, foi menor em F12 quando comparado ao PR-11. As diferenças
significativas foram apresentadas nas concentrações de 0,25 e 0,125 µM que inibiram
70 e 53% da atividade respectivamente, enquanto o PR-11 inibiu cerca de 50% da
atividade na concentração de 0,25 µM e 25% na concentração 0,125 µM (p<0,05). Para
as demais concentrações e peptídeos avaliados, não houve diferença significativa
quando comparados às taxas de inibição causada pelo PR-11, o que mostra, que tais
estruturas análogas, possuem potencial inibitório tão eficaz quanto ao PR-11.
5.3. Ensaios de modulação da atividade do proteassoma 20S a partir de peptídeos
gerados por tripsinólise de proteínas séricas
Para obtenção de uma diversidade de peptídeos a serem avaliados, utilizamos
uma abordagem alternativa para geração de peptídeos potenciais ligantes de
proteassoma 20S, por meio da tripsinólise de proteínas séricas, uma vez que a
complexidade de proteínas presentes no plasma é considerável. Inicialmente, para
garantir a homogeneidade de proteínas a serem digeridas, as mesmas foram submetidas
a biblioteca combinatorial (ProteoMiner™ Protein Enrichment Kit - BioRad). Ao final
do processo, alíquotas das amostras iniciais e eluídas foram aplicadas em gel SDS-
PAGE 12% e corado em Coomassie Coloidal G-250. A técnica permitiu a depleção de
moléculas abundante e enriquecimento daquelas presentes em menor concentração,
como pode ser observado na Figura 19.
Carmo, S.G. Resultados
56
Figura 19: Perfil eletroforético comparativo para avaliação da capacidade do Proteominer® na
depleção de proteínas séricas. A) Fração inicial; B) Fração após depleção, onde nota-se a diminuição de
abundância de albumina sérica ( ~66 kDa) na fração; C) Fração não ligada.
Por meio da técnica, foi possível observar a depleção de grande parte da
albumina sérica da amostra eluída, o que gerou a obtenção de amostra com maior
homogeneidade em sua constituição. Dessa forma, a fração eluída (B), foi submetida a
eletroforese em SDS-PAGE 10% durante cerca de 10 minutos para realização de
digestão em gel. Seguinte a digestão das proteínas, os peptídeos resultantes foram
avaliados em espectrômetro de massas, onde detectou-se 426 peptídeos. Foi realizada a
avaliação do potencial de modulação destes peptídeos a partir de concentração 5 vezes
maior que aquela utilizada para o MG-132, ou seja, 50 µM e em concentração menor
que o MG-132, de 6,25 µM. Assim como o PR-11 e análogos, o proteassoma 20S
purificado foi incubado junto aos peptídeos, durante 15 minutos a 37°C, e em seguida,
Carmo, S.G. Resultados
57
foi adicionado o substrato específico para quimotripsina. Foram realizadas leituras a
cada 30 minutos, e as atividades obtidas de acordo com o tempo podem ser observadas
na Figura 20.
Figura 20: Atividade quimotripsina simile do proteasssoma 20S murino na presença de peptídeos
séricos totais (PST) e MG-132. A) Atividades quimotripsina símile na presença de peptídeos; B)
Atividade residual do proteassoma 20S na utilização dos peptídeos trípticos. Média +/- erro padrão.
Carmo, S.G. Resultados
58
Em A foram avaliadas as atividades quimotripsina símile na presença de
peptídeos em concentrações estabelecidas, onde pode ser observado efeito inibitório,
enquanto em B, é demonstrada a atividade residual do proteassoma 20S na utilização
dos peptídeos trípticos. Ao observar o resultado obtido, percebe-se uma inibição dose-
dependente nas concentrações avaliadas. A ação inibitória com diferença significativa
se deu na concentração de 50 µM a partir de 120 minutos de hidrólise do peptídeo
fluorogênico (p<0,05).
5.3.1. Ensaios de ligação peptídeos trípticos e proteassoma 20S
Verificada a modulação por parte dos peptídeos, foram realizados ensaios de
ligação dos peptídeos e proteassoma 20S. Dessa forma, os peptídeos foram incubados
junto ao proteassoma 20S e posteriormente, os peptídeos não ligados foram removidos
com sucessivas lavagens. Após a remoção, foi realizada alteração de pH do meio com o
uso de tampão Glicina pH 3,0, de modo a possibilitar o rompimento das interações entre
os peptídeos e o proteassoma, ocasionando assim, a recuperação dos peptídeos para
análise. Dessa forma, tanto os peptídeos ligantes e não ligantes obtidos ao final do
ensaio, foram purificados em C-18 e submetidos a espectrometria de massas, os dados
obtidos podem ser observados nas figuras 21 e 22. Os resultados apresentados não
possibilitaram a demonstração de quantidades detectáveis de peptídeos ligados ao
proteassoma 20S. Por outro lado, a presença de polímeros observada na região
compreendida entre m/z 200 a 700, provavelmente oriundos dos filtros utilizados para
recuperação dos peptídeos ligantes, pode ter ocasionado supressão significativa de íons
dificultando a detecção de possíveis peptídeos trípticos moduladores da atividade
quimotripsina símile do proteassoma 20S.
Carmo, S.G. Resultados
59
Figura 21: Contagem de íons e cromatogramas obtidos nos ensaios de ligação de peptídeos trípticos ao proteassoma 20S. A contagem de íons obtida durante
a análise dos peptídeos não ligantes (A) e de peptídeos ligantes de proteassoma (B). Em C e D, podem ser observadas as leituras em 214 nm dos peptídeos não
ligantes e ligantes respectivamente.
Carmo, S.G. Resultados
60
Figura 22: Espectro de peptídeos não ligantes (A) e ligantes de proteassoma 20S (B).
6. Discussão
Carmo, S.G. Discussão
61
6. Discussão
Dada a importância do proteassoma como constituinte da via de degradação
envolvida em diversos processos celulares, o entendimento de seu funcionamento,
regulação, bem como a descoberta de alvos inibidores, são de grande relevância para
que novos alvos terapêuticos possam vir a serem desenvolvidos (KISSELEV et al.,
2012; RUSCHAK et al., 2011). Neste sentido, nosso trabalho objetivou a purificação
do proteassoma 20S para avaliação do potencial modulatório de moléculas análogas ao
inibidor PR-11, bem como a prospecção de novas moléculas inibitórias obtidas por
tripsinólise sérica.
A primeira abordagem consistiu na purificação do proteassoma 20S, iniciada a
partir de extrato proteico obtido do homogenato de fígado de camundongo Balb/c,
submetido a três etapas cromatográficas, as quais foram baseadas em estudos prévios
(BREGUEZ, 2012; CASTRO-BORGES et al., 2007). A etapa inicial consistiu do
fracionamento do homogenato em coluna de filtração molecular. O princípio desta
técnica baseia-se na separação de moléculas de acordo com a massa molecular. As
frações enriquecidas com o proteassoma 20S foram identificadas com base em ensaio de
atividade quimotripsina símile monitorado na presença de MG-132 e ativação por SDS.
Agentes caotrópicos como SDS, provavelmente ocasionam o rompimento de
interações entre as várias proteínas ligantes do proteassoma, e/ou por meio da
desnaturação de extremidades das subunidades α do proteassoma 20S (COUX et al.,
1996). Em ambos os casos, o SDS atua facilitando o acesso e a difusão do substrato alvo
ao centro catalítico do proteassoma 20S, aumentando consequentemente, as taxas de
hidrólise da protease (SHIBATANI; WARD, 1995). A fim de utilizar um padrão de
comparação inibitório para o ensaio, foi utilizado o MG-132, inibidor de proteassoma
frequentemente escolhido em estudos devido ao fato de ser potente e de baixo custo.
Este age inicialmente no sítio com atividade quimotripsina símile, mas em altas
concentrações, exerce também efeito inibidor sobre o sítio caspase-símile. Como pode
ser observado na Figura 11, foi obtida inibição da atividade quimotripsina símile ao
longo de todas as frações avaliadas, o que se deve a presença do grupo funcional aldeído
do MG-132, que é altamente reativo e possui elevada afinidade por diversas proteases,
exercendo efeito inibitório sobre estas (GOLDBERG, 2012). Porém, ao avaliar em
Carmo, S.G. Discussão
62
conjunto as três condições utilizadas, isto é, a atividade quimotripsina símile na
presença de SDS 0,02% que seria ativada, na presença de MG-132 10 µM que seria
inibida e a condição controle, observou-se que entre as frações 26 e 34, ocorreu a
inibição de cerca de 96% da atividade pelo MG-132, e o aumento da mesma pelo SDS
0,02% quando comparadas a condição controle. Tais resultados indicam claramente a
presença de atividade quimotripsina símile do proteassoma na faixa de frações citada.
O intervalo das frações compreendidas na faixa de 26 a 34 obtidas na
cromatografia por exclusão molecular foi então submetido ao segundo método de
purificação que consistiu no uso da coluna de Hidroxiapatita. A resina utilizada nesta
etapa possui grande capacidade de adsorção de proteínas, e os grupos funcionais
distribuídos regularmente pela matriz são constituídos de íons cálcio carregados
positivamente e grupos fosfatos carregados negativamente (BIO-RAD, 2007). Dessa
forma, a resina é capaz de isolar tanto por afinidade de ligação ao cálcio, quanto por
meio de troca catiônica quando a interação se dá pelo grupo fosfato. O cálcio possui
afinidade pelos grupos carboxila das proteínas e repele os grupos amino, enquanto a
troca catiônica ocorre quando estes grupamentos amino de proteínas interagem
ionicamente com os fosfatos, ao mesmo tempo em que repelem os grupos carboxilas,
por sua vez, a interação grupamento amino-fosfato é interrompida com a adição de sais
neutros (CUMMINGS; SNYDER; BRISACK, 2009). Como o proteassoma é uma
proteína de caráter ácido e ainda apresenta subunidades capazes de serem modificadas
por fosforilação (DREWS, 2007) o mecanismo de ligação de proteassomas a essa
coluna provavelmente ocorre a partir de interação por afinidade aos íons cálcio. Dessa
forma, são diversos os trabalhos que utilizaram a Hidroxiapatita durante o processo de
purificação de proteassomas de diferentes organismos (BECK et al., 2014; CASTRO-
BORGES et al., 2007; FRANZETTI et al., 2002; KANAYAMA et al., 1992;
MINAMI et al., 2000; NAGY et al., 1998; SAVULESCU et al., 2011).
As frações obtidas ao longo da eluição em Hidroxiapatita foram analisadas por
SDS-PAGE a fim de identificar as frações contendo proteassoma 20S e avaliar o grau
de enriquecimento obtido até o momento. O perfil obtido após coloração com prata,
permitiu a visualização das bandas proteicas condizentes com a massa molecular das
subunidades constituintes do proteassoma (Figura 13). Trabalhos que utilizaram
diferentes organismos como Schistosoma mansoni (CASTRO-BORGES et al., 2007) e
Carmo, S.G. Discussão
63
Xenopus (SAVULESCU et al., 2011) tendo a Hidroxiapatita como método de
enriquecimento do proteassoma 20S, apresentaram perfis de bandas proteicas
condizentes com o perfil obtido neste trabalho.
Com o intuito de obter uma fração mais homogênea de proteassomas 20S optou-
se por realizar uma recromatografia em exclusão molecular. Ao final da purificação,
ensaios de atividade quimotripsina símile das frações contendo proteassoma 20S foram
realizados para determinação de atividade específica e grau de enriquecimento obtido
em cada etapa. A recromatografia por exclusão molecular foi satisfatória, uma vez que
se obteve aumento da atividade específica após este procedimento. Além disso, foram
obtidos dois perfis distintos de proteassoma 20S, um diferindo do outro pela presença de
bandas proteicas de alta massa molecular no perfil eletroforético 1D (Figura 14).
Considerando que estas proteínas se mantiveram presentes até o momento final da
purificação, uma hipótese levantada durante o estudo, seria a possível interação destas
moléculas e sua relação como moduladoras alostéricas do proteassoma. Assim como as
modificações pós traducionais e complexos moduladores, diversas proteínas associam-
se ao proteassoma a fim de regular sua atividade (WANG; HUANG, 2008). Tais
proteínas podem influenciar no processo de reconhecimento de substratos
poliubiquitinados, desubiquitinação e desnaturação de substratos alvos (SCRUGGS et
al., 2012). Dessa forma, utilizou-se de espectrometria de massas para identificação das
proteínas presentes na amostra.
Durante a eluição dos peptídeos gerados pela digestão das frações contendo
atividade quimitripsina símile do proteassoma 20S em espectrômetro de massas, obteve-
se uma distribuição uniforme dos peptídeos ao longo do gradiente, o que possibilitou
uma identificação mais eficaz. A identificação de íons de série y e b, cujos fragmentos
são referentes ao rompimento de ligações peptídicas, é um importante dado, uma vez
que a confirmação destes íons se dá por complementariedade. Todas as proteínas
identificadas (Tabelas 4 e 5) apresentaram homologia com aquelas presentes em banco
de dados de Mus musculus, o qual foi utilizado para busca.
Dentre as identificações, obteve-se a presença de HSPs (Heat shock proteins),
proteínas estas, já conhecidas por se ligarem ao proteassoma exercendo efeito
modulatório sob sua atividade proteolítica (BOZAYKUT; OZER; KARADEMIR, 2014;
LANNEAU et al., 2010). As HSPs são chaperonas moleculares, encontradas em todas
Carmo, S.G. Discussão
64
as células e classificadas normalmente de acordo com a massa molecular. São
consideradas fatores de estresse e são rapidamente induzidas em resposta a fatores
diversos como aumento de temperatura, drogas citotóxicas, irradiação UV e
metabolismo celular. Possuem ainda importante papel na conformação e maturação de
vários fatores de transcrição e proteínas. No caso das HSP 70 e HSP 90, quando ocorre
a presença de uma proteína mal enovelada ou com perda da função, estas são
responsáveis por determinar se as mesmas serão reparadas ou degradadas pelo sistema
ubiquitina proteassoma. Dessa forma, quando o re-enovelamento não é mais possível, os
substratos são direcionados para a degradação, contudo, frente a inibição da atividade
proteassomal, um aumento na expressão das HSPs é ocasionado, uma vez que há
necessidade na prevenção do acúmulo de agregados proteicos e proteínas danificadas
(BOZAYKUT et al., 2014). Assim, a associação direta ou indireta dessas HSPs com o
proteassoma para garantir o controle de qualidade das proteínas é importante
mecanismo celular (LANNEAU et al., 2010). Em diversos trabalhos que objetivaram a
purificação do proteassoma 20S utilizando-se de exclusão molecular, foram encontradas
HSPs co-eluídas junto ao complexo (BOUSQUET-DUBOUCH et al., 2009; CASTRO-
BORGES et al., 2007; KAUTTO et al., 2009; MONTEL et al., 1999).
Dentre as demais proteínas co-eluídas com o proteassoma, foram identificadas
proteínas alvos de degradação pela via proteassomal, como a subunidade α da
Hemoglobina, Glutamina Sintetase, Tropomiosina, Enzima Alcool Desidrogenase
(ADH), Betaína-homocisteína S-metil Transferase e 3-Cetoacil-CoA Tiolase.
KAUTTO et al. (2009), realizaram a purificação de proteassomas 26S de Trichoderma
resei por meio de cromatografias de troca iônica e exclusão molecular e identificou por
espectrometria de massas, proteínas co-eluídas como a Actina, Fatores de Iniciação α3 e
α4, Fatores de Elongação γ1 e HSPs. BOUSQUET-DUBOUCH et al. (2009),
demonstraram por espectrometria de massas 322 proteínas associadas ao proteassoma
de camundongos que recebiam álcool cronicamente, enquanto nos animais controles,
foram encontradas 495. Dentre elas, a Carbamoil Fosfato Sintetase, Tubulinas, Fatores
de Elongação, Miosina, Citocromo P450, HSPs, Tropomiosina, entre outras. No
presente trabalho para a maioria das proteínas identificadas, não há relatos na literatura
de possíveis interações com o proteassoma. Entretanto, não se descarta a possibilidade
Carmo, S.G. Discussão
65
dessas moléculas representarem novos ligantes do proteassoma 20S, com possível
capacidade moduladora de atividade.
A inibição do proteassoma tem sido considerada ferramenta promissora na
biologia celular em estudos que visam elucidar as funções celulares diversas. Vale
ressaltar a busca para o desenvolvimento de peptídeos inibidores como agentes
antitumorais após o emprego do Bortezomib para o tratamento do mieloma múltiplo.
Atendendo a um dos objetivos específicos do trabalho, avaliou-se a capacidade
inibitória de análogos do peptídeo PR-11. Esse peptídeo liga-se a subunidade α7,
alterando a conformação do proteassoma, e consequentemente, inibindo sua atividade e
modificando dessa forma a expressão de fatores da via do NFκβ, o que faz com que
lesões sejam reduzidas em estados inflamatórios (ANBANANDAM et al., 2008).
Em estudos que utilizaram PR-39 e sequências parciais do PR-11, como o PR-8
e PR-5, a fim de definir a região envolvida na interação com o proteassoma foi
observado grande efeito inibitório por parte dos peptídeos PR-39 e PR-11, ao contrário
dos peptídeos menores, que exerceram pouco efeito, presumindo-se que estes atuaram
como substratos do proteassoma. Além disso, foi observado que análogos com
modificações na região N-terminal, não exerceram atividade inibitória sobre o
proteassoma 20S (GACZYNSKA et al., 2003). Sabendo da sequência responsável pela
modulação da atividade proteassomal, tornou-se de interesse a busca por estruturas
análogas que pudessem interferir com a mesma em proporções diversas para uso de
acordo com o interesse e necessidade.
Em trabalho prévio realizado pelo grupo de pesquisa (BREGUEZ, 2012), foram
sintetizados diversos peptídeos análogos ao PR-11, os quais sofreram modificações em
sua região C-terminal, uma vez, que a região N-terminal é a de maior influência sobre a
atividade proteolítica do proteassoma (ANBANANDAM et al., 2008). Dando
continuidade a investigação sobre os análogos em diferentes concentrações, foram
selecionados três peptídeos os quais foram empregados no estudo. A escolha dos
análogos foi baseada na semelhança estrutural entre ambos, uma vez que nestes três
peptídeos, as modificações consistiam na introdução de um resíduo de Fenilalanina (F)
ao final da cadeia, sendo que em dois deles, G9F12 e I9F12, foram realizadas
substituições de um resíduo de Leucina por Glicina (G) e Isoleucina (I) respectivamente
na posição 9. Ambos os peptídeos obtiveram um grau de pureza satisfatório ao final da
Carmo, S.G. Discussão
66
síntese e tiveram suas identidades confirmadas por espectrometria de massas. Estes
peptídeos foram analisados previamente quanto à capacidade inibitória na concentração
de 1 µM frente à atividade quimotripsina símile de preparações enriquecidas de
proteassoma 20S humano, murino e de vermes adultos de Schistosoma mansoni. As
capacidades inibitórias de todos os peptídeos foram similares à do PR-11 e não
apresentaram diferenças significativas (BREGUEZ, 2012).
Ao avaliar o potencial inibitório nas diferentes concentrações estabelecidas
(Figura 18), observa-se que as taxas de inibição dos peptídeos modificados são
semelhantes às obtidas para o peptídeo PR-11, exceto pelo fato de os peptídeos F12 e
G9F12 apresentarem um potencial inibitório maior que o PR-11. Esse resultado motivou
novos testes de cinética de inibição para F12 e G9F12 em concentrações menores.
Nessa segunda análise, notou-se que o F12 apresentou menor IC50 que o PR-11, o que
se refere que a quantidade de F12 necessária para inibir 50% da atividade proteassomal
é menor que a quantidade de PR-11 necessária, sendo assim, a capacidade de inibição
do F12 foi maior que a capacidade do PR-11, apresentado diferenças significativas nas
concentrações de 0,25 e 0,125 µM (p<0,05). Para os demais, não houve diferenças
significativas, o que mostra que tais análogos possuem potencial inibitório semelhante
ao PR-11.
Na literatura, são descritos análogos do PR-11 como G9 (RRRPRPPYGPR),
W12 (RRRPRPPYLPRW) e F8W12 (RRRPRPPFLPRW), os quais representam
moléculas de maior capacidade inibitória quando comparada ao PR-11. Tais estruturas
consistiram em modificações sutis, onde foram mantidas as regiões identificadas como
requisito para inibição do proteassoma por meio da interação com a subunidade α7, ou
seja, foram mantidos pelo menos dois resíduos de arginina carregados positivamente na
região N-terminal e resíduos hidrofóbicos na região C-terminal. ANBANANDAM et al.
(2008) avaliaram ainda estruturas com modificações na região N-terminal de forma não
conservativa ao PR-11, onde observaram que não houve inibição da atividade
proteassomal, porém quando a modificação foi realizada de forma conservativa os
resultados foram satisfatórios. Outras modificações testadas, consistiram na substituição
de Tirosina na posição 8, a qual possui importantes características na conformação do
PR-11 devido a sua hidrofobicidade e presença de anel aromático. Este resíduo foi
Carmo, S.G. Discussão
67
substituído por Fenilalanina e Glutamina, onde ambos demonstraram aumento na
capacidade inibitória (ANBANANDAM et al., 2008; GAO et al., 2000).
Além dos análogos de PR-11 são encontrados na literatura, peptídeos ricos em
prolina, o que reforça a importância do estudo de moléculas análogas de inibidores, uma
vez que apresentam como domínio ativo a região rica em prolina. As estruturas análogas
ao PR-11 assemelham-se a estrutura do inibidor endógeno PI 31, devido a presença de
prolinas na porção C-terminal. Este age como inibidor seletivo do proteassoma
impedindo a ligação do complexo heptamérico PA28 αβ ao centro catalítico, também
por meio da interação com subunidades α do proteassoma. No caso do PI 31, foi
demostrado por meio de modificações, que a porção rica em prolina presente na região
C-terminal, define a atividade da molécula (MCCUTCHEN-MALONEY et al., 2000).
Estes trabalhos mostram a relevância na busca de estruturas análogas, com pequenas
modificações em sua cadeia, uma vez que estas podem vir a apresentar potenciais de
inibição e regulação distintos.
Outra estratégia utilizada para a prospecção de novas moléculas inibidoras
consistiu na busca de peptídeos trípticos com capacidade de modulação da atividade
proteassomal. A maioria dos inibidores de proteassoma consiste de peptídeos curtos
modificados com grupo eletrofílico, que interagem com o C-terminal de resíduos
treonina catalíticos dessa protease. Como exposto anteriormente, os peptídeos inibidores
de proteassoma distinguem-se em diversas classes, sendo os mais comumente utilizados
os peptídeos aldeídicos, boronatos e epoxicetonas (DOWNEY et al., 2015;
GOLDBERG, 2012).
A fim de se obter uma variedade de peptídeos a serem testados frente a atividade
do proteassoma, utilizamos a tripsinólise de proteínas de soro fetal bovino, com base na
complexidade proteica que estaria disponível para originar diversidade estrutural de
peptídeos. Além disso, a digestão por meio de tripsina possibilitou a obtenção de
peptídeos com tamanho médio similar aos inibidores de proteassoma já conhecidos.
Entretanto, ao se utilizar o soro como fonte de proteínas, uma maior concentração de
peptídeos provenientes de proteínas presentes em maior abundância seriam gerados, o
que poderia dificultar possíveis interações de peptídeos presentes em baixos níveis com
o proteassoma 20S. Com o intuito de garantir homogeneidade de proteínas presentes na
Carmo, S.G. Discussão
68
amostra, optou-se pela utilização da técnica de depleção para uma melhor
representatividade do proteoma total sérico, anteriormente à etapa de tripsinólise.
A utilização de uma biblioteca combinatorial de hexapeptídeos propiciou com
que cada proteína sérica se ligasse a um hexapeptídeo específico até a saturação dos
sítios ligantes. Desse modo, as proteínas abundantes foram removidas, enquanto que as
proteínas de baixa abundância foram concentradas, possibilitando assim, um equilíbrio
entre a diversidade proteica contida na amostra. Nota-se que após a depleção, proteínas
abundantes do soro como albumina apresentaram níveis reduzidos enquanto outras de
menor massa molecular apareceram evidentes no gel 1D (Figura 19), o que demonstra a
eficácia da técnica, uma vez que foi obtido com a mesma, a depleção de algumas
proteínas e consequente enriquecimento de outras.
Após a depleção de proteínas abundantes e enriquecimento de proteínas com
menor massa, foram gerados os peptídeos trípticos e ensaios de atividade foram
realizados nas concentrações estabelecidas, seguindo protocolos descritos
anteriormente. A análise dos resultados obtidos (Figura 20), mostra que ocorreu inibição
da atividade quimotripsina símile do proteassoma 20S nas concentrações de 50 e 6,25
µM de peptídeos totais. Atividade inibitória com diferença significativa ocorreu a partir
de 120 minutos de hidrólise do peptídeo fluorogênico utilizando-se de peptídeos totais
na concentração de 50 µM (p<0,05). Acredita-se que efeitos diversos dose dependente
possam ocorrer, uma vez que peptídeos diferentes podem se ligar a sítios múltiplos no
proteassoma 20S.
Dentre várias classes de peptídeos estudados, são diversos os mecanismos de
ação e as concentrações com capacidade inibitória. O inibidor específico de
imunoproteassoma IPSI-001, por exemplo, se liga preferencialmente as subunidades
β1i. Essa molécula induziu acúmulo de conjugados ubiquitina-proteína, proteínas pró-
apoptóticas, ocasionando apoptose celular em modelos de cânceres hematológicos
(KUHN et al., 2009). Os peptídeos do tipo aldeídico realizam uma ligação lenta ao sítio
catalítico e além disso, a dissociação pode se dar de forma rápida por oxidações, o que
resulta em inibição de curta duração e possível resistência, porém sua vantagem, é o fato
de serem de fácil penetração celular. Já os peptídeos boronatos são mais potentes e
seletivos que os aldeídicos, e embora sejam reversíveis, o rompimento da ligação pode
levar horas e apresentam a vantagem de não serem inativados por oxidações e nem
Carmo, S.G. Discussão
69
serem transportados para fora das células (PELLOM; SHANKER, 2012). Derivados de
TMC-95, peptídeo cíclico de Apiospora montagne, é um inibidor potente da atividade
quimotripsína símile, que age de forma competitiva. As epoxicetonas são peptídeos que
possuem alta afinidade pelo proteassoma, em consequência à formação do derivado
morfolina durante o processo de inibição (KISSELEV; GOLDBERG, 2001).
A última análise consistiu na identificação de possíveis peptídeos ligantes ao
proteassoma, incubando-se o mesmo com os peptídeos trípticos obtidos por digestão de
amostra sérica depletada. Após a remoção dos peptídeos não ligantes por sucessivas
lavagens, realizou-se alteração de pH para a recuperação dos peptídeos com capacidade
de se ligar ao proteassoma 20S. Os peptídeos eluídos foram então submetidos à análise
por espectrometria de massas. Os resultados obtidos para essa análise não foram
conclusivos uma vez que os peptídeos trípticos ligantes do proteassoma 20S podem
estar presentes em baixíssimas concentrações. Mesmo considerando-se a alta
sensibilidade do analisador de massas utilizado, outros interferentes presentes na
preparação podem ainda ter dificultado a identificação dos peptídeos. Métodos
alternativos de ensaios de ligação ao proteassoma e recuperação dos ligantes serão
futuramente padronizados no laboratório.
7. Conclusões
Carmo, S.G. Conclusões
70
7. Conclusões
- A purificação do proteassoma 20S demonstrou a obtenção de duas subpopulações do
complexo com alta atividade quimotripsina símile;
- A análise por espectrometria de massas, possibilitou a confirmação do enriquecimento
a partir da identificação de subunidades α e β obtida do proteassoma 20S. A
identificação de proteínas de alta massa molecular eluídas junto ao mesmo corrobora
com o perfil apresentado por eletroforese;
- Os testes de inibição da atividade quimotripsina símile do proteassoma 20S,
confirmaram eficácia dos peptídeos análogos ao PR-11: I9F12, G9F12 e F12.
Particularmente, o análogo F12 apresentou maior capacidade inibitória que o PR-11.
Nossos resultados indicaram que mudanças sutis na estrutura de moléculas já
conhecidas podem melhorar o potencial inibitório e contribuir para a proposição de
moléculas a serem utilizadas em menor dose;
- A utilização da biblioteca combinatorial foi de grande importância, uma vez que
demonstrou depleção de proteínas séricas abundantes e contribui para obtenção de
maior diversidade dos peptídeos trípticos.
- Os peptídeos séricos totais gerados exerceram capacidade de modulação de atividade
quimotripsína símile do proteassoma 20S, e portanto podem representar novas
moléculas inibidoras deste complexo.
Carmo, S.G. Conclusões
71
8. Perspectivas
Carmo, S.G. Perspectivas
72
8. Perspectivas
Considerando os resultados e conclusões obtidos, pretende-se:
- Padronizar novos ensaios de ligação e recuperação de peptídeos trípticos ligantes do
proteasssoma 20S de modo a facilitar a identificação dos mesmos por espectrometria de
massas;
- Selecionar e sintetizar em larga escala os peptídeos trípticos identificados com
capacidade inibitória do proteassoma 20S;
- Realizar testes in vitro para determinação de permeabilidade celular dos peptídeos de
interesse.
9. Referências Bibliográficas
Carmo, S.G. Referências Bibliográficas
73
9. Referências Bibliográficas
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10. Apêndices
Carmo, S.G. Apêndices
83
10. Apêndices
10.1. Geração de peptídeos trípticos
Figura 23: SDS PAGE 10% para digestão em gel. A) Padrão de massa molecular; B) Fração
proteica.
Conforme descrito no item 4.3, 25 µg de proteínas foram submetidas a
eletroforese em gel SDS PAGE 10% durante o tempo necessário para que todas
proteínas penetrassem no gel. O acompanhamento da migração foi realizado por meio
da utilização de padrão de massa molecular pré-corado (Sigma). A seta em vermelho
aponta a banda referente a 100 kDa, a qual foi considerada para interrupção da
eletroforese. Em seguida, o gel foi corado com Coomassie Coloidal G-250 para
visualização das bandas a serem excisadas.
Carmo, S.G. Apêndices
84
10.2. Tabela Suplementar
Tabela Suplementar 1: Identificação de subunidades constituintes do proteassoma 20S
Nº Acesso % Cobertura Peptídeos únicos *MH+(Da) Carga **ΔM
(ppm) Mr (kDa) Score Proteínas Area Aas RT pI
Proteasome subunit alpha type-5
Q9Z2U1 17.01 AIGSASEGAQSSLQEVYHK 1961.94211 3 -7.27
26.4 9.03 1 704011917.5 241 18.6 4.79
LFQVEYAIEAIK 1423.78069 2 -1.77
GVNTFSPEGR 1063.51482 2 -1.82
Proteasome subunit beta type-4
P99026 13.26 FDGGVVIAADMLGSYGSLAR 1998.98979 2 -2.8
29.1 9.62 1 190371708.708333 264 42.7 5.64
EVLEKQPVLSQTEAR 1726.93657 2 1.79
QPVLSQTEAR 1128.59966 2 -1.02
Proteasome subunit alpha type-7
Q9Z2U0 11.69 LTVEDPVTVEYITR 1634.85588 2 -4.75 27.8 7.41 2 866880532 248 31.7 8.46
NYTDDAIETDDLTIK 1726.79595 2 -3.71
Proteasome subunit alpha type-6
Q9QUM9 10.98 ILTEAEIDAHLVALAERD 1979.03899 2 -2.79 27.4 6.65 1 93216037 246 36.8 6.76
LYQVEYAFK 1160.58904 2 -8.29
Proteasome subunit alpha type-3
O70435 10.2 AVENSSTAIGIR 1217.64446 2 -3.32 28.4 6.09 1 419496507.515625 255 15.4 5.44
SLADIAREEASNFR 1578.77263 2 -9.19
Proteasome subunit beta type-3
Q9R1P1 8.78 LYIGLAGLATDVQTVAQR 1889.04119 2 -4.23 22.9 7.02 1 444932789.5 205 40.1 6.55
Proteasome subunit beta type-1
O09061 7.5 DVFISAAERDVYTGDALR 1997.98734 3 -2.73 26.4 4.79 1 124827478 240 32.8 7.81
Proteasome subunit alpha type-2
P49722 5.98 GYSFSLTTFSPSGK 1478.70867 2 -5.12 25.9 3.12 1 473302745 234 32.7 7.43
Carmo, S.G. Apêndices
85
Nº Acesso % Cobertura Peptídeos únicos *MH+(Da) Carga **ΔM
(ppm) Mr (kDa) Score Proteínas Area Aas RT pI
Proteasome subunit beta type-5
O55234 5.3 ATAGAYIASQTVK 1280.68059 2 -3.09 28.5 6.62 1 198570016.9375 264 15.8 7.02
ATAGAYIASQTVKK 1408.78008 2 0.4
Proteasome subunit beta type-7
P70195 5.05 ATEGMVVADKNcSK 1509.70195 2 -1.14 29.9 2.32 1 12039216.109375 277 11.8 7.99
Proteasome subunit beta type-2
Q9R1P3 3.98 RNLADcLR 1017.52526 2 -0.61 22.9 2.76 1 244612558.5 201 13.8 7.02
Proteasome subunit beta type-6
Q60692 3.78 DGSSGGVIR 847.42558 2 -1.52 25.4 2.76 1 81313128.625 238 11.5 5.11
Carmo, S.G. Apêndices
86
Tabela Suplementar 2: Identificação de proteínas co-elúidas junto ao proteassoma 20S
Nº Acesso % Cobertura Peptídeos únicos *MH+(Da) Carga **ΔM
(ppm) Mr (kDa) Score Proteínas Area Aas RT pI Calc
Hemoglobin subunit alpha
P01942 10.56 IGGHGAEYGAEALER 1529.73186 2 -1.64 15.1 6,5 1 472381308.3 142 15,98 8,22
Glutamine synthetase
P15105 8.58 VQAMYIWVDGTGEGLR 1794.87175 2 -7.06 42.1 8,43 1 45272534.5 373 36,22 7,08
TcLLNETGDEPFQYKN 1928.87029 2 0.39
Hemoglobin subunit beta-1
P02088 8.16 VVAGVATALAHK 1136.68144 2 2.43 15.8 3,76 2 82178473.375 147 14,93 7,65
Methyltransferase-like protein 9
Q9EPL4 6.6 SLYVNmTSGPGGPAAAAGGGK 1878.91033 2 4.67 36.4 2,96 1 318 33,91 6,68
Homogentisate 1,2-dioxygenase
O09173 6.52 SLRPGVAIADFVIFPPR 1855.05210 3 -3.71 49.9 6.46 1 219073370.09375 445 39.1 7.24
DFLIPVAWYEDR 1523.75127 2 -1.12
Isoform 2 of Tropomyosin alpha-3 chain
P21107-2 6.05 SLYVNmTSGPGGPAAAAGGGK 1770.89971 2 4.67 29 2.57 1 11806769.875 248 14.9 4.78
Alcohol dehydrogenase 1
P00329 4.27 KFPLDPLITHVLPFEK 1894.07682 3 -3.67 39.7 3.16 1 80673502.5 375 37.7 8.1
Betaine--homocysteine S-methyltransferase 1
O35490 3.93 iSVmGGEQAATVLATVAR 1861.94768 2 2.25 45 3.25 1 80673502.5 407 45.9 7.89
Methylcrotonoyl-CoA carboxylase beta chain
Q3ULD5 3.2 SLYVNmTSGPGGPAAAAGGGK 1831.96245 2 4.67 61.3 2.97 1 563 36.4 8
Neurexin-3-beta
Q8C985 3.17 QLTIFNTQAQIAIGGKDK 1946.06548 2 -2.65 62.3 2.96 3 784657452 567 4.07 9.36
3-ketoacyl-CoA thiolase
Q8BWT1 2.52 ITAHLVHELR 1188.68022 2 -3.86 41.8 2.37 1 40320658.75 397 14.1 8.09
Isoform 2 of Cytosol aminopeptidase
Q9CPY7-2 2.46 TIQVDNTDAEGR 1318.62309 3 -0.24 52.7 3.38 2 60258815.84375 488 13.3 7.03
Carmo, S.G. Apêndices
87
Nº Acesso % Cobertura Peptídeos únicos *MH+(Da) Carga **ΔM
(ppm) Mr (kDa) Score Proteínas Area Aas RT pI
Chromodomain Y-like protein 2
Q9D5D8 1.79 QAGASKLLR 943.56798 2 -0.44 56.1 2.63 1 153732471.5 503 15.9 8.65
Coiled-coil domain-containing protein lobo homolog
Q6V3W6 1.26 LSQSSVESNPR 1203.60771 2 9.36 103.2 2.37 1 47966085.71875 876 14.8 5.38
Heat shock protein HSP 90-beta
P11499 1.24 YIDQEELNK 1151.55412 2 -3.31 83.2 2.35 2 132354930 724 14.2 5.03
Interferon-induced very large GTPase 1
Q80SU7 0.58 eKAQTVMALLEEYK 1694.87638 3 5.52 280.6 3.03 1 152881855 2427 16 6.57