UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO · Figura 2 Aspecto macroscópico de neoplasia mamária...

UNIVERSIDADE BANDEIRANTE ANHANGUERA

Programa de Pós-Graduação em Farmácia

RODRIGO CASEMIRO PINTO MONTEIRO

ESTUDO HISTOLÓGICO E EPIGENÉTICO DE TECIDOS NORMAIS E TUMORAIS DA GLÂNDULA MAMÁRIA CANINA

São Paulo 2013



São Paulo 2013

Dissertação apresentada para

defesa de Tese em Farmácia pelo

Programa de Pós-Graduação em

Farmácia da Universidade

Bandeirante Anhanguera.

Orientadora: Profa. Dra. Susana

Nogueira Diniz



São Paulo, 12 de abril de 2013.

Banca Examinadora

__________________________________________ Profa.Dra. Susana Nogueira Diniz

Orientadora

__________________________________________ Profa.Dra.Sílvia Regina Kleeb

Examinadora

___________________________________________ Prof.Dra. Márcia Regina Machado

Examinadora

Dissertação apresentada para

obtenção do título de Mestre em

Farmácia pelo Programa de Pós-

Graduação em Farmácia da

Universidade Bandeirante

Anhanguera.

Orientadora: Profa. Dra. Susana

Nogueira Diniz

AGRADECIMENTOS

À professora e orientadora Dra. Susana Nogueira Diniz pelo

enorme empenho e dedicação na elaboração deste trabalho e paciência em passar

seus ensinamentos.

Ao Prof. Dr. Paulo Pardi, por suas aulas que tanto nos ajudaram

no ponto de vista filosófico, e pelos conhecimentos passados.

A todos os professores colaboradores do Programa de Mestrado

em Farmácia da Universidade Bandeirante de São Paulo pela dedicação e carinho.

Aos colegas do Hospital Veterinário da Universidade

Bandeirante de São Paulo pela atenção e ajuda prestadas.

À professora Dra. Renata Afonso Sobral pelos seus

ensinamentos passados durante o período de graduação em Medicina Veterinária e

pela sua contribuição na participação no exame de qualificação.

Aos meus familiares pela atenção e paciência neste período de

elaboração da tese.

Aos meus colegas de mestrado pelo companheirismo e

solidariedade ao decorrer desta jornada.

Ao professor e amigo Marcelo Contieri pela ajuda e dedicação

na parte histopatológica.

A professora Sílvia Regina Kleeb pelos ensinamentos passado

no período da graduação e pelo aceite do convite para a defesa da tese.

Aos professores Luis Marques e Márcia Regina pelo

ensinamentos passados.

E a todos aqueles que contribuíram, de maneira direta ou

indireta para a elaboração deste trabalho.

RESUMO

As neoplasias mamárias em cadelas vêm ganhando grande destaque na casuística

da clínica veterinária, uma vez que os animais estão vivendo cada vez mais. A idade

de aparecimento dos tumores varia de 4 a 12 anos e está associado com fatores

hormonais e de envelhecimento, assim como no ser humano. O diagnóstico é

clínico, devendo ser realizados exames complementares para pesquisa de

metástases e o tratamento se baseia na remoção das mamas acometidas por

cirurgia e castração. O diagnóstico definitivo é obtido por exame histopatológico.

Neste trabalho foram realizados estudos histopatológicos e epigenéticos de

amostras tumorais e amostras de mamas livres de tumores. Na histopatologia além

da coloração padrão HE (hematoxilina-eosina),foram realizadas as técnicas de PAS

(ácido periódico de Shiff) e Tricômio de Masson, com o objetivo de avaliar a

presença de glicoproteínas e tecido conjuntivo nas amostras. A classificação das

amostras tumorais baseada na histopatologia demonstrou a prevalência de 100% de

carcinomas distribuídos em variados graus de malignidade. Foi comprovado

queexiste correlação estatística entre tumores malignose a presença de

glicoproteínas e açúcares no tecido estudado e escassez de tecido conjuntivo, mais

especificamente de fibras colágenas. Em relação ao estudoepigenético por MSAP-

PCR (Methilations Sensitive Arbitraly Primed- PCR), foi demonstradoalteração do

padrão de metilação de fragmentos gênicos provenientes de tecidos normais e

tumorais. Essa alteração pôde ser observada tanto por um padrão de metilação em

amostras tumorais e hipometilação em tecido normal (banda de 340pb). Ou pela

presença de fragmentos hipometilados em tumor e metilados em tecido normal

(banda de 600pb), que pode representar representar novas regiões do DNA tumoral

com padrão de hipometilação. Foram identificadas regiões genômicas que

apresentaram padrão de metilação alterado entre os subtipos tumorais. Foi mostrado

um fragmento de aproximadamente 400pb que se apresentou metilado emamostra

de tumor sólido e desmetilado nas demais amostras tumorais, do tipo tubular e

papilífero. Observou-se também uma banda de 390 pb que estava metilada em

amostras tubulares complexas de grau II e desmetilada em amostras de tumor

papilífero. Todos esses fragmentos representam potenciais marcadores específicos

de subtipos de tumores de mama canino, fato este que corrobora com a

necessidade do estudo mais aprofundado do padrão molecular das neoplasias

mamárias caninas, com objetivo de encontrar possíveis marcadores de significância

clínica.

Palavras-chave: neoplasia, mamária, cadela, histopatologia, epigenética, DNA, carcinoma

ABSTRACT

The mammary neoplasms is gaining great prominence in the veterinary clinic , since

the animal sare living increasingly. The age of tumor`s onset varies from 4 to12 years

old and is associated with hormonal factor sand aging, (just like)in humans. The

diagnosis is based on clinical signals and must be undertaken for metastasis

research and treatment involves surgery to remove the breasts involved and

neutering. The definitive diagnosis is obtained by histopathology. In this case, breast

tumor and tumor-free samples were in histopathology terms and molecular biology

were evaluated. In histopathology HE staining(hematoxylin-eosin), PAS(periodic

acid-Schiff) and Tricômio of Masson colorations were performed, in order toassess

the presence of glycoproteins and tissue in tumors .The tumor samples classification

showed the prevalence of 100% carcinomas distributed invarying degrees of

malignancy. It was observed that the more undifferentiated tumors, there are

prevalence of glycoproteins and scarcity of tissue, but specifically collagen. To this

observation we took into account the PAS staining and Tricômio of Masson,

respectively. All normal and tumor samples genomic DNA were demonstrated intact

with high molecular weight bands, a fact that confers reliability to this study.The

methylation profile of the samples was determined after digestion of DNA by

restriction enzymes,PCR (Polymerase Chain Reaction) and polyacrylamide gel.It was

observed that there are significant differences in the methylation status of tumor

tissues and tumor-free tissue. These changes could be observed both by a

methylation pattern in tumor samples and hypomethylation in normal tissue (band of

340pb) or by the presence of fragments hipometilated, but methylated in the tumor

and in normal tissue (Band 600pb), which may represent new represent regions of

DNA hypomethylation of tumor pattern. Genomic regions were identified andreveled

altered methylation pattern between tumor subtypes. It was shown a fragment of

approximately 400pb which appeared methylated in tumor sample and demethylated

in other solid tumor samples, tubular and papillary type. We also observed a band of

390 bp in samples that was methylated and demethylated in tubular complex II in

samples of papillary tumors. All these fragments represent potential markers of

specific subtypes of canine mammary tumors, a fact that confirms the need for further

study of the molecular pattern of canine mammary tumors, in order to find possible

markers of clinical significance.

Key Words: neoplasms, mammary, bitch, histopathology, epigenetics, DNA, carcinoma

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Conformação e estrutura dos ácinos mamários 16 Quadro 1 Tipos histológicos adotados no Consenso de 2011 23 Figura 2 Aspecto macroscópico de neoplasia mamária canina. 33 Figura 3 Fragmento representativo de neoplasia mamária, para realização

do estudo epigenético 33

Gráfico 1 Classificação citopatológica das amostras tumorais obtidas 38 Gráfico 2 Distribuição dos tumores mamários avaliados segundo a

classificação histológica 40

Quadro 2 Tabela comparativa entre diagnóstico citológico (coluna2) e histopatológico(coluna 3) de 11 amostras estudadas representadas (coluna 1), sendo que na histopatologia utilizou-se a coloração padrão hematoxilina-eosina (HE)

41

Figura 4 Tecido glandular controle-normal (HE 40X) 42 Figura 5 Tecido glandular controle-normal (Tricrômio de Masson 40X) 43 Figura 6 Tecido glandular controle-normal (PAS 40X) 43 Figura 7 Tecido glandular com alto índice de proliferação (HE 40/100X) 44 Figura 8 Tecido conjuntivo escasso e com pouca produção de colágeno

(Tricrômio de Masson 40/100X) 44

Figura 9 Tecido conjuntivo de sustentação é delicado e apresenta de grande quantidade de açúcares (PAS 40/100X)

45

Quadro 3 Dados obtidos das amostras tumorais, de acordo com o numero de identificação do animal

46

Quadro 4 Determinação da concentração do DNA em ng/ul 47 Tabela 1 Amostras tumorais – Coloração de PAS 48 Tabela 2 Amostras tumorais – Coloração de MASSON 49 Tabela 3 Tecido mamário normal x Adenocarcinomas – Coloraçao de PAS 50 Tabela 4 Tecido mamário normal x Adenocarcinomas – Coloração de

MASSON 50

Tabela 5 Dados de leitura espectrofomêtrica do DNA genômico obtido de tecidos normais (N) e tumorais (T) da mama de cadelas

53

Figura 10 Eletroforese em gel de Agarose. Amostras realizadas 55 Figura 11 Banda de 600 pb metilada em amostra normal e desmetilada em

tecido tumoral 56

Figura 12 Bandas de 400 pb indicando metilação em carcinoma sólido e desmetilação nas demais amostras tumorais tubulares e papilíferas

57

Figura 13 Banda de 390 pb metilada em amostras de carcinomas tubulares complexos e desmetilada em carcinomas papilíferos

58

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABS ABSORBÂNCIA

CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais

CpG ILHA CpG

DNA Ácido dexorribonucléico

DnmtsDNA Metil-transferases

DNTP DEXORRIBONUCLEOTÍDEO 5-FOSFATO

EDTA ÁCIDO ETILENODIAMINOTETRACÉTICO

HE Hematoxilina-eosina

Kb QUILOBASE

LBMGF Laboratório de Biologia Molecular e Genômica Funcional

MIN MINUTOS

MASSON Tricômio de Masson

C GRAUS CELSIUS

MSAP-PCR METILAÇÃO SENSÍVEL COM PRIMERS ALEATÓRIOS -PCR

OMS Organização Mundial de Saúde

OSH Ováriosalpingohisterectomia

ON OVERNIGHT

PAS ÁCIDO PERIÓDICO DE SHIFF

Pb PARES DE BASES

PH POTENCIAL HIDROGENIÔNICO

RE Receptores de estrogênio

RP Receptores de progesterona

SDS

SEG SEGUNDOS

TNM Tumor primário, linfonodos e metástase a distância

TRIS-HCL TRI(HIDROXIMETIL) AMINOMETANO – ÁCIDO CLORÍDRICO

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS...................................................................................................4 RESUMO.....................................................................................................................5 ABSTRACT..................................................................................................................6 LISTA DE ILUSTRAÇÕES...........................................................................................7

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.......................................................................9 SUMÁRIO..................................................................................................................10 1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................12 2 REVISÃO DE LITERATURA...................................................................................15 2.1 Características citológicas e histológicas da glândula mamária canina..............15 2.2.Câncer de mama em cadelas..............................................................................16 2.3.Características histológicas do tumor de mama em cadelas...............................19 2.4.Epigenética e câncer............................................................................................24 2.5 Marcadores moleculares das neoplasias mamárias caninas...............................27 3. JUSTIFICATIVA.....................................................................................................30 4. OBJETIVOS...........................................................................................................31 4.1. Geral....................................................................................................................31 4.2. Específicos..........................................................................................................31 5. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................32 5.1. Ética.....................................................................................................................32 5.2 Material.................................................................................................................32 5.2.1 Coleta do material.............................................................................................32 5.2.2 Transporte do material......................................................................................33 6. METODOLOGIA-histologia....................................................................................34 6.1. Técnica da parafina ............................................................................................34 6.1.1 Colheita.............................................................................................................34 6.1.2. Fixação.............................................................................................................34 6.1.3.Desidratação e diafanização.............................................................................35 6.1.4. Inclusão............................................................................................................35 6.1.5. Corte.................................................................................................................35 6.1.6. Coloração.........................................................................................................35 6.1.6.1. Hematoxilina-eosina (HE)........................................................................... 36 6.1.6.2. Tricômio de Masson......................................................................................36 6.1.6.3. Coloração Ácido Periódico de Shiff (PAS)....................................................36 6.2 Extração de DNA genômico.................................................................................37 7. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................37 7.1 Citopalotogia........................................................................................................38 7.2 Histopatologia- Coloração Hematoxilina-eosina (HE)..........................................39 7.3 Estudo epigenético...............................................................................................52 7.3.1 Quantificação e avaliação da integridade de DNA genômico............................52 7.3.2 Avaliação do perfil de metilação por MSAP-PCR..............................................55 8. CONCLUSÃO.........................................................................................................59 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................61 10. ANEXO 1 - Termos de consentimento livre e esclarecido (TCLE).......................67

11. ANEXO 2 -Parecer de aprovação CEUA - UNIBAN......................................................................................................................69 12. ANEXO 3 - Fotos do pré-cirúrgico das pacientes portadorasde neoplasiasmamárias do estudo...................................................................................................70 12. ANEXO 4 - Fotos das peças enviadas para estudo histopatológico (coluna B) e para o estudo epigenética (coluna A).........................................................................71

12

1. INTRODUÇÃO

A importância do estudo das neoplasias mamárias em cadelas vem

aumentando devido à frequência com que casos deste tipo surgem na clínica de

animais de companhia e devido as semelhanças histológicas que têm com os

tumores de mama em mulheres, podendo representar um modelo de estudos

translacionais para prognóstico, diagnóstico e terapia antitumoral(DALECK;

FONSECA, 2000). Este tipo de neoplasia representa 25 a 50% dos tumores caninos,

sendo que a metade são considerados malignos. São detectados em animais acima

de 5 anos, podendo em menor proporção acometer fêmeas com menor faixa etária.

Não existe uma predisposição racial, no entanto, apresenta maior risco nas raças

puras, com maior semelhança genética (DALECK, et al, 1998).

A cadela possui 5 pares de glândulas, as quais podem apresentar diversos

tipos de tumorações. A maneira definitiva de se obter o diagnóstico é pela análise

histopatológica de biópsia excisional. Caso haja suspeita de invasão ou aumento de

tamanho de linfonodos regionais, recomenda-se sua remoção e a realização de

análises histopatológicas. O tratamento cirúrgico é a terapia de escolha para todas

as cadelas com neoplasias mamárias, exceto para carcinomas inflamatórios e

neoplasias com metástase a distância. A técnica cirúrgica dependerá da localização

dos tumores nas glândulas. Na prática veterinária, alguns fatores são considerados

prognósticos, tais como tipo histológico, grau de invasão e de diferenciação nuclear,

tamanho do tumor, presença ou ausência de ulceração e presença ou ausência de

metástases a distância ou em linfonodos regionais (QUEIROGA; LOPES, 2002).

Deve-se ressaltar a importância da realização da castração precoce na

prevenção de neoplasias mamárias em cadelas, uma vez que caso seja feita antes

do primeiro cio reduz quase a zero o percentual de câncer de mama quando estiver

em idade adulta(QUEIROGA; LOPES, 2002).

No entanto, na medicina humana, têm se atentado a outros fatores

prognósticos e preditivos de resposta a terapia antitumoral, enfatizando o estudo de

fatores moleculares. Consideram-se fator prognóstico as características clínicas,

patológicas e biológicas de pacientes com câncer e seus tumores, que prevêem o

resultado clínico, numa situação sem tratamento (ZUCCARI, et al, 2088).

Em cadelas, os maiores fatores preditivos para metástase, tais como,

comprometimento de linfonodo ou grau histológico do tumor e seus histotipos,

falham em classificar os tumores mamários de acordo com seu comportamento

13

clínico. Com isso, a avaliação de marcadores moleculares de prognóstico apresenta-

se como uma ferramenta mais útil e conclusiva. As informações como expressão de

receptores hormonais ou mesmo características proliferativas são definitivas na

escolha de um esquema terapêutico correto (ZUCCARI, et al, 2008).

É importante ressaltar que existe uma grande similaridade entre genes

humanos e caninos, comprovando que é possível estudar mecanismos genéticos em

cães que servirá de modelo comparativo a seres humanos ( SANTOS, et al, 2010).

Os potenciais fatores prognósticos para carcinoma mamário em mulheres

podem ser agrupados em quatro gerações. Na primeira geração estariam os fatores

clássicos, já conhecidos como o estágio TNM (tumor primário, linfonodos e

metástase a distância). O estágio TNM é utilizado para realizar o estadiamento

tumoral, levando-se em conta o tamanho do tumor primário, a invasão dos

linfonodos adjacentes por células neoplásicas e a existência de metástases à

distância. A segunda geração inclui marcadores de reconhecida validade, como os

receptores de estrogênio (RE) e progesterona (RP) e marcadores de expressão

celular (Ki-67 e PCNA). Na terceira geração estão os marcadores genéticos, como

oncogenes, genes mutados ou não expressos e proteases. A quarta geração é

constituída pelos chamados preditores de metástase órgão-específicos (ZUCCARI,

et al, 2008; Eisemberg e Koifman, 2001; Terzian et al, 2007).

O estudo das mudanças na função gênica mantidos durante a mitose, que

não podem ser explicadas pela mudança na sequência do DNA é denominado de

epigenética. Os mecanismos epigenéticos de controle de expressão gênica são

fenômenos que, por impor um padrão de expressão gênica específico e herdado

pela progênie sem alterar a sequência de nucleotídeos no DNA, seriam capazes de

promover a especialização de células e suas linhagens, dando origem ao fenótipo

durante o desenvolvimento. O epigenoma é composto pela cromatina e pela

modificação covalente do DNA pela metilação. A metilação do DNA, uma

característica de genomas eucarióticos, é a transferência de um grupo metil pelas

DNA metiltransferases (Dnmts) ao carbono 5´ da citosina nos dinucleotídeosCpG.

Diversos estudos têm demonstrado que os mecanismos epigenéticos, incluindo a

metilação do DNA, são dinâmicos e podem ser alterados durante a vida por múltiplos

fatores fisiológicos, patológicos, nutricionais e ambientais.

O distúrbio de qualquer mecanismo epigenético pode alterar o balanço entre

conformação de cromatina ativa ou silenciada, resultando em um estado

14

transcricional alterado. Por exemplo, no câncer, o padrão de metilação do DNA é

invertido, havendo hipermetilação de promotores ricos em CG e hipometilação geral

do genoma, contribuindo para uma instabilidade genômica. Este processo alterado

de metilação não é aleatório e a hipermetilação específica de genes (por exemplo:

gene supressor de tumor) parece estar associada com a tumorigênese. Estudos

demonstram uma correlação positiva entre o grau de hipometilação e o grau de

malignidade crescente, sugerindo que a hipometilação pode ser um biomarcador útil

com significado prognóstico em tumores mamários (BANCROFT et al, 1996).

A classificação dos tumores, com critérios histogenéticos e de acordo com o

grau de diferenciação das células, tem grande utilidade na aplicação prática

(BANCROFT et al, 1996). Com base nestas informações, a proposta desse estudo é

avaliar as características histológicas de tumores de mama de cadelas para a

classificação de tipos tumorais. E, realizar uma análise global do epigenoma de

tecidos normais e tumorais, com o objetivo de se investigar alterações de padrões de

metilação do DNA na célula tumoral e buscar marcadores moleculares que possam

ser utilizados juntamente com a análise histológica para a classificação de diferentes

tipos tumorais.

15

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Características citológicas e histológicas da glândula mamária canina

As glândulas mamárias caninas são caracterizadas como estruturas

especializadas da pele, originadas embriologicamente da invaginação de brotos

ectodérmicos para o interior do mesoderma subjacente. Histologicamente são

classificadas como glândulas túbulo-alveolares compostas, que consistem de

unidades secretoras formadas por lóbulos separados por septos de tecido conjuntivo

(Botelho, 2009).

Na espécie canina (Canis familiaris), as glândulas mamárias

desenvolvem-se como botões epiteliais que crescem a partir de espessamentos

lineares, formando as cristas mamárias. Essas cristas desenvolvem-se em cinco

pares nas regiões torácica, abdominal e inguinal (DYCE et al., 2004). A proliferação

do mesênquima que circunda o botão eleva um mamilo sobre a superfície corpórea.

Um ou mais brotos epidérmicos surgem no botão mamário, no tecido conjuntivo, e

começam a formar canais por ocasião do nascimento. Cada broto constituirá o

sistema de ductos (DYCE et al., 2004). Esses ductos se abrem em ductos

interlobulares, formando dúctulos nos septos do tecido conjuntivo, os quais

convergem para formar os ductos lactíferos que drenam os lobos da glândula (DYCE

et al, 2004.) O epitélio de revestimento dos ductos é formado por uma dupla

camada de células epiteliais cúbicas ou cilíndricas baixas e à medida que vão se

ramificando para formar dúctulos, o epitélio transforma-se em simples cúbico ou

cilíndrico (BANKS, 1991). As células epiteliais ductais são responsáveis pela

secreção de proteínas lácteas e lipídios durante a lactação (BANKS, 1991).

Os ductos, assim como os alvéolos, são circundados por células

mioepiteliais contráteis, que se contraem sob a influência da ocitocina, secretando o

leite (FRANDSON, 1979). Além do tecido epitelial, ainda há a presença de

fibroblastos e células que compõem e sustentam o parênquima mamário. Estas

células estromais liberam fatores de crecimento, diretamente ligados à inibição e à

proliferação das células epiteliais (ZUCCARI et al., 2001).

16

Figura 1.(HE/40X):Fotomicrografia de tecido glandular mamário em aumento de 40X. A estrutura é composta por lóbulo pequeno e bem delimitado por tecido conjuntivo denso (setas). As estruturas glandulares são delicadas e apresentam epitélio monomorfico e em monocamada (Arquivo pessoal, 2012) 2.2. O câncer de mama em cadelas

A prevalência das neoplasias mamárias em cadelas está aumentando

consideravelmente nos últimos anos. A crescente incidência de doenças neoplásicas

na espécie canina tem várias razões, entre elas está o aumento da expectativa de

vida observado nestes animais. Fatores como nutrição com dietas balanceadas,

prevenção de doenças infecciosas com vacinação, métodos precisos de diagnóstico

e avanços na área terapêutica contribuem para o aumento da longevidade dos cães

(HATORE, 2011).

Os tumores mamários caninos constituem cerca de 50% de todos os

tumores que afetam as fêmeas desta espécie, embora a incidência mostre tendência

de diminuição, uma vez que a prática de ováriosalpingohisterectomia (OSH) em

fêmeas jovens é cada vez mais comum (QUEIROGA E LOPES, 2002). Para Hatore,

50% dos tumores mamários em cadelas são malignos, acomentendo em maior

proporção fêmeas entre 10 e 11 anos de idade, sendo mais raras em animais com

menos de 5 anos de vida. No entanto a idade está diretamente relacionada ao porte

do animal no que diz respeito ao aparecimento de neoplasias mamárias. Animais de

porte grande podem apresentar as alterações neoplásicas mais cedo que animais de

17

porte pequeno, pois possuem expectativa de vida menor. Para De Nardi, et al 2002,

o percentual de neoplasias malignas em relação ao número total de neoplasias

mamárias é de 68%.

Não existe uma predisposição racial evidente, embora algumas raças

sejam apontadas por alguns autores nas quais a incidência é maior. Em Beagles e

Boxer existem relatos com menor risco de apresentarem tumores de mama

(QUEIROGA e LOPES, 2002).A determinação do risco em relação a raça pode

variar de acordo com a região geográfica, como por exemplo no Japão, onde foi

relatada a incidência de 25% de neoplasias mamárias em cães de raça pequena e

58,5% de neoplasias malignas em cães de grande porte (FILHO, 2010).

Entre os tumores de mama malignos, a grande maioria se constitui de

carcinomas, sendo o tipo histológico um fator prognóstico importante para estes

animais. Entre as cadelas com neoplasias benignas, 26% delas desenvolvem

tumores em outras glândulas mamárias ao decorrer da vida. Cadelas com vários

nódulos podem apresentar tumores malignos e benignos concomitantemente

(OLIVEIRA et al., 2003).

Em relação ao tamanho dos tumores mamários, a realização de estudos

multicêntricos contribui muito para o estudo da epidemiologia deste tipo de câncer,

uma vez que pode-se observar que em países em desenvolvimento, geralmente

observam-se tumores relativamente maiores que em países desenvolvidos. Fato

este é suportado pela alta conscientização da castração precoce e do controle da

natalidade dos animais nos países ricos. Outro fator a ser levado em consideração

seria o poder aquisitivo dos proprietários em poder tratar do seu animal logo que

percebe a neoplasia. No estudo de Oliveira et al em 2003, foi observado que no

Brasil mais de 70% dos casos as neoplasias mamárias ultrapassavam 5 cm. No

entanto, segundo Itoh em 2005, no Japão, este número era de menos de 30 %.

De acordo com Daleck (1998), 40% dos tumores mamários são

carcinomas, 50% são tumores mistos e 10% são de outro tipo histológico. Afirma

ainda que a hiperplasia cística ocorre frequentemente em cadelas e está associada

a uma alteração pré-neoplásica. No desenvolvimento destas neoplasias são

envolvidos fatores genéticos, ambientais e hormonais. O papel dos hormônios

sexuais na origem destas neoplasias está extensamente estudado e estabelecido.

Este fato é suportado pelo aumento pronunciado da incidência dos tumores quando

a castração é efetuada após o segundo ciclo estral do animal. Quando as cadelas

18

são castradas antes do 1º cio o risco de desenvolverem tumores de mama é 0,05%.

Se a castração é efetuada após o 1º cio, o risco é de 8%, aumentando para 26%, se

a castração for efetuada após o 2º ciclo éstrico. Após instalado o tumor mamário, a

remoção dos ovários não interfere na prevenção do câncer de mama, apenas como

prevenção de outras afecções reprodutivas (QUEIROGA e LOPES, 2002).

As neoplasias presentes nos 3 pares de mamas craniais, correspondem a

cerca de 5,9% dos casos, enquanto que nas 3 mamas caudais correspondem a

51,8%. Tumores em todas as mamas ocorreram em 36,5% dos casos. A terceira

mama esteve envolvida em 5,9% dos casos. Nódulos tumorais múltiplos foram

identificados em 77,6% dos casos e tumores presentes nas 2 cadeias mamárias

concomitantemente 55,3% dos casos (OLIVEIRA et al, 2003).

Dentre as cadelas que apresentam tumores de mama, 48% apresentam ou já

apresentaram pseudociese, e o percentual de cadelas portadoras de neoplasia

mamária que tiveram filhotes é praticamente o mesmo de cadelas que nunca

pariram (OLIVEIRA, et al, 2003)

A administração de progestágenos foi relatada em 44,4% das cadelas dos

tumores mamários. Destas, 72% foram acometidas por neoplasias malignas.

Tumores benignos também são relatados em cadelas que receberam progestágenos

com objetivos anticoncepcionais (OLIVEIRA, et al, 2003).

As hipóteses mais citadas sobre a etiologia dos tumores mamários referem-

se à obesidade e a atividade hormonal. Os autores citados na sequência são

unânimes em afirmar que alguns tumores mamários são hormônio-dependentes

(ZUCCARI, et al, 2001; HATORE, 2011; SANTIN et al, 2009).

Em relação ao potencial metastático, foi relatado que em cerca de 15% dos

casos de tumores malignos mamáriosapresentaram metástase pulmonar

(OLIVEIRA, et al, 2003).

Segundo Filho et al, (2010) em estudo retrospectivo de 19 anos de rotina de

atendimento hospitalar, nos últimos 5 anos houve um aumento significativa da

ocorrência de tumores mamários em cadelas. O tipo histológico prevalente neste

estudo foi o carcinoma simples e a ocorrência mais frequente de metástase é para

linfonodos regionais, linfonodos mediastínicos e pulmões.

O diagnóstico das neoplasias mamárias caninas é realizado através de

exame físico minucioso, palpação de linfonodos regionais e verificação do estado

geral do animal, associados ao histórico clínico. Para pesquisa de metástases são

19

realizadas radiografias de tórax em 3 incidências e ultrassonografia abdominal

(CASSALI, et al, 2011; CIRILLO, 2008; SALIBA, et al, 2010).

O tratamento cirúrgico é o de escolha, podendo ser seguido por tratamento

quimioterápico após cirurgia, com exceção dos carcinomas inflamatórios, cuja

indicação é apenas tratamento quimioterápico. A escolha da técnica cirúrgica

depende da conduta do cirurgião, no entanto podem ser realizadas mastectomias

parciais ou totais, unilaterais ou bilaterais (CASSALI, et al 2011).

O tratamento pós cirúrgico envolve o uso de quimioterápicos, cuja escolha

depende do tipo histológico. Os quimioterápicos mais utilizados na medicina

veterinária são a doxorrubicina associada com ciclofosfamida e vincristina ou o uso

de cisplatina ou carboplatina como drogas únicas (CASSALI, et al 2011; SALIBA, et

al, 2010). No entanto, a utilização de mais de um fármaco associado a outro, com

mecanismos de ação diferentes (poliquimioterapia) tem demonstrado maior eficácia

(CIRILLO, 2008).

Os quimioterápicos têm como alvo células em intensa atividade proliferativa,

inclusive células normais que estão em constante mitose, como epitélio intestinal,

medula óssea e folículos pilosos. Por estes motivos, mielossupressão, sinais

gastrointestinais e perda de pelo são os efeitos colaterais mais comuns (CIRILLO,

2008). O tempo de tratamento varia de acordo com o protocolo escolhido, sendo que

a média de duração está entre 3 a 6 meses (CASSALI, et al 2011; SALIBA, et al,

2010). Após este período o animal entra nos segmentos oncológicos, consistindo de

1 consulta a cada 3 meses no primeiro ano após o término do tratamento, e 1

consulta a cada 6 meses no segundo ano pós tratamento (CASSALI, et al, 2011)

2.3 Características histológicas do tumor de mama de cadelas

Os tumores malignos de mama são classificados conforme a origem do

tecido envolvido (de origem epitelial ou mesenquimal). Histopatologicamente, os

tumores malignos da mama são classificados de acordo com a Organização Mundial

da Saúde (OMS) da seguinte forma:

1-Tumores de origem epitelial (carcinoma):

- não invasivo (in situ) ocorrem quando as células epiteliais não

ultrapassam a membrana basal;

- invasivos – quando as células epiteliais rompem a membrana basal e invadem

os tecidos adjacentes;

20

2- Tumores de origem conjuntiva (sarcomas);

3- Tumores mistos – tumores que se originam de ambos os tecidos, tanto do

tecido epitelial quanto do tecido conjuntivo, e são chamados de

carcinossarcomas;

Quase todas as malignidades da mama são carcinomas, de modo que tipos

como carcinoma de células escamosas, tumores filóides, linfomas e sarcomas

representam menos do que cinco por cento do total. Desses tumores, sarcomas são

os menos frequentes.

Os tumores prevalentes nas glândulas mamárias caninas são o adenoma,

carcinoma, carcinomas sólidos e tumores mistos da glândula mamária. Os

adenomas mamários, tumores benignos, ocorrem em 2 tipos histológicos sendo os

intra-ductais e lobulares. Os adenomas intraductais, têm origem nas células epiteliais

dos grandes ductos mamários e dos ductulosinterlobulares, geralmente possuem

ductos císticos, podem ser solitários ou múltiplos, com coloração branca ao corte. Ao

microscópio óptico são caracterizados por massas bem organizadas, revestidas por

uma camada simples de células epiteliais cuboides. As células revestem longas

projeções papilares de um estroma fibrovascular delicado, ou surgem como túbulos

alongados circundados por tecido fibrovascular, que, em conjunto, formam uma

massa polipoide (JONES, 2000).

Os adenomas lobulares, também chamados de adenomas acinares ou

tubulares, são neoplasias epiteliais benignas com origem nos ácinos mamários ou

nos pequenos ductulosintra-lobulares. Macroscopicamente são bem circunscritos e

sólidos, mas podem conter cistos disseminados. Ao microscópio óptico observa-se

células neoplásicas cuboides dispostas em ácinos compactados bem diferenciados

em dimensões variáveis ou em túbulos alongados, podendo apresentar

ramificações. Ao lúmen podem apresentar secreção rica em proteína. Possuem

margem bem definida e tecidos adjacentes podem se apresentar comprimidos

devido à expansão do tumor (JONES, 2000; ZUCCARI et al, 2001).

Os carcinomas são neoplasias epiteliais malignas originadas de células

epiteliais dos ductos mamários maiores, ductos interlobulares, ductos intralobulares

e epitélio secretório dos ácinos (alvéolos). Geralmente ocorrem em 3 padrões de

proliferação, sendo acinar, tubular e papilar, mas pode-se observar mais de um

padrão em uma mesma neoplasia. Além disso, o tecido pode estar acompanhado

21

por uma proliferação mioepitelial circundada por matriz condromucinosa, fato este

que faz o carcinoma ser denominado de simples ou complexo, respectivamente. São

observadas áreas de invasão no estroma e sistema linfático em todos os tipos

histológicos de adenocarcinomas, podendo haver até oclusão dos vasos linfáticos

por células tumorais (JONES, 2000).

Os carcinomas papilares têm origem no epitélio de grandes dutos e dutos

mamários intralobulares e crescem no interior de seus lúmens, sendo denominados

de carcinomas papilares intraductais. Diferem dos adenomas papilares por presença

de maior pleomorfismo celular, sendo as células dispostas em várias camadas,

muitas vezes empilhadas sobre projeções papilares. O prognóstico é melhor nos

casos em que o tumor fica confinado no lúmen do ducto comparado a tumores com

invasão de tecidos circunjacentes. Ocorre invasão do estroma e do sistema linfático,

podendo haver oclusão linfática por êmbolos tumorais. Quando está presente uma

proliferação mioepitelial, o tumor passa a ser chamado de carcinoma papilar

complexo e carcinoma papilar simples na ausência desta característica. Caso os

túbulos neoplásicos estejam císticos, a neoplasia é chamada de

cistoadenocarcinoma papilar ( JONES, 2000).

Os carcinomas tubulares também têm origem nos dutos da glândula mamária,

mas o padrão de crescimento é tubular e não papilar. Constituem a grande maioria

dos tumores de mama da espécie canina. Ao microscópio óptico, consistem de

túbulos de diâmetro uniforme, colabados ou desobstruídos, revestidos por uma

camada simples ou por várias camadas de células epiteliais cuboides. Em alguns

casos, os túbulos podem estar dilatados. Podem ser denominados de simples ou

complexos, dependendo da ausência ou presença de tecido mioepitelial. Também

possuem a característica de invasão do sistema linfático e do estroma (JONES,

2000).

Os carcinomas lobulares ou acinares possuem semelhanças com o tipo

histológico anterior, no entanto as células são arranjadas em ácinos distintos e não

em túbulos. Ambos os padrões podem existir em uma mesma neoplasia. As

características de malignidade são as mesmas dos tumores malignos citados

anteriormente (JONES, 2000).

Os chamados carcinomas infiltrativos da glândula mamária podem ser

papilares ou tubulares, mas possuem uma proliferação fibroblástica significativa, que

se diferencia em um tecido conjuntivo colagenoso denso e maturo. Esta proliferação

22

representa uma resposta desmoplásica pelo tecido conjuntivo do hospedeiro à

invasão por células neoplásicas. Seria uma tentativa de isolar as células invasoras.

As células neoplásicas, encontradas em ninhos, estão incrustradas em tecido

conjuntivo colagenoso. Portanto, neste tipo histológico a presença e identificação do

colágeno é de suma importância para o diagnóstico preciso (JONES, 2000;

ZUCCARI et al., 2001).

Os carcinomas sólidos microscopicamente consistem de nódulos sólidos ou

folhetos de células epiteliais neoplásicas sem evidências de padrão tubular, acinar

ou papilar. Frequentemente invadem sistema linfático e estroma adjacente. Os

carcinomas anaplásicos são neoplasias das glândulas mamárias caninas,

constituídas por células extremamente pleomórficas, podendo ser redondas,

poliédricas e fusiformes. Possuem núcleos mais hipercromáticos, pleomórficos com

aspecto polipoide. Estes tumores são altamente invasivos e com alto potencial de

metástases (JONES, 2000).

Os tumores mistos da glândula mamária são comuns na espécie canina. Ao

microscópio óptico apresentam uma proliferação neoplásica das células epiteliais e

mioepiteliais com diferenciação dessas células em ilhas de tecido cartilaginoso ou

ósseo. A diferenciação entre tumores mistos benignos de malignos pode ser difícil,

mas critérios de invasibilidade de sistema linfático e estroma são levados em

consideração para o diagnóstico, além das características neoplásicas das células

envolvidas (CASSALI, et al, 2011).

Em 2011 foi publicado no Brazilian Journal of Veterinary Pathology o Documento

de Consenso para o Diagnóstico, Prognóstico e Tratamento dos Tumores Mamários

Caninos, o qual estabelece uma modificação na classificação do tumores mamários

caninos, que, até então, eram classificados de acordo com características

morfológicas celulares e nucleares. Recentemente os pesquisadores propõem a

graduação das neoplasias mamárias caninas levando-se em conta o índice de

Nottingham, o qual já é utilizado na medicina humana.

O Índice de Nottingham leva em conta muitos critérios objetivos para

classificação da neoplasia, como a formação de estruturas tubulares no tecido

neoplásico e número de mitoses atípicas encontradas por campo de 40x. Todos

estes dados levam a obtenção de um índice, que já classifica as neoplasias

mamárias em mulheres mais objetivamente (CASSALI, et al 2011).

23

Quadro 1: Tipos histológicos adotados no Consenso de 2011, todos adaptados da

classificação já estabelecida da OMS e AFIP, de 1999:

Lesões epiteliais não neoplásicas Hiperplasia epithelial Hiperplasia ductal Hiperplasia lobular Adenose Lesão de células colunares Alteração de células colunares Hiperplasia de células colunares Lesões atípicas de células colunares Tumores benignos Adenoma Adenoma complexo Adenoma basalóide Fibroadenoma Tumor misto benigno Papiloma ductal Tumores malignos Carcinomas Carcinomas in situ Carcinoma ductalin situ Carcinoma lobular in situ Tumor misto-carcinoma Carcinoma complexo Carcinoma papilar Carcinoma tubular Carcinoma sólido Tipos especiais de carcinomas Carcinoma micropapilar Carcinoma lobular invasivo Carcinoma lobular pleomórfico Carcinoma secretório Carcinoma mucinoso Carcinoma rico em lipídeos Carcinoma de células escamosas Carcinoma anaplásico Neoplasias mamárias com diferenciação sebácea Sarcomas Fibrossarcoma Osteossarcoma Carcinossarcoma Tumor misto-sarcomas Outros sarcomas Condrossarcoma puro Lipossarcoma Hemangiossarcoma

Adaptado de CASSALI, et al 2011.

24

2.4 Epigenética e câncer

Epigenética é o estudo da transmissão da memória celular através de mitose,

que não é baseada na sequência do DNA (BRONNER et al., 2010). Modificações

epigenéticas influenciam o padrão de expressão gênica e oferecem uma única

assinatura de um estado de diferenciação celular (NG et al., 2008). A metilação do

DNA é a modificação epigenética mais extensivamente estudada em mamíferos. Ela

fornece um mecanismo de silenciamento estável do gene, desempenhando um

papel importante na regulação da expressão dos genes e da estrutura da cromatina

(SHARMA et al., 2010). A metilação do DNA desempenha seus efeitos de regulação

da transcrição genica diretamente, bloqueando o acesso de fatores de transcrição

chave para os sítios de ligação ao DNA, ou indiretamente através do controle

epigenético do seu acesso ao DNA por meio de alterações na estrutura da cromatina

(SINGAL et al., 1997; BEDNARIK et al., 1991 apud CHAPPELL et al., 2006).

O silenciamento gênico ao nível de cromatina é necessário para a vida de

organismos eucarióticos e é particularmente importante para a orquestração dos

principais processos biológicos, incluindo diferenciação, imprinting e silenciamento

de grandes domínios cromossômicos (JONES et al., 2007). Estudos de como os

genes são regulados e os mecanismos que estão envolvidos neste processo são de

grande importância para a compreensão dos processos normais e estados de

doença (COSTA, 2010; MULAS, 2005).

Diversas enzimas e vias bioquímicas que participam no estabelecimento dos

padrões epigenéticos têm sido identificadas. A metilação do DNA é mediada pelas

DNA metiltransferases (DNMT1, 3a e 3b) na presença da S-adenosil-L-metionina,

doadora de grupos metil. DNMT3a e DNMT3b foram descritas como

metiltransferasesde novo que catalisam a metilação do DNA em sequências

anteriormente não metiladas. DNMT1 é uma metiltransferase de manutenção que

tem como alvo preferencial o DNA hemimetilado, gerado após a replicação de uma

sequência metilada. Dessa forma, a DNMT1 assegura que os padrões de metilação

do DNA possam ser transmitidos para a próxima geração

O câncer é uma doença que resulta do acúmulo e interação de alterações

genéticas e epigenéticas (ROUNTREE et al., 2001). O epigenoma do câncer é

caracterizado por mudanças na metilação do DNA, bem como perfis de expressão

alterado de enzimas modificadoras da cromatina (SHARMA et al., 2010), composto

25

por desmetilação global e hipermetilação do promotor (TING et al., 2006). Sugere-se

que a hipometilação leva à ativação de proto-oncogenes, tais como h-Ras e c-Myc

(COSTELLO et al., 2001 apud ATTWOOD et al., 2002). Estudos demonstram uma

correlação positiva entre o grau de hipometilação e o grau de malignidade crescente,

sugerindo que a hipometilação pode ser um biomarcador útil com significado

prognóstico. Enquanto testes mostram uma diminuição global da metilação em todo

o genoma em muitos tumores, eles não fornecem informações sobre onde a

hipometilação ocorre (SOARES et al. apud PLASS et al., 2002).

Tem sido documentado que o silenciamento do gene supressor de tumor por

hipermetilação do promotor contribui no processo de transformação maligna

(ESTELLER, 2002 apud EL-HAMID et al., 2010). O aumento da metilação das ilhas

CpG é freqüentemente acompanhada por uma diminuição no nível global de

metilação do DNA e isto pode contribuir para a diminuição da instabilidade do

cromossomo (CHEN et al., 1998 apud JONES, 1999). A hipermetilação de ilhas CpG

normalmente não metiladas nas regiões promotoras de genes-chave para o câncer,

incluindo as ciclinas e proteínas relacionadas com a regulação do ciclo celular, por

exemplo os genes p16, p15, E-caderina, VHL e hMLH1, correlaciona-se com a perda

da sua transcrição em tumores humanos (HERMAN et al., 1998 ; ESTELLER et al.,

1998 apud ESTELLER et al. 1998).

Em tumores mamários caninos parece existir uma correlação entre perda de

expressão das E-caderinas (moléculas de adesão celular) e outros indicadores

conhecidos de prognóstico ruim, tais como tamanho do tumor, ulceração, tipo

histológico e metástases em linfonodos. Isto indica que a perda de expressão das E-

caderinas é um fator prognóstico importante ( PIEKARZ et al, 2008).

A hipometilação do DNA deve-se, principalmente, à perda da metilação em

sequências repetitivas, como as repetições do DNA ribossomal, repetições satélites

ou centroméricas, que se encontram altamente metiladas em tecidos normais, mas

que perdem a metilação em tumores. Os mecanismos desta perda de metilação do

DNA não estão claros, mas pode ocorrer por um mecanismo passivo que envolve a

replicação do DNA e a inibição da DNMT1, a metiltransferase de manutenção do

DNA ( PIEKARZ et al, 2008). A hipometilação de sequências repetitivas coincide

com mudanças na cromatina, provocando instabilidade genômica, uma das

características dos cânceres e que pode ser o evento iniciador da tumorigênese,

26

como demonstrado em modelos de camundongos com expressão diminuída de

DNMT1.

A hipermetilação do DNA em sequências ricas em CpG denominadas de ilhas de

CpG, normalmente não metiladas, é um dos mecanismos pelo qual as alterações

epigenéticas contribuem para a tumorigênese. Foi demonstrado que, em muitos

genes relacionados ao câncer e em genes supressores de tumor, as modificações

epigenéticas, tendo como alvo preferencial a região promotora de genes, resultam

em silenciamento (ESTELLER et al., 1998 apud ESTELLER et al. 1998). Além disso,

a hipermetilação das ilhas CpG pode preceder o processo neoplásico e aumentar

continuamente de lesões iniciais pré-neoplásicas até o câncer invasivo. Isto foi

demonstrado em vários cânceres, incluindo câncer de mama, cólon, próstata,

pulmão, esôfago, cervical, gástrico e síndrome mielodisplásica e pode ser

recapitulado em modelos animais para a progressão do câncer (BAYLIN,2005;

KOPELOVICH, 2003; LEE, 2010).

A terapia epigenética, que tem como objetivo a utilização de drogas para a

correção das alterações epigenéticas, é uma nova e atraente área para o

desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a prevenção e tratamento

de várias doenças, incluindo o câncer (DUCASSE; BROWN 2006). No câncer de

mama, por exemplo, a ausência/perda da expressão de ERα está ligada à

insensibilidade à terapia antiestrogênica e a possibilidade de sensibilizar estes

tumores ao tamoxifeno pela indução da expressão de ERα utilizando-se HDIs e/ou

agentes desmetilantes é atualmente um dos objetivos dos novos tratamentos(GAMA;

SCHMITT, 2008; UVA, 2009; RIVERA, 2011).

Do ponto de vista clinico, a epigenética oferece uma via promissora, isto porque,

diferentemente das alterações genéticas como as mutações e deleções, por

exemplo, as alterações epigenéticas são potencialmente reversíveis (JAENISCH;

BIRD, 2003). Genes silenciados por metilação podem ser desmetilados e os

complexos de histonas podem tornar-se transcricionalmente ativos, através da

acetilação e metilação das histonas, via nutrientes, drogas ou outras intervenções na

dieta, fatores que representam uma oportunidade de desenvolvimento de novas

terapias quimiopreventivas e terapêuticas.

Todos esses estudos mostram um papel crucial dos mecanismos epigenéticos,

principalmente a metilação do DNA, no desenvolvimento tumoral e destaca a

27

importancia de se modular esses mecanismos como terapias alternativas para o

câncer (COSTA, 2010)

A identificação das modificações epigenéticas que implicam na expressão gênica

é um passo muito importante para que haja um entendimento de todos os processos

normais e patológicos que ocorrem em uma pessoa ou animal. Alguns

medicamentos são produzidos baseados nas alterações epigenéticas relatadas, tais

como inibidores de DNA metil-transferases e inibidores de modificação nas histonas.

No entanto estes medicamentos não são específicos e seus efeitos colaterais são os

maiores problema relacionados a seu uso (COSTA, 2010)

2.5 Marcadores moleculares das neoplasias mamárias caninas

Os estudos sobre marcadores moleculares em neoplasias mamárias na medicina

veterinária vêm ganhando cada vez mais espaço, uma vez que a busca por um

prognóstico mais acurado e por um tratamento mais personalizado cresce a cada

dia.

Os receptores hormonais (receptores de estrógeno-ER e receptores de

progesterona-PR), COX-2, marcador de angiogênese ( CD31), marcador de índice

proliferativo (MIB-1), fator de crescimento epidermal (EGF), moléculas de adesão (E-

caderinas) e p53 são exemplos de marcadores importantes para fins prognósticos

avaliados em neoplasias mamárias de cadelas, através da imunohistoquímica (

CASSALI et al, 2011).

Em relação ao número de receptores hormonais, existe uma relação proporcional

inversa com a capacidade proliferativa das neoplasias mamárias. Quando mais

agressivo o tumor, menor será a expressão de receptores hormonais do

mesmo.(CASSALI, et al, 2011). Os receptores de estrógeno e de progesterona

atualmente são encarados como marcadores preditivos de resposta a terapia

hormonal (ZUCCARI, et al, 2008).

Em cadelas, a utilização de anticorpos contra os receptores hormonais não tem

alcançado sucesso, pois não houve reação cruzada dos anticorpos utilizados da

espécie humana para cadelas, inviabilizando estudo comparativo. Como não houve

expressão destes marcadores na espécie canina, podemos utilizar a história clínica

do paciente para realizar a OSH no momento da exérese tumoral, com intuito de que

este animal não receba mais estímulo hormonal (ZUCCARI, et al, 2008).

28

O marcador de proliferação celular (MIB-1) é muito expresso nos tumores

malignos pouco diferenciados, sendo que nos mesmos a expressão de receptores

de progesterona é baixa (CASSALI, et al 2011).

O documento de consenso ainda comenta sobre a ciclooxigenase-2 (COX-2) é

um importante marcador tanto para cadelas quanto para mulheres, sendo expresso

em maior proporção em tumores com prognóstico ruim. Está associado com alta

capacidade proliferativas das células neoplásicas, decréscimo no índice apoptótico,

possibilidade de metastatização e neovascularização (CASSALI, et al, 2011).

As moléculas de adesão celular, principalmente as e-caderinas, têm expressão

reduzida conforme o grau de diferenciação da neoplasia diminui, revelando alta

capacidade proliferativa da mesma (CASSALI, et al, 2011). Alguns estudos

comprovam que a e caderina é um potente supressor de invasão nos tumores

mamários e a perda de sua expressão tem relação com um prognóstico ruim

(ZUCCARI, et al, 2008). Alta expressão da mesma indica que a adesão entre as

células está preservada, e deste modo, o risco de metástases à distância é

considerado baixo (ZUCCARI, et al, 2008).

Na década de 70, demonstrou-se que o estresse térmico induzia a expressão

de genes, permitindo a síntese de grande quantidade de proteínas chamadas de

‘’proteínas de estresse”. A expressão destas proteínas no câncer está associada às

condições estressantes das células neoplásicas, tais como baixa concentração de

nutrientes, oferta de oxigênio reduzida e espaço limitado para crescimento.Estas

proteínas ainda estão estudo, mas já estão classificadas como potenciais

marcadores de resposta a terapia (CARVALHO, 2006)

Além disso, mutações do gene p53 são frequentes em tumores mamários de

cadelas, e a expressão da proteína p53 modificada está associada com altas taxas

de invasão e progressão tumoral (CASSALI, et al. 2011)

O gene p53 é um gene supressor de tumor, codificando uma fosfoproteína

nuclear com atividade supressora de tumor. A mesma está presente em condições

normais e tem a função de regulação da proliferação celular e apoptose. Com a

mutação do gene p53, a proteína defeituosa codificada se acumula na célula, sendo

eliminada de forma mais lenta, fato este que permite sua detecção por imuno-

histoquímica (ZUCCARI, et al, 2008).

Nos carcinomas mamários de mulheres, a expressão do p53 está associada a

manifestações mais agressivas e pior prognóstico. A mesma lesão pode ainda

29

expressar c-erb-B2, que é também um gene localizado no cromossomo 17 em

humanos. Ambos são expressos em lesões de alto grau (ZUCCARI, et al, 2008)

O c-erb-B2 é um oncogene cuja expressão está associada com aumento da

atividade proliferativa celular. Na espécie canina é descrita uma superexpressão

deste gene, correlacionada com diagnóstico histopatológico de malignidade mas não

com a presença de invasão local ou doença metastática regional (ZUCCARI et al,

2008).

Em relação aos marcadores de proliferação celular, os mais estudados na

medicina veterinária são o Ki-67 e o PCNA. O Ki-67 é um antígeno nuclear presente

nas fases ativas do ciclo celular. Valores aumentados do mesmo têm correlação

positiva com metástase e baixa taxa de sobrevivência sem a doença (ZUCCARI, et

al, 2008). O PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular) funciona como um

cofator da DNA polimerase delta, está presente em todas as fases do ciclo celular,

em maior proporção na fase S. Seus níveis podem-se manter elevados quando

induzidos por fatores de crescimento, como resultados de danos no DNA, fato este

que faz que o PCNA não pode ser considerado um bom marcador (ZUCCARI, et al,

2008).

As alterações moleculares que são observadas em células cancerosas estão

diretamente relacionadas com o processo de divisão e morte celular. A morte celular

programada, chamada de apoptose, tem um papel importante na determinação do

crescimento tumoral. Para iniciar o processo de apoptose algumas proteases são de

suma importância, tais como a caspase-3. Estudos mostram que a marcação da

mesma possa ser usada no controle da resposta aos tratamentos quimioterápicos, e

que a diminuição de sua expressão possa indicar um mecanismo de sobrevivência

da célula tumoral (ZUCCARI, et al, 2008).

Pela técnica de imunoistoquímica, pode-se determinar o fator de crescimento

endotelial vascular (VEGF), que é uma proteína que estimula a migração e

proliferação de células endoteliais vasculares, podendo aumentar as chances de

metástase, pois induz neovascularização, estimula proliferação das células

neoplásicas e induz produção colagenase e outras enzimas de degradação.O VEGF

é considerado um marcador de angiogênese (FELICIANO, et al, 2012).

Outro marcador que vem ganhando certa importância no estudo de câncer de

mama em cadelas é o maspin, que é um marcador muito sensível , cujos estudos

sugerem ter ação supressora de tumor, com ação indutora de adesão celular entre

30

membrana basal e matriz extracelular. Segundo Zuccari, et al, 2009, foi demonstrada

uma perda de expressão de maspin nas células mamárias malignas de cães quando

comparadas a um pool de tecido mamário normal de cadelas, analisado por PCR em

tempo real. No entanto, existe uma escassez de estudo sobre o maspin na medicina

veterinária

3. JUSTIFICATIVA

O câncer está incluído entre as entidades patológicas que mais acometem

a mama feminina. Segundo a Organização Mundial de Saúde (2010), o câncer de

mama é a segunda causa mais comum de óbitos em mulheres no mundo inteiro. A

cada ano, cresce o número de mulheres acometidas pelo câncer de mama e

também as pesquisas sobre a biologia desse tumor, incluídas aquelas que utilizam

modelos animais, principalmente os tumores de mama de cadelas. O estilo de vida

da sociedade moderna contribui para aumentar a exposição da população a alguns

fatores ambientais, nutricionais, químicos e hormonais, potencialmetne

carcinogênicos. As semelhanças entre os tumores de mama humana e de cadelas,

tais como, a morfologia, a presença de receptores de estrógenos, os órgãos-alvo de

metástases, a evolução clínica e a hereditariedade, motiva o interesse no estudo da

patologia comparada, a partir do uso desses modelos animais. Estudos

comparativos são importantes para o conhecimento da biologia do crescimento e da

organização funcional normal dos tecidos de órgãos humanos e de animais, bem

como de tumores, que poderão produzir conhecimento importante para diagnóstico,

tratamento, prognóstico e prevenção das neoplasias malignas.

O câncer é uma doença que resulta do acúmulo e interação de alterações

genéticas e epigenéticas, afetando a expressão gênica. O epigenoma do câncer

écaracterizado pormudanças na metilação do DNA, bem como perfis deexpressão

alterado deenzimasmodificadoras dacromatina, composto por desmetilação global e

hipermetilação do promotor. Sugere-se que a hipometilação leva à ativação de proto-

oncogenes. Estudos demonstram uma correlação positiva entre o grau de

hipometilação e o grau de malignidade crescente, sugerindo que a hipometilação

pode ser um biomarcador útil com significado prognóstico.

A classificação dos tumores, com critérios histogenéticos e de acordo com o

grau de diferenciação das células, tem grande utilidade na aplicação prática

31

(BANCROFT et al, 1996). Assim, a proposta desse estudo é avaliar as

características histológicas de tumores de mama de cadelas para a classificação de

tipos tumorais. E, realizar uma análise global do epigenoma de células normais e

células neoplásicas, com o objetivo de se investigar alterações de padrões de

metilação do DNA na célula tumoral e buscar marcadores moleculares que possam

ser utilizados juntamente com a análise histológica para a classificação de diferentes

tipos tumorais.

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo Geral

Estudar alterações histológicas estromais e epigenéticas associadas com

diferentes tipos tumorais provenientes da glândula mamária de cadelas.

4.2 Objetivos específicos:

- Analisar os cortes histológicos de tecido normal e tumoral;

- Avaliar a presença de glicoproteínas e colágeno nos cortes histológicos através de

coloração PAS e Tricômio de Masson, além da coloração padrão Hematoxilina-

Eosina (HE)

- Estabelecer a metodologia de obtenção de DNA gênomico de fragmentos de

tecidos normais e tumorais de mama de cadelas, no laboratório LBMGF ( Biologia

Molecular e Genômica Funcional) da UNIBAN;

- Comparar o padrão de metilação do DNA na célula normal e tumoral por MSAP-

PCR.

32

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1 Ética

Para esta pesquisa, foi criado um banco de DNA de amostras de tumores de

mama de cadelas de animais operados no centro cirúrgico do Hospital Veterinário da

UNIBAN/Anhanguera. Os dados clínicos e anátomo-patológicos foram coletados e

depositados em um banco de dados para futura correlação com os dados

epigenéticos.

Embora a remoção cirúrgica do tumor seja um procedimento muito invasivo, é

o principal tratamento indicado para esse tipo de neoplasia. Desta forma, nenhum

procedimento além do convencional será realizado no animal para uso exclusivo

dessa pesquisa. Os responsáveis pelos animais serão informados sobre a pesquisa

e permitindo a utilização do material, deverão assinar o termo de consentimento livre

e esclarecido (ANEXO 1).

Este presente estudo possui aprovação no Comitê de Ética e Experimentação

Animal (CEUA) da Universidade Bandeirante Anhanguera (UNIBAN) sob o registro

275/2012 (ANEXO 2).

5.2 Material

5.2.1 Coleta do material

A despeito dos diversos subtipos histológicos dos tumores caninos,

reconhecidos, foram utilizadas neoplasias genericamente classificadas como

carcinomas. As amostras de parênquima mamário canino, normal e tumoral foram

obtidas por cirurgias realizadas no Hospital Veterinário da Universidade Bandeirante

Anhanguera, sob a responsabilidade do cirurgião veterinário Rodrigo Monteiro.

Momentos antes do início da cirurgia, eram realizadas as punções aspirativas das

formações para estudo citológico, realizava-se a punção com agulha hipodérmica

20x5,5 mm e fazia-se esfregaço em lâminas de microscopia. As lâminas eram

coradas pelo métido de coloração panótico e avaliadas sob microscopia óptica em

aumento de 40 e 100 vezes. Foram coletados 10 fragmentos de mamas normais e

33

10 fragmentos de tumores malignos, que variavam entre 1 a 10 cm de diâmetro de

cadelas acima de 10 anos de idade, todas inteiras, sem raça definida (Figura

2;Figura 3).Foram escolhidos animais que nunca receberam aplicação de

anticoncepcionais. As técnicas cirúrgicas empregadas foram as de mastectomia

unilateral total ou mastectomia bilateral total, dependendo de cada caso.

Figura 2: Aspecto macroscópico de neoplasia mamária canina.

Fonte: Arquivo pessoal, 2012

Figura 3: Fragmento representativo de neoplasia mamária, para realização do

estudo epigenético Fonte: Arquivo pessoal, 2012

5.2.2 Transporte do material

34

Para cada animal operado, obtiveram-se amostras normais e tumorais. Para cada

uma foram gerados 2 fragmentos, sendo 1 enviado para estudo histológico

acondicionado em formaldeído a 10% e outro colocado no tampão de lise para

estudo epigenético.

Após remoção cirúrgica, os fragmentos para análise molecular foram transportados

para o Laboratório de Biologia Molecular e Genômica Funcional da UNIBAN, dentro

de frascos estéreis contendo 4 ml de tampão de lise ( 40 ul Tris-HCl + 400ul EDTA +

200ul SDS 10% + 3360ul de água bidestilada + 4 ul de Proteinase K), onde foram

colocadas em banho maria a 55º C por 72 horas. As peças cirúrgicas extraídas para

estudo histopatológico foram colocadas em formol 10% na proporção de 1:30 em

coletores apropriados até serem encaminhadas ao setor de patologia do Hospital

Veterinário da UNIBAN, onde após 10 dias seria emitido o laudo histopatológico das

amostras enviadas para constatação e diagnóstico histopatológico dos tecidos

enviados

6 METODOLOGIA – histologia

6.1 Técnica da parafina

Esta técnica é um procedimento simples e confiável que permite inferências

da situação in vivo. É o método mais utilizado para a preparação das lâminas

histológicas para estudo histopatológico para utilização em microscopia óptica.

6.1.1 Colheita

Feita a colheita do material para histopatologia, o mesmo deve ser

rapidamente colocado no fixador, visando inativar as enzimas por desnaturação

protéica responsáveis pelo processo de autólise pós-morte.

6.1.2 Fixação

Após serem coletadas as amostras para histopatologia, as mesmas foram

colocadas em fixação ao formaldeído 10%, que é constituída em 10 volumes de

formalina comercial (40% deformaldeído em água) e 90 volumes de solução tampão

fosfato.

35

Com a fixação, previne-se a autólise pós-morte, facilita-se o corte dos

tecidos por tornarem mais endurecidos e estabilizam-se os componentes estruturais

em uma condição mais próxima da que havia in vivo (BANKS, 1991).

A imersão no fixador ocorreu imediatamente sua remoção do organismo.

A proporção ideal do volume do fixador e do volume do tecido deve ser de 30:1. O

tempo de fixação com o formaldeído gira em torno de 24 horas (BANKS, 1991).

6.1.3 Desidratação e Diafanização

Antes da inclusão da parafina para realização do corte histológico, procedeu-

se a retirada de cerca de 70 a 75% de água presente nos tecidos. Após a fixação, o

tecido é submetido a intensa lavagem com água e submetido a desidratação. Muitos

agentes desidratantes foram utilizados, sendo o de escolha o etanol.

6.1.4 Inclusão

Esta etapa permitirá que o espécime seja cortado fino o suficiente para que

possa ser estudada em microscópio óptico. Após a diafanização, os tecidos são

mergulhados em parafina fundida em uma estufa a 60º C. Devido ao calor o xilol

evapora, e os espaços ocupados por eles serão ocupados pela parafina. Em

seguida coloca-se o tecido em um recipiente retangular contendo um pouco de

parafina fundida e deixa-se solidificar a temperatura ambiente, formando-se um

bloco de parafina com o tecido no seu interior (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999).

6.1.5 Corte

Após o endurecimento da parafina, os moldes foram removidos e os blocos

aparados para expor o tecido incluído. O bloco foi levado ao aparelho chamado

micrótomo rotativo de parafina MR2 e fatias finas (5 a 7 micrômetros) são removidas

da superfície de corte. O processo de corte é associado a uma leve compressão,

sendo as fitas colocadas para flutuar em banho de água quente, sendo

posteriormente recolhidas nas lâminas. (BANKS, 1991 ; JUNQUEIRA & CARNEIRO,

1999).

6.1.6 Coloração

O uso dos corantes facilita o estudo de componentes celulares e teciduais

por permitir uma adequada visualização dos mesmos em microscopia óptica. Alguns

36

deles são muito seletivos, sendo muito específicos para alguns componentes

celulares ou teciduais. Outros são mais seletivos para materiais extra-celulares.

Existem os corantes que não são seletivos, como a hematoxilina (H) e a eosina(E),

pois coram de uma forma geral os componentes celulares e teciduais. (BANKS,

1991). Após a fixação, as lâminas passarão pelos métodos de coloração:

6.1.6.1 Hematoxilina-eosina (HE)

A hematoxilina, corante básico, é aplicada primeiramente. Confere cor

púrpura-azulada aos componentes como cromatina e o ergastoplasma. A eosina,

corante ácido, confere cor rosa ou vermelha aos componentes celulares básicos

como citoplasma e produtos extra-celulares (BANKS, 1991).

6.1.6.2 Tricrômico de Masson

A coloração de Masson ou tricômico de Masson é um método de coloração

que visa ressaltar fibras colágenas na cor azul, tecido muscular e citoplasma em

vermelho. A presença de tecido conjuntivo, principalmente de fibras colágenas, foi

classificada histologicamente em pouco intensa, moderada e intensa.

6.1.6.3 Coloração Ácido Periódico de Shiff (PAS)

Esta coloração identifica a presença de glicogênio e glicoproteínas no citoplasma

celular. As células tumorais podem expressar uma glicoproteína na membrana

plasmática, denominada glicoproteína-P. Tal fato confere à célula neoplásica

habilidade reduzida em acumular fármacos anticâncer, sendo esta a principal causa

de falência dos tratamentos quimioterápicos (Andrade, et al, 2008) . Esta coloração

confere tonalidade avermelhada ao tecido em estudo. A presença de açúcares no

tecido analisado foi caracterizada histologicamente em pouco intensa, moderada e

intensa.

37

6.2 Metodologia -Extração de DNA genômico

Fragmentos dos tecidos serão digeridos com um volume da enzima

proteinase K (20mg/mL) de 1 ul para cada ml de tampão contendo Tris-HCl 10mM

pH 8.0, EDTA 50mM pH 8.0, SDS 0,5%, a 550C, por 72 horas. Após a lise das

células, o DNA genômico foi extraído pela metodologia de fenol/clorofórmio,

quantificado em espectrofotômetro e armazenado a -200C até o uso.

"Methylation sensitive arbitrarily primed-PCR” (MSAP-PCR)

O DNA genômico foi fragmentado com a enzima de restrição MseI

(Biolabs) e digerido com enzimas que compartilham do mesmo sítio de

reconhecimento (isoesquizomeros), mas mostram uma sensibilidade diferencial à

metilação do DNA (MspI e HpaII). A digestão incubada “overnight” (ON) a 37°C foi

amplificada em reações de PCR contendo MgCl2 (1.5mM), dNTP (1.25mM), 20uM de

primer aleatório (MLG-2 ou MGE-2 ou MGF-0) e 0.5U de TaqDNAPolimerase por 5

min. a 95° e 35 ciclos de 95° por 45 seg., 40° por 1 min., 72° por 1 min., e extensão

a 72º por 7 min. O produto da amplificação foi submetido a eletroforese em gel de

poliacrilamida que será revelado com uma solução contendo 0.6g de AgNO3. O perfil

de bandas gerado foi comparado entre tecido normal e tumoral, e, bandas que

possuírem um padrão de metilação diferencial nessa comparação serão os

potenciais marcadores moleculares de tumores de glândula mamária de cadelas.

7 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Neste estudo foram obtidas 11 amostras de animais portadores de

neoplasias mamárias, que foram subdividos em11 amostras tumorais e 11 amostras

de tecidos mamários normais (ANEXO 4) .Em todas as amostras tumorais foi

realizada punção aspirativa por agulha fina, e biópsia de fragmento tumoral para fins

de comparação do diagnóstico citológico com o histopatológico.

38

7.1 - Citopatologia

Considerando os resultados obtidos pela citopatologia, foi mostrado que

dos 11 casos estudados 82% foram classificadas como carcinomas, 9% como

adenomas e 9% com resultado inconclusivo, demonstrando uma alta sensibilidade

diagnóstica, de cerca de 82%(Gráfico 1), e especificidade igual a zero.

Gráfico 1: Classificação citopatológica das amostras tumorais obtidas:

Segundo Zuccari, Santana e Rocha, 2001, o diagnóstico citológico possui

grande correlação com o diagnóstico definitivo histopatológico, fato este que confere

confiabilidade na realização da citologia aspirativa no pré-cirúrgico. Neste estudo

82% das amostras tumorais coletadas por citologia aspirativa por agulha fina tiveram

seu diagnóstico citológico de carcinomas, enquanto que 9% tiveram resultados

inconclusivos e 9% tiveram resultados positivos para adenoma.

No entanto, segundo Magalhães, et al, 2001, o diagnóstico por citologia

aspirativa por agulha fina não confere resultados confiáveis um vez que pode existir

grande variação de tumores e interferências como ulceração e inflamação, devendo

este método ser substituído por citologia esfoliativa. Neste trabalho, o único caso

com diagnóstico citológico inconclusivo constava de uma neoplasia ulcerada, com

Classificação citopatológica das amostras tumorais obtidas

Carcinoma

Adenoma

Inconclusiva 82%

9%

9%

39

extensas áreas de necrose e presença de infecção bacteriana local (ANEXO 3 B),

fato este que se correlaciona com o estudo de Magalhães, et al, 2001.

A citologia apresentou-se como técnica útil, especialmente quando se

observa sinais de malignidade nas células, como pleomorfismo, nucléolo evidente,

cromatina fortemente corada,entre outros. No entanto, quando não observados

estes sinais pode deixar indefinido o quadro, sendo fundamental estudo

histopatológico. Além disso, é um exame rápido de ser realizado, não necessitando

de anestesia do animal para sua realização e que muitas vezes revela um

diagnóstico preliminar. (REIS, F.R, et al, 2010).

7.2 - Histopatologia (Coloração Hematoxilina-eosina - HE)

Na análise dos resultados histopatológicos foram considerados os seguintes

critérios e achados histológicos para a graduação das neoplasias em carcinomas de

grau I, II e III, de acordo com a graduação preconizada pela Organização Mundial de

Saúde (OMS) /AFIP – Armed Forces InstituteofPathology (1999).

Carcinomas Grau I: Presença de estratificação do tecido glândulas

mamário podendo ou não ocupar toda a luz tubular. Tecido conjuntivo

bem delimitado nas margens. Ausência de alterações em estruturas

vasculares. Alto grau de atipia nuclear, presença de mais de 1 nucléolo

por célula.

Carcinoma Grau II: Aumento da atipia celular, presença de elevado

pleomorfismo nuclear e citoplasmático, elevado número de mitoses,

células neoplásicas com estruturas glandulares pouco delimitadas por

tecido conjuntivo, com caracteristicas de invasão aos tecidos

adjacentes.

Carcinoma Grau III: Presenca de todos os achados descritos

anteriormente, adicionado a invasão de estruturas vasculares,

sanguíneas ou linfaticas por células neoplásicas. Presenca de tecidos

linfoides adjacentes com infiltrado neoplásico

Todos podendo variar de simples a complexo, sendo que neste último

observam-se matrizes cartilaginosas no componente mesenquimal. Para fins de

análise de dados, os carcinomas foram agrupados em simples ou complexos e a

graduação de 1 a 3.

40

A análise histopatológica pela coloração de hematoxilina-eosina (HE)

mostrou que 36,4% das amostras foram classificadas como carcinomas mamários

simples grau I, 27,2% carcinomas mamários simples grau II, 18,2 % carcinomas

mamários simples grau III e 18,2% carcinomas mamários complexos grau I (gráfico

2). A alta prevalência de carcinomas simples também foi relatada por outros estudos

(DALECK et al. 1998, ZUCCARI et al. 2001, OLIVEIRA et al.2003).

Gráfico 2.: Distribuição dos tumores mamários avaliados segundo a

classificação histológica

Segundo Hatore, 2011, em um estudo constando de 21 cadelas

portadoras de neoplasias mamárias, mais de 76% dos casos revelaram carcinoma

mamário, reforçando a elevada prevalência deste tipo tumoral. No presente estudo,

100% dos casos revelaram carcinomas mamários, de variados graus. Esta diferença

pode ser explicada pelo fato de que neste trabalho todas as cadelas que

participaram do estudo eram consideradas idosas (acima de 10 anos e no estudo

anterior de Hatore, das 21 cadelas, 5 eram consideradas adultas e 16 idosas. No

entanto, deve-se considerar o porte do animal estudado. Animais de raças

pequenas, como poodles, yorkshires têm expectativa de vida maior que um cão de

raça grande, como um rottweiler por exemplo. Isto deve ser levado em consideração

nos estudos. Neste trabalho todos os animais eram sem raça definida, mas

possuíam porte médio, com peso entre 10 a 25 kg.

A comparação realizada entre o diagnóstico citológico e histopatológico

as amostras neoplásicas pode ser mostrada no Quadro 1.Na coluna 1 está

Classificação histopatológica das amostras tumorais obtidas

Carcinoma mamário simples Grau I

Carcinoma mamário simples Grau II

Carcinoma mamário simples Grau III

Carcinoma complexo Grau I

36,4%

27,3%

18,2%

18,2%

41

representado o número de prontuário de cada amostra. Na coluna 2 a classificação

baseada na análise citopatológica e na coluna 3 a classificação baseada na análise

histológica.

Quadro 2: Comparação entre diagnóstico citológico e histopatológico de amostras

tumorais avaliadas nesse estudo e baseada na coloração padrão hematoxilina-

eosina (HE)

Número do prontuário Diagnóstico citológico Diagnóstico histopatológico

14.217 Carcinoma mamário Carcinoma papilíferosimples II

13.864 Carcinoma mamário Carcinoma

sólidopoucodiferenciado

14.170 Carcinoma mamário Carcinoma túbulo

papilíferosimples III

14.110 Carcinoma mamário Carcinoma tubular complexo I

13.943 Carcinoma mamário Carcinoma tubular simples I

14.055 Carcinoma mamário Carcinoma tubular complexo I

14.134 Adenoma mamário Carcinoma túbulo papilífero

simples III

14.289 Carcinoma mamário Carcinoma túbulo

papilíferosimples II

13.957 Inconclusivo Carcinoma papilíferosimples I



Os critérios de malignidade mais observados foram atipia e pleomorfismo

celular. Já o padrão nuclear se mostrou decisivo no diagnóstico, visto que a

presença de um ou mais nucléolos e o padrão irregular da cromatina só podem estar

presentes em tecidos neoplásicos. No entanto, o componente inflamatório, quando

presente no esfregaço, se mostrou um fator negativo para o diagnóstico preciso das

neoplasias mamárias. A única amostra 13.957 (Quadro 1) cujo resultado da

avaliação citológica foi inconclusivo contava com grande ulceração e áreas de

necrose pelo tecido, conforme pode ser evidenciado no ANEXO 4 , figura B.

A avaliação citológica pode revelar falsos positivos, uma vez que a

amostra coletada pode não condizer com o processo neoplásico do tecido como um

42

todo. Fato este pode ser evidenciado na amostra 14.134 ( Quadro 1). Neste caso a

punção ocorreu na periferia da lesão.

A avaliação citológica é de grande valia para diagnósticos precoce, mas

no entanto deve ser sempre confirmada com a histopatologia convencional.

A título de comparação, em todas as amostras de mamas aparentemente

normais foram realizadas as colorações histológicas hematoxilina-eosina (HE)

(Figura 4), Tricômio de Masson (MASSON) (Figura 5) e ácido periódico de shiff

(PAS) (Figura 6). Para todas as amostras consideradas normais coletadas durante o

procedimento cirúrgico o exame histopatológico revelou tecido mamário cuja

estrutura é composta por lóbulo pequeno e bem delimitado por tecido conjuntivo

denso. As estruturas glandulares são delicadas e apresentam epitélio monomórfico e

em monocamada, caracterizando um tecido normal.

Figura 4: (HE/40X): Fotomicrografia em aumento de 40X de tecido glandular controle-normal. Percebe-se que a estrutura e composta por lóbulo pequeno e bem delimitado por tecido conjuntivo denso (setas). As estruturas glandulares são delicadas e apresentam epitélio monomorfico e em monocamada

43

Figura 5 (Tricrômio de Masson /40X): Fotomicrografia em aumento de 40X

tecido glandular controle-normal. Tecido conjuntivo perilobular com marcação

intensa azulada (setas).

Figura 6 (PAS/40X): Fotomicrografia em aumento de 40X tecido glandular controle-normal. Marcação pouco intensa de açucares em rosa (setas) em tecido conjuntivo

Em todas as amostras tumorais foram realizadas as colorações

histológicas hematoxilina-eosina (HE) (Figura 7), ácido periódico de shiff (PAS)

(Figura 8) e Tricômio de Masson (MASSON) (Figura 9). Através destas colorações

44

especiais (MASSON e PAS) foi avaliada a presença de tecido conjuntivo, em

especial colágeno e de açúcares, respectivamente, nas amostras tumorais.

Observou-se que nas neoplasias malignas existe marcação de moderada a intensa

para açúcares e de pouco intensa a moderada de colágeno, variando de acordo com

cada caso.

Figura 7- (HE/40X): Fotomicrografia em aumento de 40X de tecido glandular com alto índice de proliferação com característica maciça não permitindo a visualização do tecido conjuntivo (seta) (A). (HE 100X): lóbulos glandulares com difícil distinção. Células neoplásicas com núcleo grande dando uma característica mais basofílica (seta) ao tecido na histologia. Carcinoma papilar simples grau I (B).

Figura 8 (Tricrômio de Masson/40X): Fotomicrografia em aumento de 40X de tecido conjuntivo escasso e com pouca produção de colágeno,marcação pouco intensa (seta). Somente é possível caracterizá-lo na periferia do lóbulo (A) . (Tricrômio de Masson/100X): Fotomicrografia em aumento de 100X de tecido conjuntivo delicado e com moderada quantidade de colágeno (seta).Carcinoma papilar simples grau I (B).

A B

A B

45

Figura 9 (PAS/40X): Fotomicrografia em aumento de 40X. Observamos que tecido conjuntivo perilobular apresenta pouca eosinofilia (A). (PAS/100X): Fotomicrografia em aumento de 100X o tecido conjuntivo de sustentação é delicado e apresenta de grande quantidade de açúcares caracterizados pela intensa eosinofilia (seta).Carcinoma papilar simples Grau 1 (B) Os dados obtidos de todas as colorações das amostras normais estão

agrupados no quadro a seguir (Quadro 2), seguindo o critério adotado de marcação

pouco intensa, moderada e intensa, tanto para tecido conjuntivo, principalmente

colágeno, quanto para açúcares.

46

Quadro 3: Dados obtidos das amostras normais, de acordo com o numero de identificação do animal (numero do prontuário, histopatológico, colorações de PAS e MASSON)

Número do

prontuário

Diagnóstico

histopatológico

(HE)

PAS MASSON

14.217 Tecido mamário normal

POUCO

INTENSA

INTENSA


POUCO

INTENSA

INTENSA


POUCO

INTENSA

INTENSA


POUCO

INTENSA

INTENSA


POUCO

INTENSA

MODERADA


POUCO

INTENSA

INTENSA


POUCO

INTENSA

INTENSA


POUCO

INTENSA

INTENSA


POUCO

INTENSA

INTENSA


POUCO

INTENSA

INTENSA

14.179 Tecido mamário

normal

POUCO

INTENSA

MODERADA

Os dados obtidos de todas as colorações das amostras tumorais estão

agrupados no quadro a seguir, seguindo o critério adotado de marcação pouco

47

intensa, moderada e intensa , tanto para tecido conjuntivo, principalmente colágeno ,

quanto para açúcares.

Quadro 4: Dados obtidos das amostras tumorais, de acordo com o numero de identificação do animal (numero do prontuário, diagnostico citológico, histopatológico, colorações de PAS e MASSON)

Número do

prontuário-

Número da

amostra

Diagnóstico

citológico

Diagnóstico

histopatológico (HE)

PAS MASSON

14.217 –T10 Carcinoma

mamário

Carcinoma


INTENSA POUCO

INTENSA

13.864 –T9 Carcinoma

mamário

Carcinoma


INTENSA POUCO

INTENSA

14.170 -T7 Carcinoma

mamário

Carcinoma túbulo


MODERADA POUCO

INTENSA

14.110-T6 Carcinoma

mamário

Carcinoma tubular

complexo I

INTENSA POUCO

INTENSA

13.943-T3 Carcinoma

mamário

Carcinoma tubular

simples I

INTENSA MODERADA

14.055-T1 Carcinoma

mamário

Carcinoma tubular

complexo I

INTENSA POUCO

INTENSA

14.134-T2 Adenoma

mamário

Carcinoma túbulo

papilífero simples III

INTENSA POUCO

INTENSA

14.289-T5 Carcinoma

mamário

Carcinoma túbulo

papilífero simples II

INTENSA MODERADA

13.957-T8 Inconclusivo Carcinoma

papilíferosimples I

INTENSA POUCO

INTENSA

13.464-T11 Carcinoma

mamário

Carcinoma tubular

simples I

INTENSA MODERADA

14.179-T4 Carcinoma

mamário

Carcinoma tubular

simples I

INTENSA MODERADA

48

Notou-se que as células de uma glândula mamária normal possuem intensa

marcação para tecido conjuntivo e colágeno e marcação pouco intensa para

açúcares segundo as colorações especiais de MASSON e PAS, respectivamente.

Nos carcinomas observamos nitidamente o contrário, fato este que pode ser

explicado pelo hipermetabolismo e intensa produção de açucares pela célula

neoplásica.

Para verificação da existência de correlação entre as colorações de PAS e de

MASSON relacionadas com os subtipos tumorais, foi utilizado o teste estatístico do

Qui-Quadrado (X2), uma vez que as variáveis são qualitativas. As 22 amostras,

sendo 11 normais e 11 tumorais foram avaliadas quanto à marcação pelos corantes

de PAS e MASSON.

Na tabela 1 foram colocadas nas linhas a classificação histológica do tumor e

nas colunas a intensidade de marcação pelo corante de PAS (pouco intensa,

moderada e intensa), e o número de amostras correspondentes:

Tabela 1.Amostras tumorais – Coloração de PAS

PAS INTENSA MODERADA POUCO INTENSA

Carcinoma tubular simples I

3 0 0

Carcinoma papilifero simples II

1 0 0

Carcinoma sólido

1 0 0

Carcinoma túbulo-papilifero simples III

1 1 0

Carcinoma tubular complexo I

2 0 0

Carcinoma papilifero simples I

1 0 0

Carcinoma túbulo papilifero simples II

1 0 0

P=0,55 Não existe diferença estatística

49

De acordo com o valor de p obtido, pode-se concluir que não existe

correlação entre os subtipos histológicos e a intensidade de marcação pelo corante

PAS.

Na tabela 2 foram colocadas nas linhas a classificação histológica do tumor e

nas colunas a intensidade de marcação pelo corante de MASSON (pouco intensa,

moderada e intensa), e o número de amostras correspondentes:

Tabela 2. Amostras tumorais – Coloração de MASSON

MASSON INTENSA MODERADA POUCO INTENSA

Carcinoma tubular simples I

0 3 0

Carcinoma papilifero simples II

0 0 1

Carcinoma sólido

0 0 1

Carcinoma túbulo-papilifero simples III

0 0 2

Carcinoma tubular complexo I

0 0 2

Carcinoma papilifero simples I

0 0 1

Carcinoma túbulo papilifero simples II

0 1 0

P=0,08. Não existe diferença.

De acordo com o valor de p obtido, pode-se concluir que não existe

correlação entre os subtipos histológicos e a intensidade de marcação pelo corante

MASSON. Conclui-se que não existe relação estatisticamente significante entre os

subtipos tumorais e a intensidade de marcação pelo corante MASSON.

Foi avaliado também se existe correlação entre a intensidade de

marcação dos corantes especiais com a presença de carcinomas, comparado com

tecidos normais. A Tabela 3 agrupa em suas linhas as duas possibilidades, tecido

mamário normal e carcinomas de variados graus. Nas colunas a intensidade de

marcação pela coloração de PAS.

50

Tabela 3. Tecido mamário normal x Carcinomas – Coloração de PAS

POUCO INTENSA MODERADA INTENSA

Carcinomas 0 1 10

Tecido mamário

normal

11 0 0

Feito teste Qui-quadrado: p < 0,0001

Através do valor de p obtido pelo teste do qui-quadrado, nota-se que há

forte associação entre as variáveis. O carcinoma está associado à coloração intensa

de PAS, revelando a presença de glicoproteínas e glicogênio desta célula

modificada. Em tecido mamário normal, a coloração em questão mostrou-se com

pouca intensidade de marcação.

Tabela 4. Tecido mamário normal x Carcinomas – Coloração de MASSON

POUCO INTENSA MODERADA INTENSA

Carcinomas 7 4 0

Tecido mamário

normal

0 2 9

Feito teste Qui-quadrado: p < 0,0002

Através do p valor obtido, nota-se que existe associação entre as variáveis. O

tecido tumoral está associado à marcação pouco intensade MASSON, uma vez que

ocorre perda da estrutura tecidual normal da glândula mamária.

De uma maneira peculiar, as células cancerosas produzem energia

preferencialmente pela glicólise anaeróbia em detrimento da fosforilação oxidativa

mitocondrial (WARBURG, 1966; REITZER, 1979; ROSSIGNOL, 2004 ).

A fosforilação oxidativa fornece energia para o citoplasma e a glicólise

anaeróbia para o núcleo. O núcleo parece ser o compartimento mais susceptível à

deficiência de ATP, não somente nas células normais como nas células malignas. A

perda de ATP no núcleo de células malignas possui conseqüências drásticas

51

provocando o impedimento de cruciais funções celulares como a transcrição e a

replicação do DNA.

As células cancerosas apresentam uma grande variedade de estados de

diferenciação, indo de células altamente diferenciadas, em relação a célula da qual o

tumor se originou, com uma glicólise anaeróbia normal e uma baixa taxa de

crescimento; até células altamente indiferenciadas com alta glicólise anaeróbia e

rápida velocidade de crescimento (BAGGETTO, 1992).

A intensidade da marcação de açucares nos tecidos neoplásicos pode ser

explicada pela alta taxa metabólica das células tumorais, principalmente pela alta

capacidade de metabolismo anaeróbico.

As células cancerosas são metabolicamente adaptadas para o rápido

crescimento e proliferação em condições de pH ácido e baixas tensões de oxigênio,

condições nas quais as células normais pouco cresceriam ou mesmo não

conseguiriam sobreviver (GRIFFITHS, 2001)

Em 2004, Isidoro e Cuezva, analisaram marcadores da glicólise e da

mitocôndria em outros tipos de câncer: adenocarcinoma de mama, estômago e

próstata; carcinoma de pulmão e carcinoma epidermóide de esôfago. Quando

comparado com os tecidos normais correspondentes, os autores encontraram

significante diferença na expressão dos marcadores glicolíticos e mitocondriais em

todos esses tipos de câncer. A conseqüência metabólica do impedimento

mitocondrial é o desvio de produção de ATP celular via glicólise anaeróbia.

Segundo Martins, Tamaso e Guerra 2002, em um estudo retrospectivo sobre

a matriz extracelular de carcinomas mamários caninos, quanto maior for a

malignidade neoplásica menor será a presença de tecido conjuntivo estrutural

permeando as células neoplásicas, uma vez que as mesmas possuem alta taxa de

crescimento e o microambiente tecidual com ph extremamente ácido é prejudicial ao

crescimento de matriz conjuntiva, principalmente colágeno.

Em humanos a presença de glicogênio e demais açúcares no tecido

neoplásico mamário está diretamente relacionada com o alto grau de malignidade

(MARKOPOULOS, 2008)

Em um estudo histoquímico de tumores testiculares de cães, foi verificado

presença do componente colágeno de forma desorganizada ao redor do processo

neoplásico, enquanto que ausência do mesmo por entre as células neoplásicas

(STAUT, et al 2008).Estes dados também são observados neste trabalho, ficando

52

evidente a escassez de tecido conjuntivo por entre as células de um carcinoma

mamário.

O estado de hipermetabolismo ou catabolismo persistente é comum em

estados avançados do câncer, isto explica a rapidez das células neoplásicas

malignas em captar glicose como fonte de energia. O aumento desta captação está

relacionado com o grau de malignidade e poder de invasão celular.

A célula tumoral tem como principal substrato energético a glicose,

consumindo de 10 a 50 vezes mais em relação ás células normais. Dependendo do

tamanho do tumor e do estágio da doença a produção da glicose é maior. O

consumo excessivo de glicose pelo tumor aumenta a produção de glicose hepática a

partir do lactato e de aminoácidos musculares do hospedeiro, podendo levar o

paciente à caquexia ( GIBNEY, 2007; DA SILVA, 2005).

Com estas análises pode-se afirmar que existem diferenças significativas de

intensidade de coloração entre tecido mamário normal e tecido mamário neoplásico.

No entanto, as mudanças de intensidade de marcação do tecido tumoral não têm

correlação com o subtipo histológico. Desta forma, passamos a avaliar marcadores

moleculares que pudessem ser utilizados para classificação dos subtipos de tumores

encontrados nessa casuística.

7.3 ESTUDO EPIGENÉTICO

7.3.1 - Quantificação e avaliação da integridade de DNA genômico

Nesse estudo foi padronizada a lise dos fragmentos de tecidos normais e

tumorais com proteinase K em tampão de lise. Após a lise das células, o DNA

genômico foi extraídopelo método fenol-clorofórmio, pois apesar de ser um método

antigo e tradicional, é o método que obtemos um grau maior de pureza do DNA

obtido. Após, foi realizada a leitura espectrofotométrica em absorbância de 260nm e

calculada a concentração do DNA em ng/ml. Para o cálculo da mesma, utilizamos a

seguinte fórmula: Concentração DNA (ng/ul) = Abs(260nm) X 50 (fator de correção

para DNA) X 40 (diluição). Este método se mostrou muito eficaz e forneceu amostras

de DNA íntegros de alta qualidade (Figura 13 – gel de agarose)

53

Neste trabalho foram obtidos o DNA genômico das amostras a seguir, sendo

que para cada paciente, foram analisadas 2 amostras, sendo uma tumoral (T) e a

outra normal (N). Os números de prontuário dos animais estão representados em

conjunto com a nomenclatura das amostras:

Tabela 5 – Dados de leitura espectrofomêtrica do DNA genômico obtido de tecidos

normais (N) e tumorais (T) da mama de cadelas.

Amostras-

n.prontuário

Diagnóstico

histopatológico

Abs 260

nm

Abs

280

nm

Concentração

ng/ul

N1- 14.055 Tecido mamário normal 0,9 0,533 1800

T1- 14. 055 Carcinoma tubular

complexo I

0,107 0,021 214


T2- 14.134 Carcinoma túbulo

papilífero simples III

0,319 0,143 638


T3- 13.943 Carcinoma tubular

simples I

0,5 0,243 1000


T4- 14.179 Carcinoma tubular

simples I

0,464 0,292 928


T5- 14.289 Carcinoma túbulo

papilífero simples II

0,166 0,052 332

N6-14.110 Tecido mamário normal Erro

técnica

T6-14.110 Carcinoma tubular

complexo I

Erro

técnica

N7-14.170 Tecido mamário normal 0,824 0,399 1648

T7-14.170 Carcinoma túbulo


0,879 0,474 1758


T8-13.957 Carcinoma 0,796 0,385 1592

54

papilíferosimples I


T9-13.864 Carcinoma


0,901 0,560 1802


T10-14.217 Carcinoma


0,688 0,310 1375

Determinação da concentração do DNA em ng/ul, utilizando-se a fórmula:

Concentração DNA (ng/ul) = Abs(260nm) X 50 (fator de correção) X 40

(diluição), onde T = tecido tumoral e N= tecido normal

A análise da integridade dessas amostras pode ser visualizada por

eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio (Figura 10). Pode se

observar bandas de alto peso molecular (acima de 23 kb, setas amarelas Figura 10)

demonstrando a presença de DNA de excelente qualidade para prosseguimento dos

estudos moleculares.

Figura 10: Eletroforese em gel de Agarose corado com brometo de etídio. As

amostras de DNA genomico (setas brancas) foram aplicadas nas canaletas de 1-4,

gel 1 e 2-6 gel 02).Bandas de 23 Kb (setas amarelas).

T3 N1 N5 N2 PM T 2 N3 T5 T1 PM T4

Gel 01 Gel 02

55

7.3.2 - Avaliação do perfil de metilação por MSAP-PCR

Padrões de metilação do DNA foram gerados pela técnica de MSAP-PCR

utilizando primer aleatório MGE-2 e eletroforese em gel de poliacrilamida corado

pela prata. Utilizamos a enzima MseIcujo sítio de reconhecimento está representado

no DNA genômico humano com uma alta frequência. A geração desseperfilde

bandas permitiu a diminuição da complexidade da análise,embora a exploração de

mais regiões genômicas diferencialmente metiladas seja restringida pelo tratamento

com essa enzima.

As enzimas HpaII e MspI são isoesquizômeros, ou seja, reconhecem a

mesmasequência de DNA. Desta forma, os fragmentos gerados por MseI que

apresentam sitio para estas enzimas, devem necessariamente ser digeridos com

MspI (enzima não sensível a metilação). Esta cliva o fragmento independentemente

de estar ou não metilado. Se os fragmentos estiverem metilados, a enzima HpaI

(sensível a metilação), não irá digerir o DNA, mas se o fragmento estiver

desmetilado essa enzima reconhecerá o sitio e irá clivar o DNA, não gerando bandas

após a amplificação do DNA por PCR. Desta forma, através da análise do padrão de

bandas geradas é determinado o perfil de metilação de diversos fragmentos gênicos.

O perfil de bandas gerado por MSAP-PCR foi comparado entre amostras

normais (N) e os subtipos tumorais (T), de acordo com a classificação histológica

convencional, conforme mostra tabela 5.

Neste estudo foi demonstrado alteração do padrão de metilação de

fragmentos gênicos provenientes de tecidos normais e tumorais. Essa alteração

pôde ser observada tanto por um padrão de metilação em amostras tumorais e

hipometilação em tecido normal (banda de 340pb). Ou pela presença de fragmentos

hipometilados em tumor e metilados em tecido normal (banda de 600pb – Figura 11).

56

Eventos de alteração no padrão demetilação do DNA em células tumorais já é

bem conhecido em diversos tipos de neoplasias malignas. Tem sido mostrado que o

padrão de metilação do DNA é invertido, havendo hipermetilação de promotores

ricos em CG e hipometilação geral do genoma, contribuindo para uma instabilidade

genômica. Ainda, este processo alterado de metilação não é aleatório e a

hipermetilação específica de genes (por exemplo: genes supressor de tumor) parece

estar associada com a tumorigênese, facilitando o processo de invasão e metástase

(OLIVEIRA, et al, 2010) (COSTA, 2010). Os estudos sobre marcadores

moleculares em neoplasias mamárias na medicina veterinária vêm ganhando cada

vez mais espaço, uma vez que a busca por um prognóstico mais acurado e por um

tratamento mais personalizado cresce a cada dia.

Neste trabalho foram identificadas regiões genômicas que apresentaram

padrão de metilação alterado entre os subtipos tumorais. Foi mostrado um fragmento

de aproximadamente 400pb que se apresentou metilado na amostra de tumor sólido

(T9) e desmetiladas nas demais amostras tumorais, do tipo tubular (T3e T4) e

papilífero (T8) (Figura 12).

Figura 11: Banda de 600pbmetilada em amostras normal e desmetilada no tecido

tumoral

250 pb

500 pb

57

Observou-se também uma banda de 390 pb que estava metilada em

amostras tubulares complexas II (animal 3 e 4) e desmetilada em amostras de

tumores papilíferos (animal 8). Todos esses fragmentos representam potenciais

marcadores específicos de subtipos de tumores de mama canino e, futuros estudos

para sua identificação através de sequenciamento devem ser realizados.

Figura 12 – Bandas de 400pb, indicando metilação em carcinoma sólido e

desmetilação nas demais amostras tumorais tubulares e papilíferas

58

Figura 13 = Banda de 390pbmetilada em amostras de carcinomas tubulares

complexos e desmetilados em carcinomas papilíferos

O fenótipo dos tumores mamários em humanos está intimamente ligado com

o padrão de metilação encontrado nas ilhas CPG. Foi comprovado que os tumores

mamários em seres humanos possuem diferente padrão de metilação das ilhas CpG

(PARK, 2012). Em um estudo comparativo entre o perfil de metilação e fenótipo

tumoral, Baeet al em 2004 demonstrou que o gene BRCA1 mostrou-se com um perfil

de hipermetilação em carcinomas mucinosos, cujas células neoplásicas estão

depositadas sobre muco, comparado com carcinomas ductais em seres humanos

(BAE, et al, 2004). Em um outro estudo, a metilação aberrante do DNA foi associada

com os subtipos tumorais classificados de acordo com critérios clinico-patológicos de

câncer de mama em humanos. A expressão de bcl-2 e de receptores hormonais esta

associada com o grau de metilação do gene SFRP1 (JEONG, et al 2013). É possível

que as mesmas alterações aconteçam em cadelas, uma vez que existe grande

similaridade entre os tipos celulares dos tumores mamários caninos e humanos.

Esses estudos demonstram a identificação de possíveis marcadores de

subtipos tumorais com padrão de hipermetilação e hipometilação. Além disso, os

estudos mostram uma diminuição global da metilação em todo o genoma em muitos

tumores, entretanto, eles não fornecem informações sobre onde a hipometilação

ocorre (SOARES et al. apud PLASS et al., 2002). Os fragmentos genicos

observados neste trabalho podem representar novas regiões do DNA tumoral com

59

padrão de hipometilação. Foi observada uma banda de 600pb desmetilada em todos

os subtipos tumorais (tubular, papilífero e sólido) avaliados. Outra banda de 400pb

também apresentou padrão de hipometilação em tumores papilíferos e tubulares,

mas não em sólido. E uma banda de 390pbapresentou-se desmetiladasomente em

tumorpapilífero.

Estudos posteriores de identificação desses marcadores se fazem

necessários para caracterizar marcadores moleculares de classificação de subtipos

tumorias de tumores mamários caninos e identificar novas regiões hipometiladas no

DNA genômico da célula tumoral.

8 CONCLUSÃO

O presente estudo demonstrou que existe uma concordância entre os

diagnósticos citológico e histopatológico na ordem de 82%., de acordo com a

literatura. Em amostras tumorais, à coloração HE, nota-se perda da estrutura

tecidual lobular mamária, perda de organização tecidual, estratificação do tecido,

pleomorfismo celular, condizentes com carcinomas.

Com as colorações especiais de PAS e MASSON, observa-se diferença

significativa entre amostras normais e tumorais. Em tecido normal existe marcação

intensa para MASSON e pouco intensa para PAS. Em tecido tumoral existe

marcação intensa para PAS e pouco intensa para MASSON. No entanto a

intensidade de coloração tanto para PAS quanto para MASSON, não tem

correlaçãocom os subtipos histológicos estudados.

O estudo epigenético revelou alterações no perfil de metilaçãodos tecidos

normais e tumorais da glândula mamária canina. Foram constatadas bandas com

padrão de metilação específico de subtipos tumorais. Padrão metilado em tumor

sólido e em tumores tubulares complexo I. Epadrão desmetilado em tumor papilífero,

fato este que reforça ainda mais a necessidade do prosseguimento dos estudos,

afim de identificar genes com perfil de metilação alterado, e com isso, buscar

marcadores moleculares para a espécie canina.

60

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67

10 ANEXO 1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) do proprietário ou responsável pelo animal TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (modelo)

Título da Pesquisa: “Avaliação de padrões de metilação de DNA alterados em

neoplasias mamárias de cadelas”

Nome do (a) Pesquisador (a) Responsável: .Susana Nogueira Diniz. RG 1.15.615.

CPF 685656666-20. Uniban, Rua Maria Cândida 1813 - Vila Guilherme, São Paulo

Fone: 2967-9147

Nome dos demais participantes: Rodrigo Casemiro Pinto Monteiro. RG 29.213.092-

2.CPF 316.053.768-41. Uniban, Rua Maria Cândida 1813 - Vila Guilherme, São

Paulo Fone: 2967-9147

1. Natureza da pesquisa: o Sr. (sra.) está sendo convidada (o) a autorizar a

participação de seu(s) animal(is) nesta pesquisa que tem como finalidade avaliar

alterações de mecanismos epigenéticos no DNA da célula tumoral para buscar

biomarcadores de diferentes tipos tumorais.

2. Identificação do(s) animal(is): (identificar espécie, sexo, raça, quantidade,

nome ou número de registro (se for o caso).

3. Envolvimento na pesquisa: ao participar deste estudo o Sr. (Sra.) permitirá ao

(a) pesquisador (a) aproveite do material biológico que seria descartado para

extração do DNA da célula tumoral da mama de sua cadela. O Sr. (Sra.) tem a

liberdade de se recusar a participar e ainda se recusar a continuar participando

em qualquer fase da pesquisa, sem qualquer prejuízo para o seu animal. Sempre

que quiser poderá pedir mais informações sobre a pesquisa através do telefone

do (a) pesquisador e, se necessário, através do telefone da Comissão de Ética

no Uso de Animais (CEUA).

4. Riscos e desconforto: a participação nesta pesquisa não traz complicações

legais. Os termos de concordância com a realização do procedimento cirúrgico e

68

os riscos que este procedimento confere estão anexados e o Sr. (Sra.) também

deverar assinar. Os procedimentos adotados nesta pesquisa obedecem à

Resolução 879, de 15 de fevereiro de 2008.e à Lei Federal 11794, de 08 de

outubro de 2008.

5. Confidencialidade: todas as informações coletadas neste estudo são

estritamente confidenciais. Somente os pesquisadores terão conhecimento dos

dados.

6. Benefícios: esperamos que este estudo traga informações importantes sobre as

alterações epigenéticas em diferentes tipos tumorais, e, devido às semelhanças

com os tumores de mama na mulher,o conhecimento que será construído a partir

desta pesquisa poderá trazer constribuições importantes para diagnóstico,

tratamento, prognóstico e prevenção das neoplasias mamarias malignas.

7. Pagamento: o Sr. (Sra.) não terá nenhum tipo de despesa para participar desta

pesquisa, bem como, nada será pago por sua participação. Somente o

procedimento cirúrgico será custeado pelo Sr. (Sra.)Após estes esclarecimentos,

solicitamos o seu consentimento de forma livre para participar desta pesquisa.

Tendo em vista os itens acima apresentados, eu, de forma livre e esclarecida, manifesto meu consentimento em participar da pesquisa. ___________________________ Nome do Proprietário (CPF/RG) ______________________________ Assinatura do Proprietário __________________________________ Assinatura do Pesquisador Data: _____________________. TELEFONES Pesquisador: Susana Nogueira Diniz – 89758844 Rodrigo Monteiro – 8444-5050 CEUA: 2967-9022__________

69

11 ANEXO 2 – PARECER CEUA

70

12 ANEXO 3 – FOTOS DO PRÉ-CIRÚRGICO DAS PACIENTES PORTADORAS DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS DO ESTUDO

B A

C D

E F

71

13 ANEXO 4: FOTOS DAS PEÇAS PÓS-CIRÚRGICAS ENVIADAS PARA EXAME HISTOPATOLÓGICO (COLUNA B) E DAS AMOSTRAS PARA ESTUDO EPIGENÉTICO (COLUNA A)

A B

UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO · Figura 2 Aspecto macroscópico de neoplasia mamária...

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