BIOLOGIA MOLECULAR BREVE INFORMAÇÃO. BIOLOGIA MOLECULAR BREVE INFORMAÇÃO.
Aplicação das Técnicas de Biologia Molecular no ...
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Aplicação das Técnicas de Biologia Molecular no diagnóstico de Doenças Infecciosas: Digestão de DNA / Clonagem / Genotecas
IMT-2003; Aula 03
Paulo Cotrim, Mç/2018
Princípios básicos de Biologia Molecular
GENE GENOTECA
SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS SONDA DE DNA
PEPTÍDEO SINTÉTICO OLIGONUCLEOTÍDEO
ANTICORPOS MONOCLONAIS SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS
PROTEÍNA
Como já foi bastante comentado, os métodos de biologia molecular dependem do (e foram
desenvolvidos com base no) entendimento das propriedades das moléculas biológicas
Princípios básicos de Biologia Molecular
Cromossomo – gene – DNA – RNA - Proteína
promotor gene
Op. AUG
O.T.
DNA
mRNA
S.T.
Pós - genômica
Genômica identificação e sequenciamento de genes
Proteômica identificação e sequenciamento de proteínas
Transcriptômica produtos de transcrição / fase de desenvolvimento
Metabolômica estudo de produtos metabólicos em sistemas biológicos
Fármaco-genômica interação genética indivídual em resposta a 1 droga
Toxigenômica susceptibilidade individual de um composto
Regulômica estudo ‘instruções’ bioquímicas envolvidas em uma célula
Peptidômica estudo de peptídeos (hormonios, venenos, citoquinas, etc)
Degradômica identificar proteases e substratos alvos terapeuticos
Fisiômica funções fisiológicas de uma organismo vivo
Nutrigenômica nutrição especifica de acordo com o genoma...
Epigenômica funciona/o do genoma como um todo (genotipo / fenotipo)
Pós - genômica
Pós – genômica :ProteômicaBio informática
Pode gerar informações importantes sobre:
Quais proteínas são expressas.
Níveis de expressão dessas proteínas.
Modificações pós-traducionais - fosforilação / glicosilação / etc.
Respostas expressas pelas células em diferentes situações ou tratamentos.
Diferenças moleculares entre linhagens celulares.
Interação gênica.
Proteômica
Necessidade de investigar o controle da expressão
gênica e seus impactos no metabolismo celular
Análise de proteínas por Espectrometria de Massas (MALDI-ToF)
Proteômica
Bio - informática
• Junção da ciência computacional com Bio-Mol. Utiliza
conhecimentos da física, biologia, química,
informática, ciência da computação e matemática.
• É também chamada de Biologia “in Silico”
• Buscando tratar os dados, desenvolve softwares para:
- Identificar genes
- Prever a configuração tridimensional de proteínas
- Organizar e relacionar informação biológica
- Agrupar sequências homólogas
- Montar árvores filogenéticas
- Analisar experimentos de expressão gênica
NCBI Website
Software BLAST basic local alignment search tool
GENE
PROTEÍNA
Padrão de Digestão : RFLP
Seq. de Nucleotídeos : Genotipagem
PCR :
Hibridização : Southern, Northern, Dot-Blot
Síntese de Peptídeos
Expressão Gênica : Análise funcional
Proteoma :
mas como conseguir esses dados ????
Tecnologia do DNA Recombinante -
Ferramentas Biotecnológicas - enzimas; vetores,
Fontes de DNA - genotecas; DNA sintético
Seleção de um clone - varredura (screening)
Expressão do produto gênico -
Aplicações da Engenharia Genética - em terapia e diagnóstico médico
Questões de Segurança e Ética -
O Futuro da Biotecnologia ...............
Definição de clonagem molecular: A clonagem molecular é o processo de construção de moléculas de DNA recombinante e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a seleção do DNA recombinante.
Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter organismos transgênicos e realizar terapia gênica.
Expressões utilizadas com o mesmo significado:
clonagem molecular
engenharia genética
manipulação gênica
clonagem gênica
tecnologia do DNA recombinante
modificação genética
Clonagem molecular: DEFINIÇÃO
1- Sistemas de Restrição e de Modificação (Enzimas
de Restrição, Ligase, Polimerases, etc)
2- Vetores de Clonagem
3- Métodos de transformação de células eucarióticas e
procarióticas
Clonagem molecular: VIABILIZAÇÃO
descobertas e desenvolvimentos importantes para viabilizar o processo de clonagem molecular
G e n o t e c a
EcoRI Significado Descrição
E Escherichia Gênero
co coli Espécie
R RY13 Cepa
I 1ª identificadaOrdem de
identificação
EcoRV5‘ GATATC
3‘ CTATAG
5'---GAT ATC---3'
3'---CTA TAG---5'
EcoP15 I5'CAGCAGN25NN
3'GTC GTCN25NN
5'---CAG CAG N25NN ---3'
3'---GTC GTC N25 NN---5'
Sau3A5'GATC
3'CTAG
5'--- GATC---3'
3'---CTAG ---5'
http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html
1 - Genoteca: genômica – Enzimas de restrição
1 -
Gen
ote
ca:
gen
ôm
ica
-E
nz.
res
triç
ão
1- Sistemas de Restrição e de Modificação (Enzimas
de Restrição, Ligase, Polimerases, etc)
2- Vetores de Clonagem ????????
3- Métodos de transformação de células eucarióticas e
procarióticas
Clonagem molecular: VIABILIZAÇÃO
descobertas e desenvolvimentos importantes para viabilizar o processo de clonagem molecular
BIOLÓGICO -
qualquer ser vivo que transmite doenças;
meio de transporte de doenças, ou de componente bológico.
O que é um vetor ???????????
Vetores Sticker Bomber
FÍSICA –
representação matemática de uma grandeza vetorial
grandezas que para serem completamente definidas
necessitam de especificação de seu módulo, direção e
sentido – deslocamento, velocidade, força, etc....
bacteriofago
Os plasmídeos ou plasmídios
são moléculas circulares duplas
de DNA capazes de se
reproduzir independentemente
do DNA cromossómico
vetor plasmídio
1- Sistemas de Restrição e de Modificação (Enzimas
de Restrição, Ligase, Polimerases, etc)
2- Vetores de Clonagem
3- Métodos de transformação de células eucarióticas e
procarióticas ????????
Clonagem molecular: VIABILIZAÇÃO
descobertas e desenvolvimentos importantes para viabilizar o processo de clonagem molecular
Frederick Griffith, 1928
A descoberta do ‘princípio transformante’ em bactérias
www.educacaopublica.rj.gov.br
/oficinas/biologia/experimentos
1/animacoes/a_experiencia_de
_griffith.html
A recombinação gênica em bactérias
transdução
conjugação
transformação
Etapas na construção de uma Genoteca
plasmídio
Plasmídeos: moléculas
de DNA circular capazes
de reprodução
independente do DNA
bacteriano
E pra que tudo isso ?????
GENE
PROTEÍNA
Padrão de Digestão : RFLP
Seq. de Nucleotídeos : Genotipagem
PCR :
Hibridização : Southern, Northern, Dot-Blot
Tecnologia do DNA Recombinante - CLONAGEM
Ferramentas Biotecnológicas - enzimas; vetores,
Fontes de DNA - genotecas; DNA sintético
Seleção de um clone - varredura (screening)
Expressão do produto gênico -
Aplicações da Engenharia Genética - em terapia e diagnóstico médico
Questões de Segurança e Ética -
O Futuro da Engenharia Genética -
Expressão Gênica : Análise funcional
Proteoma :
Informação sobre um gene ou sobre um
produto gênico
Padrão de Digestão : RFLP
GENE
PROTEÍNA
Padrão de Digestão : RFLP
Seq. de Nucleotídeos : Genotipagem
PCR :
Hibridização : Southern, Northern, Dot-Blot
Expressão Gênica : Análise funcional
Proteoma :
Separação de moléculas de DNA e RNA por tamanho
Qdo submetidas a um campo elétrico em material poroso
DNA é carregada ( - ) e
migra para o polo +
AGAROSE
POLIACRILAMIDA > poder de resolução
PULSED – FIELD agarose Gel (CHEF)
Moléculas Longas (cromossomos)
Clamped Homogeneous Electrical Field
Gel de Agarose
Separação de moléculas de DNA e RNA por tamanho
Padrão de Digestão : RFLP Restricted
Fragment
Length
Polymorphism
Padrão de Digestão : RFLP Restricted
Fragment
Length
Polymorphism
12 218 Kb
Kb
11
9
4,5
3,5
2
Mapa genômico –
Sequência de nucleotídeos
Padrão de Digestão : RFLP
Teste de paternidade
V A B C D E a b c d
2.2
2.0
4.4
6.7
9.3
23.1
0.6
PTR1 DHFR-TS DHFR-TS
2.2
2.0
4.4
6.7
9.3
23.1
0.6
MWMW
a b A B
cL HYG
PTR 1
DHFR-TS
PT
R 1
cL H
YG
cL H
YG
DH
FR
-TS
Padrão de Digestão - Sal I
PCR MultiPlex
MAPA GENÉTICO
Análise de clones de Leishmania isolados a partir da seleção com MTX
E pra que tudo isso ?????
GENE
PROTEÍNA
Padrão de Digestão : RFLP
Seq. de Nucleotídeos : Genotipagem
PCR :
Hibridização : Southern, Northern, Dot-Blot
Expressão Gênica : Análise funcional
Proteoma :
Sequência de Nucleotídeos : Genotipagem
‘fingerprint’ – impressão digital
A genotipagem é o processo pelo qual identificamos cada polimorfismo de
interesse para um determinado número de animais, espécies, cepas, etc.
Permite saber se uma espécie tem um maior grau de resistência, ou
propensão a manifestar uma determinada característica.
Sequenciamento de nucleotídeos
DIDEOXINUCLEOTÍDEO
Frederick Sanger PNQ 58 e 80
Frederick Sanger PNQ 58 e 80
Sequenciamento de nucleotídeos
DIDEOXINUCLEOTÍDEO
1 ddGTP : 100 dGTP
Sequência de Nucleotídeos : Genotipagem
Comparação das sequências de nucleotídeos da mesma proteína em 3 diferentes espécies
Comparação das sequências de aminoácidos da mesma proteína em diferentes de Leishmania spp.
PR
P1
MR
PA
(P
GP
A)
intervalo ?????
E pra que tudo isso ?????
GENE
PROTEÍNA
Padrão de Digestão : RFLP
Seq. de Nucleotídeos : Genotipagem
PCR :
Hibridização : Southern, Northern, Dot-Blot
Expressão Gênica : Análise funcional
Proteoma :
DNA
mRNA
Proteína
Direção da transcrição RNA DNARNA
polimerase
0.25m
M E T
Polirribossomo
Ribossomo
mRNA
Direção de tradução
TRANSCRIÇÃO
TRADUÇÃO
REPLICAÇÃO
Conceitos básicos degenética clássica
Proposto por sir Francis Crick
em 1958 na tentativa de
relacionar o DNA, o RNA e
proteínas.
O Dogma Central da
Biologia Molecular
O DNA pode se replicar e dar origem a novas
moléculas de DNA, pode ainda ser transcrito em
RNA, e este por sua vez traduz o código genético
em proteínas
Replicação do DNA
5’ 5’ 5’
3’
3’
Fita
complementar
Fita
líder
RNA
primer
DNA
nucleotídeos
SEMI - CONSERVATIVA - 5’ 3’
NECESSITA :
INICIADOR
MODELO
NUCLEOTÍDEOS
ENZIMAS
helicase
SSB
primase ou RNA pol.
ribonuclease H
ligase
DNA polimerase III
PCR - Reação em cadeia da Polimerase Polymerase
Chain
Reaction
DNA original
+ iniciadores
+dNTPs
+DNA PolimeraseDenaturação
e Síntese
Etc....
Etc.... Etc....
Reação em cadeia
da Polimerase
Kary B. Mullis PNQ 93
PCRanimação
reação em cadeia
Denaturação
e Síntese
Denaturação
e Síntese
PCR - Reação em cadeia da Polimerase
M - Lm La Lb Lc M
3000
2000
1000
600
500
bp
NH2 COOH
NBD1RNBD1F
Fragmento de 618 pb
5´ 3´
Identificação de ortólogos do transportador ABC PRP1 em Leishmania spp.
NBD1F
NBD1R
E pra que tudo isso ?????
GENE
PROTEÍNA
Padrão de Digestão : RFLP
Seq. de Nucleotídeos : Genotipagem
PCR :
Hibridização : Southern, Northern, Dot-Blot
Expressão Gênica : Análise funcional
Proteoma :
5’
5’
5
’
5’
5’ 5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’3’
3’3’
3’
3’
3’
3’
3’
70°C
80°C
85°C90°C
Identificar uma moléculaespecífica de DNA
Hibridização de uma molécula específica de DNA
Capacidade do DNA denaturado de reanelar
Formação de moléculas híbridas, quando DNAs homólogos
e denaturados de duas fontes diferentes são colocados sob
condições de temperatura e força iônica apropriadas
Propriedade físicas e químicas do DNA:
- Viscosidade
- Sedimentação em Gradiente de CsCl (+ CG, + denso)
- Denaturação: Química - pH< 4 ou >11 ( NaOH )
Física - Tm ( proporcional ao CG )
5’
5’
5
’
5’
5’ 5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’3’
3’3’
3’
3’
3’
3’
3’
70°C
80°C
85°C90°C
H
I
B
R
I
D
I
Z
A
Ç
Ã
O
Hibridização identificando uma molécula específica de DNA
Hibridização é o processo de pareamento entre dois
polinucleotídeos simples fita e complementares
SONDA
2. estar marcada
• P32
• Fluorescência
1. ser capaz de se
ligar a uma
molécula com seq.
complementar
• frag/o. purificado
sintético
Hibridização southern – northern blot
Hibridização de
uma molécula
de ac nucleico
livre em outra
molécula
aderida a um
papel de filtro
SONDA
dna rna
E pra que tudo isso ?????
GENE
PROTEÍNA
Padrão de Digestão : RFLP
Seq. de Nucleotídeos : Genotipagem
PCR :
Hibridização : Southern, Northern, Dot-Blot
Expressão Gênica : Análise funcional
Proteoma :
Métodos de clonagem molecular
Tipos: genômica - enzimas de restrição, seringa, DNAse
c-DNA - genes de uma fase evolutiva específica
Vetores: bacteriófagos, plasmídios, cosmídios, etc.
Construção Genoteca - vetores de substituição,
inserção,
expressão.
1
2
3
4 Seleção dos Clones : P32 (radioativo),
XGal + IPTG (químico),
AC (imunológico)
Etapas na construção de uma Genoteca
construção de uma genoteca
Con
stru
ção
de u
ma
geno
teca
de
expr
ess
ão (
genô
mic
a ou
de c
-DN
A)
“Chagas Disease” Wendel e cols. (eds.) - 1992; Cap.10.2.4.
‘T.cruzi recombinant antigens for serodiagnosis.’ pp.207 - 218
DNAgenômico
Digestão com DNAseI
RNAm deT.cruzi
Síntesedo DNAc
lac z
empacotamento
ligação
fagosrecombinantes
DNA gt11
Reparo e adiçãodos adaptadores
( EcoRI )
(EcoRI)
Regulação da Expressão Gênica
Regulação do operon da lactose (operon lac)
Dobramento
do
Polipeptídeo
Proteína
Repressora
DNA
RNAm
RNA PolimeraseGenes estruturais
Meio de Cultura( IPTG )
Seleção Química de clones recombinantes
EcoRI
gt11
recomb.
transcrição
traduçãoDNA
Gal
prot.em fusão
X-Gal
lac +
lac -
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
SEM ATIVIDADE ENZIMÁTICA
IPTG + X-Gal
Produto azul
Seleção de clones recombinantes
genoma
digestão
com E.R.
DNA do
vetor
extração
digestão
com E.R.
DNA recombinante
ligação
infecção bacteriana
lise placa de lise
Tapete
bacteriano
placa contendo o clone
G E N O T E C A
filtro denitrcelulose
sondaradioativa
sacoplástico
filme
autoradiograma
cloneselecionado
PROPAGAÇÃO
infecção em
meio líquido
Seleção Imunológica de clones recombinantes
Imunoseleção de fagos recombinantes
Reação Primária -- ligação dos grupos reativos da molécula antigênica com um dos
dois sítios de combinação da molécula de anticorpo.
Reação Secundária -- visualização direta ou com auxílio de lupas da precipitação ou da
aglutinação.
Reação Terciária -- expressão biológica da interação Ag-AC.
antígeno
lavag
em
anticorpo
E E
anti-IgG marcada
lavag
em
lavag
em E E
substrato cromogênico
teste imunoenzimático - ELISA ( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay )
G E N O T E C A
filtro denitrcelulose
sondaradioativa
sacoplástico
filme
autoradiograma
cloneselecionado
PROPAGAÇÃO
infecção em
meio líquido
Seleção de clones recombinantes com soro de pacientes chagásicos
11 C L O N E S
S E L E C I O N A D O S
Imunoseleção de fagos recombinantes
Imuno análise por dot blot
LISADOS DE DIFERENTES FAGOS
RECOMBINANTES ADICIONADOS
SOBRE TAPETE DE E.COLI
TRANSFERÊNCIA PARA
FILTROS DE
NITROCELULOSE
SELEÇÃO COM
ANTICORPOS IMUNO
ESPECÍFICOS
DETECÇÃO DOS FAGOS
REATIVOS
TRANSFERÊNCIA DAS PROTEÍNAS
EXPRESSAS NA GENOTECA PARA
FILTROS DE NITROCULULOSE
SELEÇÃO COM
ANTICORPOS IMUNO
ESPECÍFICOS
DETECÇÃO DE CLONES
EXPRESSORES RECONHECIDOS
POR IMUNOGLOBULINAS
ACOPLADAS A PEROXIDASE
“Chagas Disease” Wendel e cols. (eds.) - 1992; Cap.10.2.4.
‘T.cruzi recombinant antigens for serodiagnosis.’ pp.207 - 218
A - Chagásicos D - Toxoplasmose
B - Leishm. Cutânea E - Esquistossomose
C - Leishm. Visceral F - Malária
G - Normais
Reatividade de clones expressores com pool de
soros de pacientes com diferentes parasitoses
Clone H49
Produção e/ou Imunopurificação de AC
anti Proteína Recombinante
Antígeno
J. Clin. Microbiol., 1990; 28(3):519
H 49
36 kDa
S H C
J. Clin. Microbiol., 1990; 28(3):519
Localização do antígeno H49 por Imunofluorescência
Cels HeLa
infectadas
48hs.
Cels HeLa
infectadas
72hs.
Localização do antígeno H49 por Imunoeletro microscopia
Citoesqueleto de: TCT META EPI
J. Clin. Microbiol., 1990; 28(3):519
Imunodetecção do antígeno H49 em cortes Histológicos
AC de
coelho
anti H49
AC de
coelho
anti GST
ELISA com antígeno H49 recombinante
Par.Immun. 1994, 16(3):165
Norm. Crônico Agudo Cong. Malária Schist. Filária Leishm. Ot.Patg. H49 Ag. total
11 147 60 16 9 3 9 16 25 EPI
cut-off
OD
(49
2n
m)
- OP
- SHCCrn.
Comparação dos
resultados obtidos
pelo H49 recomb. e
ELISA convencional
Conclusão da performance do ELISA -H49
SENSIBILIDADE Fase Crônica - 84%
Fase Aguda - 58%
Congênito - 56%
ESPECIFICIDADE -- 100%
Ausência de reação cruzada com casos de leishmaniose
Parasit. Immunol., 1994; 16(3): 165
Soros Chagásicos do Brasil, Argentina, Uruguai e Venezuela
ANÁLISE COMPARATIVA POR ELISA
SENSIBILIDADE ESPECIFICIDADE
H49 100% 100%
EPI 100% 80%
Avaliação das proteínas recombinantes (mixELISA)
Antígenos
Soros
Chagásicos
Epi H49 JL7 A13 B13 JL8 1F8 Mix0
1
2
3
Ab
s I
gG
EAE Mix0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Antígenos
Soros de
Leishmaniose
Conclusões e Perspectivas• O uso de antígenos recombinantes isolados não é satisfatório.
• O mix de antígenos recombinantes não é satisfatório para o
diagnóstico de casos congênitos.
• O mix de antígenos recombinantes é bastante específico.
J.Clin.Microbiol. 37, 1554-1560, 1999
Tecnologia do DNA Recombinante
Soros
IMT
H49
B131F8
JL8
Repeat AAProtein kDa
ProdutoCaract.
H49 68 >300 citoesqueleto crônico
A13 no 230 ND agudo e cr.
B13 12 116-140 superfície crônico
JL8 14 >170 citoplasma crônico
1F8 no ND flagelo crônico
• Subclonagem em vetor pGEX.
• Expresso em fusão com Glutationa -S-transferase (GST).
• Purificado por cromatografia de afinidade com Glutationa -Agarose
Kit para Diagnóstico da Doença de Chagas Stat-Pak
Teste Imunocromatográfico
-+
Diag.Microbiol.Inf.Dis. 2003; 46:265-271
Avaliação do kit Chagas Stat-Pak
• Avaliação em 393 amostras (BR central - estudo cego)
Sensibilidade (98,5%)
Especificidade (94,8%)
• Avaliação em 352 amostras (4 países da Am.Latina)
Sensibilidade (100%)
Especificidade (98,6%)
200 - Chag.Cron. (8 a 69 anos)
150 - normais
43 - OP 9 LV, 10 LMC, 11 HCV3 HIV, 10 D.Autoimunes
279 - Chag.Cron. (IHA,IFI,ELISA)
73 - não chagásicos
Diag.Microbiol.Inf.Dis. 2003; 46:265-271
vamos descansar...
Composição química dos ácidos Nucleícos
uracil
citosina
timinaPIRIMIDINA P U R I N A
NH2
guanina
adenina
3 BASES
NITROGENADAS
1 FOSFATOS
AÇÚCARES
(pentose)
RIBOSE
DESOXIRRIBOSEH
OH
2
Não hidrolisa
com NaOH
Composição química dos ácidos Nucleícos
C
C
T
T
3’
3’
5’
5’
G
G
A
A
PURINAS - A G
PIRIMIDINAS - C T U
A T
C G
Pontes de Hidrogênio
Hibridização
Estringência
5’
5’
5’
5’
5’ 5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
70°C
80°C
85°C90°C
Propriedade físicas e químicas do DNA:
- Viscosidade
- Sedimentação em Gradiente de CsCl (+ CG, + denso)
- Denaturação: Química - pH< 4 ou >11 ( NaOH )
Física - Tm ( proporcional ao CG )
Lipídeos
Proteínas
Polissacarídeos
RNAs
DNAsin vitro
75 litros de Streptococcus
25mg extrato transformante
Oswald T. Avery, 1944
Identificação do material hereditário em bactérias
+Lipase
Protease
Amilase
Rnase
DNase
primeira demonstração que os genes eram compostos por DNA
1- Ferramentas para Pesquisa Básica:
2- Diagnóstico: agentes de doenças infecto-parasitárias
- Produção em larga escala de proteínas recombinantes para kits de ELISA, etc.
- Sondas de DNA (hibridização e/ou PCR): diagnóstico de paternidade, aplicações
forenses, doenças genéticas, estudos antropológicos, arqueológicos e filogenéticos.
3- Produção de Vacinas: definição e pureza do antígeno, reprodutibilidade e custo de
produção.
4- Produção de Substâncias Biologicamente Ativas: uso terapêutico, como :insulina,
-interferon, fatorVIII de coagulação, hormônio de crescimento; VANTAGENS pureza
do fármaco, idêntico ao natural, custo de produção e reprodutibilidade.
5- Alteração das características animais e vegetais:- Produção de organismos trangênicos. a) melhores índices de produtividade (prod.
comercial), b) imunidade a doenças e pragas, c) melhor valor biológico (proteína
ricas em AA essenciais em vegetais), d) modelos de estudo em pesquisa.
- Terapia gênica.
Clonagem molecular: APLICAÇÕES
Sequenciadores automáticos
Como sequenciar um genoma inteiro ?? genoma humano tem 3 bilhões de pb
• Em 1990 500pb era obtido após 1 a 2 dias de longo esforço e concentração.....
• Hoje os métodos automáticos não usam o gel e sim colunas ou capilares
• O processo leva 2 a 3 horas com rendimento de 700 a 800 pb
• O grande avanço veio com o uso de ddNTPS fluorescentes e leitura pelo sensor
1 - 4 gt11
5 - 16 clones recombinantes de T.cruzi
5 - clone H3; 7 - clone H49; 11 - clone A13
CHAGÁSICOS
CRÔNICOS
CHAGÁSICOS
AGUDOS
IgG
IgMExp.Parasitol., 1990, 71:284
Reatividade dos clones T.cruzi com
Anticorpos das classes IgM e IgG
Clonagem do DNA de interesse em vetor
especializado na expressão em larga escala
inserto
ProteínaClonada
GST
Glutationa
Sefarose 4B
1 - Adc. extrato da Prot. de
fusão com GST
em GS4B
contaminantes
de E.coli
2 - Adc. Protease Específica
3 - Eluição da Proteína Clonada
Purificação da Proteína Expressa em fusão
com a GST
Cromatografia em Coluna
de Glutationa Sefarose 4B
Proteína
ClonadaGST
1- Adc. anticorpo anti-GST de cabra
2- Adc. anticorpo anti-cabra
conjugado com Peroxidase
3- Detecção da Proteína de
fusão em Western-blot
Par.Immun. 1994, 16(3):165
GST
SDS-PAGE (Coomasie blue) W.B. SHChag.
GST
H49
Clivagem
fator Xa
Análise de uma proteína recombinante de T.cruzi
0
20
40
60
80
100Stat Pak
Sorol. Conv.
Avaliação do kit Chagas Stat-Pak
200 - Chag.Cron. (8 a 69 anos)
150 - normais
43 - OP 9 LV, 10 LMC, 11 HCV3 HIV, 10 D.Autoimunes
393 amostras brasileiras
Sensibilidade - 98,5%
Especificidade - 94,8%
98,5 100 9% 23%
Chagásicos Normais O. P.200 150 43
4% 0
Diag.Microbiol.Inf.Dis. 2003; 46:265-271
0
20
40
60
80
100 Stat Pak
Sorol. Conv.
Avaliação do kit Chagas Stat-Pak
Hond. Venez. Bolv. Arg. H V B A157 40 10 72 47 5 11 10
Chagásicos Não Chagásicos
279 - Chag.Cron. (IHA,IFI,ELISA)
73 - não chagásicos
352 amostras 4 países
Sensibilidade - 100%
Especificidade - 98,6%
100% 10%
0% 0% 0% 0%
Diag.Microbiol.Inf.Dis. 2003; 46:265-271
Avaliação do kit Chagas Stat-Pak
Discussão:
ESPECIFICIDADE - de 19 soros de LV e LMC, 2 (10,5%) reagiram no
Stat Pak; contra 10 (52%) na Sorologia Convencional.
Variabilidade do T.cruzi X Características imunogênicas do hospedeiro.
Alta sensibilidade e Especificidade em zonas endêmicas ( T.cruzi I e II ).
OMS recomenda ao menos dois testes em paralelo para se obter 98%
Stat Pak é rápido (15 minutos), avaliado a olho nu, fácil manipulação (não
requer aparelhagem alguma), pode ser estocado a temp. ambiente,
reação fica no cassete podendo ser reavaliada posteriormente.
Recomendado para trabalhos de campo.
Diag.Microbiol.Inf.Dis. 2003; 46:265-271
Composição química dos ácidos Nucleícos
uracil
citosina
timinaPIRIMIDINA P U R I N A
NH2
guanina
adenina
3 BASES
NITROGENADAS
1 FOSFATOS
AÇÚCARES
(pentose)
RIBOSE
DESOXIRRIBOSEH
OH
2
Não hidrolisa
com NaOH
Anelamento do iniciador de Oligo dT
Cópia do DNA com
Transcriptase Reversa
Tratamento
com NaOH
DNA Polimerase
S1 Nuclease
Produção do DNA complementar (DNA-c)
Seqüências de DNA que estão sendo
transcritas em RNA (genes).
Genes específicos de uma determinada
fase evolutiva do organismo.
Genes freqüentemente transcritos.
Introns são removidos através do RNA
‘splicing’ que ocorre durante a
formação do RNAm.
Seqüenciais de DNA não transcritas
(espaçadores, regiões inter e intra
gênicas) não são obtidas em uma
genoteca de cDNA