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Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em

Culturas de Células

Porto, 30 de Julho de 2008

13º Encontro das Ciências

13º Encontro das Ciências 22

Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células

Curso: Mestrado em Engenharia Biomédica da Universidade do PortoAluna: Adriana Alexandre dos Santos Tavares

Orientador:João Manuel R. S. TavaresProfessor Auxiliar do Dep. de Engenharia Mecânica e Gestão Industrial da FEUP

Co-Orientador:Luís F. MetelloProfessor Adjunto do Curso de Medicina Nuclear da ESTSP


Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células

• Conteúdos da Apresentação:

– Culturas de Células;– Ciclo Celular;– Possíveis Destinos Finais das Células Irradiadas;– Apoptose ou Morte Celular Programada – Principais Vias para Início;

• Apoptose e Necrose;– Radiofármaco;

• Radiofármaco ideal para terapêutica com electrões de Auger– Citometria de Fluxo;– Procedimento de Irradiação;– Estudos de Influxo e Efluxo;– Análise da Apoptose Radioinduzida;– Conclusões Finais;– Perspectivas Futuras.


Cultura de Células

• Cultura células – o que são?

– Tipo de cultura de tecidos que envolve um conjunto de técnicas quepermitem cultivar e/ou manter células isoladas fora do organismo deorigem.

– Remover células de fragmentos de órgãos antes ou durante a cultura,com concomitante separação das células vizinhas.


Tipos de Cultura de Células

• Culturas Primárias

– Obtidas por recolha cirúrgica de pequenas peças de tecido;

– Culturas inicialmente heterogéneas, com o tempo tornam-se dominadas por fibroblastos;

– Tempo de sobrevivência in vitroreduzido;

– Propícia a desenvolvimento de contaminações.

• Linhas Celulares

– Crescimento rápido e contínuo;– Proliferação limitada (cerca de 30

divisões celulares) ou ilimitada (ex: células tumorais);

– Mais homogéneas, estáveis e reprodutíveis que culturas primárias;

– Elevada disponibilidade.


Tipos de Cultura de Células

Culturas Primárias

Linhas Celulares


Culturas de Células

Tipos cultura celular

Epiteliais – aderemao substrato e

apresentam formaachatada e poligonal

Linfoblásticas – nãoaderem ao substrato,

permanecem em suspensão comforma esférica

Fibroblásticas – aderem ao substrato, são

alongadas e bipolares

Culturas celulares podem apresentar-seem duas formas:

• Em suspensão;

• Em monocamada aderente.


Vantagens e Desvantagens daCultura de Células• Vantagens:

– Controlo das condiçõesambientais;

– Análise de parâmetrosindependente;

– Número de testes elevado,num reduzido intervalo detempo;

– Redução dos ensaios comanimais menosdispendiosa.

• Desvantagens:

– Perda das característicasfenotípicas celulares;

– Sistema fora do ambientenatural.


Ciclo Celular

• Definição: conjunto de transformações dinâmicas e contínuas quedecorrem desde a formação da célula até ao momento em que ela própria,por divisão, origina duas células-filhas carácter cíclico, com períodos decrescimento e de divisão.


Ciclo Celular

Ciclo Celular

Interfase Fase mitótica

Profase – Encurtamento cromossomas;Metafase – Formação fuso acromático;

Anafase – Clivagem dos centrómeros e ascensãocromossomas-fihos;

Telofase – Reorganização da membrana, célula com 2 núcleos;

Citocinese – divisão citoplasma;

Intervalo G1 – Período entre final da mitose e início fase S,

actividade biossintética;Fase S - Replicação do ADN;

Intervalo G2 – final da síntese de ADN e início divisão celular,

síntese de biomoléculas paradivisão celular;


Ciclo Celular - Mitose

Telofase

Profase Metafase Anafase

Citocinese


Ciclo Celular• Células de mamíferos

em cultura

• Fase G1 1 a 8 horas;• Fase S 6 a 8 horas;• Fase G2 2 a 4 horas; • Fase M < 1 hora.

• Total ≈ 10 a 20 horas A célula prepara-se para se dividir

Mitose

A célula divide-se

Início ciclo celular

A célula aumenta de tamanho, biossíntese

Célula retida

A célula decide se prossegue ou não no ciclo

celularA célula replica o seu ADN


Possíveis Destinos Finais de CélulasIrradiadas

• Ausência de efeito;• Atraso na divisão;• Apoptose;• Falha reprodutiva;• Instabilidade genómica;• Mutação;• Transformação;• Efeito bystander;• Respostas adaptativas.


Apoptose ou Morte Celular Programada –Principais Alterações Morfológicas

• Encurtamento celular devido a destruição dos filamentos de actina e lâminas docitoesqueleto;

• Quebra da cromatina no núcleo que conduz frequentemente a condensaçãonuclear e, muitas vezes, o núcleo celular toma uma aparência em “ferradura”;

• Contínuo encurtamento celular para permitir posterior remoção pelos macrófagos;

• Na fase final da apoptose surgem pequenas “esferas membranadas”, que formampequenas vesículas, denominadas corpos apoptóticos.

Apoptose de um trofoblasto


Stress Celular (exemplo: radicais

livres e depleção factor crescimento)

Infecção vírus

Receptores de Morte Celular

Receptores de Morte Celular

Radiação ionizante

Célula T

Apoptose ou Morte Celular Programada –Principais Estímulos


Apoptose ou Morte Celular Programada –Principais Vias para Início

Apoptose

Iniciada via receptores demorte

Iniciada por estímulos agentesexternos (ex: radiação)


Apoptose e Necrose

Normal

Normal

Edema reversível Edema Irreversível Desintegração

Condensação Fragmentação Corpos Apoptóticos


Radiofármaco

• Dois componentes:

– Radionuclídeo emissões energéticas corresponder aosobjectivos esperados e ao detector de radiação utilizado.

– Fármaco seleccionado, com base na sua localizaçãopreferencial num dado tecido ou órgão ou na participaçãofisiológica que terá sobre determinadas células ou receptores.


Electrões de AugerElectrões de

Auger

Captura electrónica

Conversãointerna

Conversão interna

• Fotões emitidos pelo núcleo durantedecaimento radioactivo colidem com oselectrões das orbitais mais internas;

• Colisão com electrões das orbitais maisinternas conduz à ejecção dos mesmos;

• Electrões ejectados com energia de keV– superior aos electrões de Auger, masinferior às partículas beta menos.

Captura electrónica:

• Cria-se uma lacuna numa orbital mais interna,devido a transferência de 1 electrão para o núcleo;

• Transição de electrões de orbitais mais externaspara preencher lacuna;

• Diferença de energias entre transições pode serlibertada sob a forma de fotão ou electrões deAuger – electrões de baixa energia.

Exemplos emissores de electrões de Auger: 201Tl, 111In, 99mTc, 67Ga…


Electrões de Auger – Estado da Arte…

• Buchegger e colaboradores, 2006

– Alcance das partículas emitidas e sua relação com tamanho celular – efeito de crossfire;



• Buchegger et al, 2006; Kassis et al, 2003;Boswell et al, 2005; Ginj et al, 2005; Chen etal, 2006; Mariani et al, 2000; O’Donnell et al,2006…

– Electrões de Auger no citoplasma – baixo LET

– Electrões de Auger no núcleo – alto LET

– Efeito by-stander.

99mTc – relação 94 vezes



• Humm et al, 1994;



• Humm et al, 1994

Radionuclídeo C←C(Gy/Bq •s)

C←CS(Gy/Bq •s)

N←N(Gy/Bq •s)

N←Cy(Gy/Bq •s)

N←CS(Gy/Bq •s)

51Cr

67Ga

1.06×10-3

1.86×10-3

5.39×10-4

9.94×10-4

2.04×10-3

3.45×10-3

1.44×10-4

6.32×10-4

2.49×10-8

2.64×10-4

99mTc 8.16×10-4 4.23×10-4 1.55×10-3 8.68×10-5 4.76×10-5

111In

123I

125I

201Tl

203Pb

1.47×10-3

1.56×10-3

3.51×10-3

4.24×10-3

2.67×10-3

8.03×10-4

8.36×10-4

1.86×10-3

2.29×10-3

1.40×10-3

2.70×10-3

2.93×10-3

6.60×10-3

7.83×10-3

5.03×10-3

3.03×10-4

2.72×10-4

5.94×10-4

1.29×10-3

7.14×10-4

1.94×10-4

1.40×10-4

2.62×10-4

6.91×10-4

3.21×10-4


Radiofármaco Ideal para Terapêuticacom Electrões de Auger

• Electrões emitidos pelos radionuclídeos com menos de 40 keV;

• Razão entre a emissão fotónica/electrão inferior a 2;

• Semi-vida física entre 30 minutos e 10 dias;

• Nuclídeo-filho estável e com semi-vida física superior a 60 dias;

99mTc – electrões com energias entre 0.9 e 15.4 keV

99mTc – semi-vida física de ≈ 6 horas

99Tc – semi-vida física de ≈ 2.111×105 anos


Radiofármaco Ideal para Terapêuticacom Electrões de Auger

• Química adequada aos processos de radiomarcação;

• Radionuclídeo economicamente preparado com elevada actividade específica;

Mais de 80% dos estudos em Medicina Nuclear são realizados com agentes marcados com 99mTc

99mTc – amplamente disponível no serviço de Medicina Nuclear – Gerador 99Mo-99mTc

99mTc ??

• Molécula transportadora deve apresentar umabiodistribuição selectiva para o tecido alvoagente deve associar-se com o complexo do ADNdurante um determinado período de tempoconsistente com a semi-vida física doradionuclídeo.


Citometria de Fluxo

• Técnica utilizada para contar,examinar e classificar partículasmicroscópicas suspensas num meiolíquido em fluxo.

• Através de um aparelho de detecçãoóptico-eletrónico é possível analisarcaracterísticas físicas e/ou químicasde uma simples célula.


Citometria de Fluxo

Comparação da Citometria Fluxo e Microscopia Clássica

Microscopia Clássica Citometria de Fluxo

Detecção visual Detecção electrónica

Centenas de células analisadas Milhares e milhões de células analisadas

Análise qualitativa Análise quantitativa

Células imobilizadas na lâmina e contadas manualmente

Células em suspensão, passam individualmente em frente ao laser do citómetro de fluxo


Procedimento de Irradiação

Linhas de fibroblastos

grande resistência e sobrevivência em meio de cultura

interpretar os resultados obtidos como efeitos da irradiação

99mTc

Eluição gerador 99Mo-99mTc

99mTc-Pertecnetato de sódio adicionado aos meios de

cultura celular


Procedimento de Irradiação

• Culturas de fibroblastos expostas a actividades de 740, 1480, 2220, 2960 e3700 MBq/ml (20, 40, 60, 80 e 100 mCi/ml) de 99mTc;

• Concluído o processo de irradiação determinar quais as doses ideaisde irradiação;

• Irradiar apenas com as doses ideais e para diferentes doses absorvidas,que se prevê situarem entre 1 e 2 Gy, utilizando-se intervalos cada 0.5 Gy.


Estudos de Influxo e Efluxo

• Estudo de influxo

• Quantidade de 99mTc-Pertecnetato deSódio que penetrou a membranacelular.

• Estudo de efluxo

• Quantidade de 99mTc- Pertecnetatode Sódio que entrou na célula, masfoi de seguida expulso para o seuexterior.

Compreender a capacidade de difusão do radiofármaco pela membranacelular e sua consequente captação por parte da célula.

Centrifugação amostras cultura de células.


Análise da Apoptose Radioinduzida

• Citometria de fluxo com recurso à técnica da dupla marcação com anexina V e iodeto de propídio.

Reagente

Diagnóstico Celular Anexina V Iodeto de Propídio

Células Viáveis

Início de Apoptose

Final Apoptose e Necrose


Conclusões Finais

• Linhas celulares grande disponibilidade e elevada capacidade dereprodutibilidade.

• Radiação apoptose, pela indução de danos ao ADN irreparáveis.

• Crescente interesse da comunidade científica relativamente aosradionuclídeos emissores de electrões de Auger, dos quais o 99mTc fazparte.

Pertinência e relevância da presente Dissertação


Conclusões Finais

• Citometria de Fluxo

– Iodeto de propídio e anexina V

• Determinar de forma rápida e correcta o número de células viáveis, onúmero de células em estádios inicias de apoptose e as células emestádios finais de apoptose ou em necrose presentes numa cultura decélulas.

• Espera-se que este seja o principal método a utilizar para a avaliação dosefeitos dos electrões de Auger do 99mTc em culturas de célulasseleccionadas.

13º Encontro das Ciências 34Trabalhos Práticos 34

Perspectivas Futuras

1. Contribuição para a criação de um texto de revisão actualizado ecompleto sobre o tema da Dissertação;

2. Melhorar o conhecimento actual do papel do 99mTc enquanto agenteirradiante no contexto terapêutico, pela análise dos efeitosradiobiológicos em culturas de células seleccionadas;

3. Utilização de técnicas de citometria de fluxo para avaliação dos efeitosda radiação na célula, nomeadamente, a indução da apoptose;

4. Estudo de efluxo e influxo do 99mTc-Pertecnetato de Sódio em culturasde células, de forma a relacionar o seu papel enquanto agenteterapêutico com a sua dinâmica celular.


Referências• Anazetti, M. C. (2007). "Morte Celular por Apoptose: uma visão bioquímica e molecular." Metrocamp Pesquisa 1(1): 37-58.• Baatout (2004). "Cytometric methods to analyze radiation effects." Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents 18(2): 101-105.• BD, B. (2007). "Annexin V - Introduction." Annexin V Retrieved 26 June 2008, from http://www.bdbiosciences.com/features/products/display_product.php?keyID=48.• Besta, I. N. N. C. (2004). Detection of Contaminants in Human Cell Culture. L. P. f. H. C. Culture. Marina Mora, EuroBio Bank.• Caprioglio, D. (2008). "Fluorescence in Biology." Retrieved 26 June 2008, from http://csm.colostate-pueblo.edu/biology/dcaprio/412L/Fluor1.html.• Coder, D. (1997). Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons.• Coimbra, U. (2008). "Noções básicas de cultura de células." Retrieved Maio 2008, from https://woc.uc.pt/bioquimica/getFile.do?tipo=2&id=523.• Dash, P. (2008). "Apoptosis." Reproductive and Cardiovascular Research Group Retrieved Maio 2008, from http://www.sgul.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/.• Freshney, I. (2006). Basic Principles of Cell Culture. Culture of Cells for Tissue Engineering. G. V.-N. e. I. Freshney, Jon Wiley and Sons.• Hanon E., V. A., Pastoret P. (1996). "The Use of Flow Cytometry for Concomitant Detection of Apoptosis and Cell Cycle Analysis." Biochemica 2(Technical Tips): 25-27.• Hartung, T. (2002). "Good Cell Culture Practice." ATLA 30: 407-414.• Howell, R. (1992). "Radiation Spectra for Auger-Electron Emitting Radionuclides: Report No.2 of AAPM Nuclear Medicine Task Group No.6." Medical Physics 19(6):

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http://csm.colostate-pueblo.edu/biology/dcaprio/412L/Fluor1.html

http://www.sgul.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/

http://www.pathology.vcu.edu/education/lymph/documents/Flow.pdf

http://www-naweb.iaea.org/nahu/dmrp/pdf_files/Chapter14.pdf

http://pt.wikipedia.org/wiki/Centr%C3%ADolo

FIM

Obrigada pela vossa atenção!

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