SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS E BIOLOGIA CELULAR

AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE DO CLORETO DE METILMERCÚRIO EM DUAS ESPÉCIES DE

PEIXES NEOTROPICAIS

CARLOS ALBERTO MACHADO DA ROCHA

BELÉM - PA 2009

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CARLOS ALBERTO MACHADO DA ROCHA

AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE DO CLORETO DE METILMERCÚRIO EM DUAS ESPÉCIES DE

PEIXES NEOTROPICAIS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Neurociências e Biologia Celular, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito para obtenção do grau de Doutor em Neurociências e Biologia Celular. Orientador: Prof. Dr. Rommel Mario Rodriguèz Burbano Co-orientadora: Profa. Dra. Marta Margarete Cestari

BELÉM - PA 2009

CARLOS ALBERTO MACHADO DA ROCHA

AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE DO CLORETO DE METILMERCÚRIO EM DUAS ESPÉCIES DE PEIXES

NEOTROPICAIS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Neurociências e Biologia Celular, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito para obtenção do grau de Doutor em Neurociências e Biologia Celular.

Data de aprovação: 16 de junho de 2009. Orientador:

Prof. Dr. Rommel Mario Rodríguez Burbano - Orientad or Instituto de Ciências Biológicas, UFPA

Avaliadores:

Prof. Dr. Edivaldo Herculano Correa de Oliveira Instituto de Ciências Biológicas, UFPA Prof. Dr. Edmar Tavares da Costa Instituto de Ciências Biológicas, UFPA Profa. Dra. Fabíola Raquel Tenório Oliveira Universidade do Estado do Pará – UEPA Prof. Dr. Wallace Gomes Leal Instituto de Ciências Biológicas, UFPA

Belém - PA 2009

Aos meus pais Círio Rocha, in memoriam, e

Corina, pessoas que me motivaram por superar

seus limites;

Aos meus filhos Carlos Júnior, Carla Fernanda e

Carlinho, na esperança de que lhes sirva de

motivação.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Prof. Dr. Rommel Burbano, primeiramente por sua

amizade. No que se refere a esta orientação, agradeço pela valiosa ajuda e por ter

acreditado que eu poderia conseguir mesmo vindo de outra área e com um projeto

que se desviava um pouco do perfil do laboratório. Valeu mesmo tio!

À minha co-orientadora, Profa. Marta Margarete Cestari, pela receptividade na

Universidade Federal do Paraná, minha iniciação nos testes de genotoxicidade em

peixes e pelas numerosas sugestões e recomendações para a tese. Também

agradeço ao Marcos Ferraro, que me acompanhou no laboratório da UFPR.

Ao Bruno Coêlho do Laboratório de Onocologia Experimental da Universidade

Federal do Ceará, pela acolhida em Fortaleza e grande ajuda na execução do

ensaio cometa.

Aos amigos do Laboratório de Citogenética Humana da UFPA que

contribuíram de alguma forma para a realização desta tese: André, Dani, Adriana,

Patrícia e, particularmente, ao Marcelo, colaborador neste projeto e quase mais um

orientador nestes anos de doutorado.

Aos amigos do Laboratório e parceria de GDP: Presidente Plínio, Diego,

Helem, Luiz, Leopoldo, Gabi, Priscila, Amanda, Tati, Leomá, João, Gal e Rodrigo.

Meu agradecimento também à Glorita e tomara não tenha esquecido ninguém.

Aos colaboradores no IFPA: Lorena Cunha, meu braço direito neste trabalho;

Henrique Pinheiro, o estagiário “da hora”. Também agradeço ao André (primeiro

estagiário), Seu Cinésio e Vitor.

À Pós-Gradução de Neurociências e Biologia Celular, pela qualidade do curso

e pela organização. Aos funcionários do Instituto de Ciências Biológicas que, de

algum modo, foram úteis na execução desta tese.

A toda a minha família, pela torcida e confiança. À Aldair, por sua paciência,

amor, incentivo e pelas horas doadas de nosso convívio.

A todos meus sinceros agradecimentos.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS 1

1.2 MERCÚRIO: OCORRÊNCIA E CICLO BIOGEOQUÍMICO 4

1.2.1 Metilação do mercúrio inorgânico 7

1.3 BIOACUMULAÇÃO E BIOMAGNIFICAÇÃO 9

1.4 MERCÚRIO E METILMERCÚRIO EM SISTEMAS HUMANOS 11

1.5 IMPACTOS AMBIENTAIS E À SAÚDE HUMANA

RELACIONADOS A EMISSÕES DE MERCÚRIO

12

1.5.1 O mal de Minamata 13

1.5.2 Acidentes com fungicidas 15

1.5.3 A questão do garimpo de ouro na Amazônia 16

1.6 PEIXES DA BACIA DO TAPAJÓS 18

1.7 ANÁLISES DE GENOTOXICIDADE 19

1.7.1 Estudos de efeitos genotóxicos de metais pesa dos em peixes 25

1.8 JUSTIFICATIVA 29

2. OBJETIVOS 30

2.1 OBJETIVO GERAL 30

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 30

3. MATERIAIS E MÉTODOS 31

3.1 MATERIAIS 31

3.1.1 Organismos utilizados como bioindicadores 31

3.1.2 Coleta e aclimatação dos animais 33

3.2 MÉTODOS 34

3.2.1 Tratamento dos animais e obtenção do sangue p ara os

bioensaios

34

3.2.2 Ensaio Cometa 35

3.2.3 Teste do Micronúcleo 37

3.2.4 Bioensaios com Colossoma macropomum 38

3.2.5 Bioensaios com Aequidens tetramerus 39

3.2.6 Análises estatísticas 40

4. RESULTADOS 41

4.1 RESULTADOS DOS EXPERIMENTOS COM C. MACROPOMUM 41

4.2 RESULTADOS DOS EXPERIMENTOS COM A. TETRAMERUS 46

5. DISCUSSÃO 51

5.1 USO DE ERITRÓCITOS PERIFÉRICOS 52

5.2 MAIOR SENSIBILIDADE DO ENSAIO COMETA 53

5.3 TESTE DO MICRONÚCLEO 54

5.4 MAIOR ÍNDICE DE DANOS NO ACARÁ 56

6. CONCLUSÕES 57

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 58

ANEXOS: TABELAS DE RESULTADOS

APÊNDICE 1: Artigo “Evaluation of Genotoxic Effect s of

Xenobiotics in Fishes Using Comet Assay – A Review”

APÊNDICE 2: Artigo “The Micronucleus Assay in Fis h

Species as an Important Tool for Xenobiotic Exposur e Risk

Assessment – A Brief Review and an Example Using

Neotropical Fish Exposed To Methylmercury”

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 Horizontes do solo. Figura 2 Origem e ciclo global do mercúrio no ambiente. Figura 3 Metilação do mercúrio inorgânico. Figura 4 Bioacumulação e Biomagnificação do metilmercúrio. Tabela 1 Recentes estudos de genotoxicidade de metais pesados em

diversas espécies de peixes. Figura 5 Espécime de Colossoma macropomum. Figura 6 Espécime de Aequidens tetramerus. Figura 7 Aquários no Laboratório de Biologia Aquática do IFPA. Figura 8 Esquema resumido dos bioensaios. Figura 9 Resumo das sucessivas etapas que integram o Ensaio cometa. Figura 10 Visão de aquários no Laboratório de Biologia Aquática do IFPA,

por ocasião da exposição de C. macropomum ao metilmercúrio. Figura 11 Freqüência de nucleóides por classe de dano. Figura 12 Resultados do teste de Mann-Whitney obtidos no BioEstat 5.0

com dados do Ensaio cometa em C. macropomum. Figura 13 Gráfico representativo dos escores (por 100 células) do Ensaio

cometa em C. macropomum. Figura 14 Eritrócitos de C. macropomum corados com Giemsa, em

ampliação de 1.000X. A seta indica um micronúcleo. Figura 15 Resultado do teste do qui-quadrado obtido no BioEstat 5.0, com

dados do Teste do micronúcleo em C. macropomum. Tabela 2 Médias e desvios de micronúcleos (MN) e alterações

morfológicas nucleares (AMN) de C. macropomum. Figura 16 Freqüências de micronúcleos + alterações morfológicas

nucleares (por 4.000 eritrócitos) em C. macropomum. Figura 17 Ensaio cometa em A. tetramerus. Comparação do índice de

danos nos grupos controle (C) e tratados com MeHg 2mg.L-1 nos dois tempos de exposição.

Figura 18 Freqüência de nucleóides por classe de dano. Figura 19 Resultados do teste de Kruskal-Wallis obtidos no BioEstat 5.0

com dados do Ensaio cometa em A. tetramerus. Figura 20 Ensaio cometa em A. tetramerus. Comparação do índice de

danos ao DNA nos grupos controle (C) e tratados com MeHg 2mg.L-1 nos dois tempos de exposição.

Figura 21 Resultado do teste do qui-quadrado obtido no BioEstat 5.0, com dados do Teste do micronúcleo em A. tetramerus.

Tabela 3 Médias e desvios de micronúcleos (MN) e alterações morfológicas nucleares (AMN) de A. tetramerus.

Figura 22 Representação das freqüências de micronúcleos + alterações morfológicas nucleares (por 4.000 eritrócitos) em A. tetramerus.

Tabela 4 Efeitos genotóxicos e mutagênicos do MeHg 2mg.L-1. Comparação entre os resultados nas duas espécies de peixes.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMN Alterações morfológicas nucleares

DNPM Departamento Nacional de Produção Mineral

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

g Grama

Hg Mercúrio

IARC International Agency for Research on Câncer

IFPA Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Pará

kg Quilograma

L Litro

LMP Low melting point (baixo ponto de fusão)

mA Miliampere

MeHg Metilmercúrio

mg Miligrama

mL Mililitro

mM Milimolar

MN Micronúcleos

ng Nanograma

nm Nanômetro

OMS Organização Mundial de Saúde

PM Peso molecular

ppm Parte por milhão

SCGE Single cell gel electrophoresis

SNC Sistema Nervoso Central

UFPA Universidade Federal do Pará

UFRA Universidade Federal Rural da Amazônia

V Volt

WHO World Health Organization

µg Micrograma

µL Microlitro

RESUMO

A preocupação com a contaminação ambiental por compostos contendo

metais pesados é decorrente, além da alta toxicidade, de sua capacidade de

bioacumulação e potencialidade de induzir danos ao material genético. O mercúrio é

um metal xenobiótico, contaminante ambiental. A biotransformação do mercúrio

inorgânico em metilmercúrio nos ambientes aquáticos é um processo bem conhecido

e favorece a contaminação de algas, moluscos, crustáceos, peixes e, finalmente, o

homem, nos níveis mais elevados das cadeias alimentares. O objetivo deste estudo

foi determinar as alterações genotóxicas induzidas pelo cloreto de metilmercúrio

(CH3HgCl) em duas espécies de peixes comuns na bacia do rio Tapajós (Colossoma

macropomum e Aequidens tetramerus) e que, no ambiente natural, ocupam

diferentes níveis tróficos. Os peixes das duas espécies foram mantidas sob as

mesmas condições de manejo e, após exposição ao CH3HgCl por via hídrica,

tiveram o sangue coletado e utilizado em dois bioensaios: o Ensaio cometa e o Teste

do micronúcleo. Nossos resultados demonstraram que o CH3HgCl pode ser

altamente genotóxico. O Ensaio cometa apresentou diferenças mais significativas

que o Teste do micronúcleo para ambas as espécies em relação aos seus

respectivos controles. Ao compararmos os resultados entre as duas espécies

estudadas, percebemos níveis bem mais elevados de danos ao material genético da

espécie carnívora – A. tetramerus. Além disso, o nível de danos aumentou com o

tempo de exposição. Tais resultados, entretanto, não dependeram de suas posições

nas cadeias alimentares em ambiente natural, mas de características específicas

que determinam sua sensibilidade ao xenobionte ou sua susceptibilidade à

bioacumulação, ou ambas.

Palavras-chave : Metilmercúrio, Genotoxicidade, Colossoma, Aequidens, Ensaio

cometa, Teste do micronúcleo.

ABSTRACT

Concerns regarding environmental contamination caused by heavy metal

compounds is due their high toxicity and ability to bioaccumulate and cause DNA

damage. Mercury is a xenobiotic metal, being a environmental contaminant itself.

The process that transforms inorganic mercury in methylmercury in aquatic

environment is well known and favors algae, mollusks, crustaceans and fishes

contamination, as well as mankind on higher levels of the food chain. This study

aimed to evaluate genotoxic alterations induced by methylmercury chlorite (CH3HgCl)

in two fish species commons in Tapajós river bay (Colossoma macropomum and

Aequidens tetramerus) which, in their natural habitat, occupy different trophic levels.

Specimens of both species were kept under similar management conditions and,

after fishes have been exposed to MeHg via water, their blood was collected under

laboratory conditions and used in two bioassays: Comet Assay and Micronucleus

test. Our data showed that CH3HgCl can be highly genotoxic. Comet assay showed

to be more sensitive than the Micronucleus test for both species. When comparing

data between the two studied species, we noticed a higher DNA damage index in the

carnivore specie, A. tetramerus. Furthermore, DNA damage levels increased with

longer exposure to MeHg. Our result, however, were not consequence of their

position on the trophic chain in their natural environment, but were probably due to

specific features in those species that determine their sensibility to xenobiotics or its

susceptibility to bioaccumulation, or both.

Key words: Methylmercury, Genotoxicity, Colossoma, Aequidens, Comet assay,

Micronucleus test.

1. INTRODUÇÃO

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS

O mercúrio é um metal xenobiótico e corresponde a um dos contaminantes

órgãos-específicos mais largamente difundidos e deletérios (Silva-Pereira et al.,

2005). O nome mercúrio é uma homenagem ao planeta Mercúrio. Já na mitologia

romana, Mercúrio é o mensageiro dos deuses, filho do deus Júpiter e de Maia, a filha

do titã Atlante. Mercúrio era também o deus dos mercadores e do comércio e tinha

muitos dos atributos do deus grego Hermes (Azevedo, 2003). Os gregos chamaram

o metal de Hidrargiro (hidro = elemento de composição com sentido de água;

argyros = prata). Já os romanos transcreveram essa expressão para o latim como

Hidrargyrum.

Os primeiros estudos sobre a problemática da presença do mercúrio em

vários compartimentos dos ecossistemas na Bacia Amazônica, os quais datam cerca

de duas décadas, reconhecem duas principais fontes como responsáveis por essa

contaminação: os garimpos de ouro e a agricultura do tipo corte e queima (Sampaio

da Silva et al., 2006). Em outras palavras, o rejeito de mercúrio no sistema aquático,

proveniente de operações de mineração e pela lixiviação de solos após

desflorestamentos, é considerado a maior contribuição para a contaminação na

Bacia Amazônica (Amorin et al., 2000).

Um levantamento realizado na década de 1980, pelo Departamento Nacional

de Produção Mineral – DNPM, em várias áreas de garimpo do Pará, Mato Grosso e

Goiás, detectou uma relação de cerca de dois gramas de mercúrio para cada grama

de ouro. Portanto, se considerarmos que a produção real (a oficial mais a não

computada) de ouro por garimpagem na região de 1980 a 1988 foi próxima de 900

toneladas, tivemos um lançamento de mercúrio na ordem de 1.800 toneladas ao

ambiente (Rocha & Canto-Lopes, 2002).

Realmente a liberação de mercúrio das atividades de garimpos de ouro

contribuiu para aumentar localmente suas concentrações, mas para toda a

Amazônia essas cargas seriam quase insignificantes, considerando-se os níveis

elevados em solos distantes das áreas de garimpo. Um processo razoável que deve

explicar essas observações no solo é que horizontes B funcionam como uma

esponja que acumula mercúrio durante um período de tempo geológico, liberando-o

de volta ao ciclismo por ocasião de erosões e incêndios florestais (Wasserman et al.,

2003).

Figura 1 – Horizontes do solo. Desenho: Nonato Reis (2009). (O) horizonte orgânico; (A) horizonte rico em atividade biológica, participando da humificação da matéria e da ciclagem de nutrientes; (B) horizonte iluvial, caracterizado por maior concentração de argila, com menor teor de matéria orgânica, bastante afetado pelos processos de formação do solo e que recebe, por infiltração da água, a influência das camadas superficiais; (C) material de origem (rocha-mãe) em decomposição (Andrade et al., 2004).

O metilmercúrio é um composto classificado como grupo 2B, pela IARC

(International Agency for Research on Câncer), indicando-o como possível

carcinogênico para humanos (Hallenbeck, 1993) e se acumula em extensão muito

maior quando comparado às outras formas do mercúrio, apesar de todas as formas

poderem se acumular (Azevedo, 2003).

Estudos têm mostrado que o mercúrio metálico liberado para a atmosfera ou

em sistemas aquáticos pode ser oxidado em Hg2+ e posteriormente convertido a

metilmercúrio por diversos mecanismos, principalmente por meio de reações

mediadas por bactérias. A lipossolubilidade de compostos orgânicos de mercúrio

contribui para os seus maiores níveis encontrados nos predadores, devido à

bioamplificação ao longo da cadeia alimentar (Barkay et al., 2003). O consumo de

organismos aquáticos contaminados com o metilmercúrio é a principal via de

exposição humana.

O peixe é um componente importante da dieta saudável. Alguns dos benefícios à

saúde do peixe incluem: riqueza em proteína, gordura insaturada e ácidos graxos

ômega 3 (David, 2009) e pobreza em gordura saturada. Os peixes são a principal

fonte de alimentação da população amazônida, e podem apresentar elevadas

concentrações de mercúrio, principalmente metilmercúrio, constituindo-se em

importante fonte de exposição humana ao metal (WHO, 1990).

1.2 MERCÚRIO: OCORRÊNCIA E CICLO BIOGEOQUÍMICO

O mercúrio é um metal pesado de aspecto argênteo, inodoro, cujo símbolo Hg

deriva do latim hydrargyrum, que, normalmente, é encontrado em três estados de

oxidação: 0, +1 e +2. Ele é um elemento químico de transição, de caráter metálico,

com elevado peso molecular (PM = 80) e alta densidade. Por esse motivo é

classificado como um metal pesado, que em sua forma elementar se apresenta

como um líquido denso, prateado, nas condições normais de temperatura e pressão

(Schroeder & Munthe, 1998).

Ocorre normalmente, em pequenas concentrações, nos vários

compartimentos da natureza: hidrosfera, litosfera, atmosfera e biosfera. Entre esses

compartimentos há um contínuo fluxo de mercúrio (Figura 2). Raramente é

encontrado como elemento livre na natureza, estando amplamente distribuído, em

baixas concentrações, por toda a crosta terrestre (Azevedo, 2003). O aporte

antrópico ocorre através de indústrias que queimam combustíveis fósseis, produção

eletrolítica de cloro-soda, produção de acetaldeído, incineradores de lixo, polpa de

papel, tintas, pesticidas, fungicidas, lâmpadas de vapor de mercúrio, baterias,

produtos odontológicos, amalgamação de mercúrio em extração de ouro, entre

outros (Micaroni, 2000).

Figura 2 – Origem e ciclo global do mercúrio no ambiente. Desenho: Nonato Reis (2009).

Por apresentar uma espécie química estável na atmosfera como sua forma

volátil, o vapor de mercúrio (Hg0) pode ser transportado em escala global, afetando

áreas remotas naturais longe de fontes pontuais de contaminação (Lacerda & Malm,

2008).

No ciclo atmosférico, também chamado ciclo global, ocorre a circulação de

espécies voláteis de mercúrio, como o dimetilmercúrio, (CH3)2Hg, e o mercúrio

elementar, Hg0, liberadas de fontes naturais e antropogênicas. Pouco se conhece a

respeito das reações da fase gasosa dessas espécies na atmosfera, mas tudo indica

que ocorre um processo de oxidação fotoquímica, através do qual as formas pouco

solúveis em água sejam convertidas em espécies mais solúveis (WHO, 1990).

Nos sedimentos do fundo dos rios as concentrações de mercúrio observadas

são relativamente baixas, demonstrando que o meio aquático não é uma via de

transporte importante para este elemento (Lechler et al., 2000). Entretanto,

particulados ricos em Hg2+ são transportados para o sedimento, onde o metal pode

ser metilado por bactérias sulfato-redutoras (Bisinoti & Jardim, 2004).

O mercúrio inorgânico apresenta uma toxicidade relativamente baixa, mas a

ação bacteriana organifica este elemento formando o metilmercúrio, que foi o grande

“vilão” dos principais acidentes de contaminação humana (Wasserman et al., 2001).

Para o íon Hg2+, a maioria dos ânions, principalmente óxidos, sulfetos e

cloretos, formam compostos de natureza covalente, e existem em solução quase

totalmente não dissociados, como moléculas discretas (Magalhães, 1995).

O metilmercúrio por ser lipossolúvel é muito bem absorvido pelas membranas

biológicas em geral, assim como pelos tratos digestivos dos animais em

praticamente todas as cadeias alimentares (Lacerda & Malm, 2008).

Percebe-se, assim, que a distribuição das diversas espécies de mercúrio que

entram no sistema aquático é regulada por processos físicos, químicos e biológicos,

os quais ocorrem nas interfaces ar/água e água/sedimento. A conversão entre estas

diferentes formas é a base do complexo padrão de distribuição do mercúrio no ciclo

e de seu enriquecimento biológico (Micaroni, 2000).

A complexidade dos ecossistemas amazônicos e o conhecimento limitado do

ciclo biogeoquímico do mercúrio em florestas tropicais explicam as dificuldades

enfrentadas pela comunidade científica em avaliar o impacto da contaminação de

mercúrio. Assim, o conhecimento atual sobre o transporte, transformação e destino

do mercúrio nos meios aquáticos e terrestres do sistema amazônico é ainda

relativamente superficial. Esses problemas afetam o potencial de exposição das

populações locais e, conseqüentemente, o risco envolvido (Hacon et al., 2008).

1.2.1 Metilação do mercúrio inorgânico

A alquilação é a notável transformação que o mercúrio inorgânico pode sofrer,

levando à formação do metil ou do dimetilmercúrio com as interconversões

correspondentes, sendo de fundamental importância para a avaliação da

contaminação local por mercúrio (Tena, 1981).

Nas camadas superiores do sedimento, que são biologicamente ativas, o

mercúrio bivalente é, em parte, metilado por bactérias bênticas a metilmercúrio e

depois a dimetilmercúrio, o que eleva sua capacidade para vencer membranas

biológicas (Figura 3). Nas camadas inferiores do sedimento o mercúrio é inativo,

principalmente sob a forma de sulfeto de mercúrio. Já o metilmercúrio irá se integrar

nas cadeias tróficas ou, se as condições de pH forem apropriadas, dará origem ao

dimetilmercúrio, o qual por ser menos solúvel e volátil passará à atmosfera e será

recolhido nas águas das chuvas. Se estas forem ácidas, o dimetilmercúrio irá se

transformar no metilmercúrio, retornando ao meio aquático e, assim, completando o

ciclo (Azevedo, 2003).

Figura 3 – Metilação do mercúrio inorgânico. Elaboração: Carlos Rocha e Nonato Reis (2009).

A metilação do mercúrio depende de bactérias e outros microrganismos que

tendem a prosperar em condições baixas de oxigênio dissolvido, como na interface

sedimento-água ou nos tapetes de algas. Inúmeros fatores ambientais influenciam

as taxas de metilação de mercúrio bem como a reação reversa, conhecida como

desmetilação. Estes fatores incluem a temperatura, o carbono orgânico dissolvido, a

salinidade, a acidez (pH), as condições de oxidação-redução, bem como a forma e a

concentração de enxofre na água e sedimentos (Alpers & Hunerlach, 2000).

1.3 BIOACUMULAÇÃO E BIOMAGNIFICAÇÃO

Como mencionado anteriormente, o mercúrio inorgânico, ao sofrer o processo

de alquilação, ganha lipossolubilidade, condição indispensável para o fácil transporte

através das membranas celulares, e, assim, pode se depositar – bioacumulação –

nos tecidos de um organismo. Tal fenômeno se dá em invertebrados, peixes e

mamíferos, podendo ocorrer em plantas aquáticas. As espécies inorgânicas do metal

(incluindo-se o mercúrio elementar) e o metilmercúrio têm capacidade de reagir com

ligantes intracelulares, o que explica o alto grau de acumulação desses compostos

(WHO, 1989).

Sempre que um organismo contaminado por mercúrio ocupa um nível inferior

em uma cadeia trófica, seu predador absorverá aquele mercúrio orgânico, mas

revelará concentrações comparativamente aumentadas – biomagnificação. Esse

termo se refere à acumulação de alguns metais pesados (e algumas outras

substâncias) por níveis tróficos sucessivos. Em estudo que avaliava a presença de

Hg em diversos tipos de peixes, em ambiente contaminado, observou-se que o metal

se concentrava mais intensamente à medida em que se crescia na cadeia alimentar:

os peixes vegetarianos apresentavam 6,64 ppm; os peixes que se alimentavam de

invertebrados, 12,4 ppm; os onívoros, 26,6 ppm; e os piscívoros, 40,2 ppm (Boening,

2000).

O homem torna-se um dos principais afetados pela intoxicação mercurial

quando usufrui do rio poluído para diversas atividades, como a alimentação, pois os

peixes que apresentam os maiores níveis de MeHg são os mais consumidos pelo

homem, como o tucunaré e a traíra (Lebel et al., 1998).

Muitos fatores no ambiente aquático influenciam a metilação do mercúrio e,

conseqüentemente, sua biomagnificação. A bioacumulação e a biomagnificação

representam processos extremamente complexos e envolvem biogeoquímica e

interações ecológicas. Como resultado, o grau de biomagnificação de mercúrio no

peixe é difícil de ser prognosticado, embora a acumulação/magnificação possa ser

facilmente observada. Desse modo, o mercúrio é transferido e concentrado por

intermédio de vários níveis da cadeia alimentar. As cadeias alimentares aquáticas

tendem a ter mais níveis tróficos do que as terrestres e, conseqüentemente, a

biomagnificação aquática alcança níveis elevados (UNEP, 2002).

Figura 4 – Bioacumulação e Biomagnificação do metilmercúrio. Elaboração: Carlos Rocha e Nonato Reis (2009).

1.4 MERCÚRIO E METILMERCÚRIO EM SISTEMAS HUMANOS

Evidências em diversas fontes indicam que a exposição crônica a baixas concentrações

de metais pesados, incluindo o mercúrio, resulta em disfunções imunológicas (Pollard & Hultman,

1997). Um estudo de Ben-Ozer et al. (2000) aponta a apoptose de linfócitos e monócitos induzida

por mercúrio, como tendo um papel importante na disfunção imune causada por este metal.

Contudo, vários resultados são contraditórios; por exemplo, alguns autores não

observaram alterações imunológicas já registradas por outros (Barregård et al., 1997). Isso deve

ser decorrente das diferenças metodológicas, genéticas e de características da exposição:

intensidade, tempo, higiene, alimentação, etc (Medrado-Faria, 2003).

O sistema nervoso central é o alvo principal do MeHg, onde afeta, principalmente, áreas

específicas do cérebro e cerebelo. A intoxicação por MeHg se caracteriza por ataxia (perda da

coordenação dos movimentos voluntários), disartria (problemas na articulação das palavras),

parestesia (perda da sensibilidade nas extremidades das mãos e pés e em torno da boca), visão

de túnel (constrição do campo visual) e perda da audição. Uma contaminação severa pode

causar cegueira, coma e morte. O período médio de latência varia, freqüentemente, de 16 a 38

dias (Bahia, 1997). As alterações na função visual (redução do campo de visão) estão entre os

mais freqüentes sinais relacionados à intoxicação por metilmercúrio (WHO, 1990).

A síndrome de Hunter-Russel é uma doença provocada pelo MeHg, cujos sintomas são

disfunção do sistema nervoso, ataxia e diminuição do campo visual. No entanto, vários outros

sintomas podem ser causados, dependendo do grau de exposição (Bisinoti & Jardim, 2004).

A neurotoxicidade do metilmercúrio é bem evidente no desenvolvimento embrionário e

fetal, sendo a exposição intra-uterina muito eficaz. No caso de Minamata, onde gestantes

expostas ao metilmercúrio através da ingestão de peixes contaminados, os efeitos neurológicos

foram bem evidentes, comprovados por casos de microcefalia e retardo mental (WHO, 1990).

De acordo com Nascimento et al. (2008), a neurotoxicidade induzida por metilmercúrio

(MeHg) aumenta a formação de radicais reativos e acelera as reações de radicais livres. O

estresse oxidativo no SNC pode produzir danos pela interação de diversos mecanismos,

incluindo danos mitocondriais, com aumento de Ca++ livre no compartimento intracelular, ativação

e inibição de enzimas, liberação de aminoácidos excitatórios, expressão de metalotioneínas e

disrupção de microtúbulos.

1.5 IMPACTOS AMBIENTAIS E À SAÚDE HUMANA RELACIONADOS A

EMISSÕES DE MERCÚRIO

Desde o surgimento das sociedades humanas, focos localizados de

contaminação ambiental ocorreram ao longo dos séculos. Porém, nunca na escala

global que testemunhamos hoje. Praticamente, todos os ambientes do planeta

encontram-se sob graus variados de contaminação (Lacerda & Malm, 2008).

Segundo os mesmos autores, de modo geral podemos dividir os poluentes

que mais causam danos aos ecossistemas em dois grandes grupos. O primeiro

inclui substâncias presentes nos efluentes de grandes áreas urbanas, especialmente

associadas à disposição imprópria de resíduos sólidos (lixo) e ao tratamento

inadequado ou inexistente de esgoto sanitário. Os ambientes aquáticos, como rios,

estuários e áreas costeiras, são os mais afetados pelos contaminantes gerados por

essas fontes. O segundo grupo, composto pelos poluentes de origem industrial e da

mineração, inclui substâncias tóxicas, como metais, gases de efeito estufa e

poluentes orgânicos, especialmente aqueles gerados pela queima de petróleo. Ao

contrário dos contaminantes do primeiro grupo, cujo efeito é geralmente local ou, no

máximo, regional, esses têm o poder de afetar o ambiente em escala global.

A contaminação humana pelo mercúrio presente na água e nos alimentos é

de extrema importância, haja vista ter sido responsável por trágicos episódios de

intoxicação, como os ocorridos no Japão, nas décadas de 50 e 60, e no Iraque na

década de 70 (Almeida et al., 2006).

1.5.1 O mal de Minamata

O exemplo mais notório de um envenenamento maciço por mercúrio ocorreu

na baía de Minamata, Japão, entre os anos de 1930 e 1960. A Chisso Corporation

de Tokyo (maior indústria de plásticos do Japão) despejou o mercúrio na Baía de

Minamata. O MeHg alcançou altas concentrações nos peixes, cerca de 40 µg/g, uma

quantidade enorme quando comparada à recomendada pela FDA dos EUA de não

consumir peixe com concentração de MeHg acima de 1,5 µg/g (Schwartz, 2005), ou

ao limite máximo permitido pela legislação vigente no Brasil, que é de 0,5 µgHg/g

(Vieira et al., 2005).

Segundo Magalhães (1995), os níveis de mercúrio nas águas próximas à

descarga eram de 2000 µg/L, sendo que o máximo permitido poderia ser de 1,6 a

3,6 µg/L. Os peixes, base da dieta alimentar da população da região de Minamata,

atingiam uma concentração de mercúrio muito acima do máximo admitido, que

atualmente é de 0,5 µg/g.

A contaminação provocada pelo mercúrio na Baía de Minamata, a partir de

1932 passou a chamar atenção da opinião pública mundial para o perigo do uso

indiscriminado desse metal, principalmente pelos óbitos registrados no início da

década de 1950. Porém, somente 24 anos depois do início da produção da Chisso,

1956, constatou-se que a doença era resultado da ingestão de metal pesado sem,

no entanto, identificar qual era o metal. Ainda na década de 50 o médico Hosakawa

constatou que o envenenamento era provocado por mercúrio. Somente em 1968, no

entanto, é que o governo japonês determinou que a Universidade de Kumamoto

pesquisasse o assunto; e os resultados vieram confirmar a constatação feita por

Hosakawa (Rocha & Canto-Lopes, 2002).

As vilas em torno da baía eram economicamente dependentes da pesca, de

modo que o peixe fazia parte da alimentação regular dos aldeões. Por não terem

sido informados sobre os perigos dos altos níveis de MeHg, cerca de 200.000

pessoas foram contaminadas (Schwartz, 2005). Centenas destas morreram e, com o

passar do tempo, milhares passaram a ser vítimas de uma doença crônica,

debilitante do sistema nervoso, conhecida hoje como Mal de Minamata. Nos

indivíduos expostos ao metilmercúrio que apresentaram intoxicação ocorreu

neuropatia, que começava por sensação de formigamento das extremidades distais,

dos lábios e da língua, disartria, surdez, cegueira e espasticidade. Surgiram,

também, tremores e movimentos involuntários, deficiência mental, infecções

recorrentes, coma e morte, no período entre 26 dias e quatro anos após o contato

(Karland et al., 1960)

Ainda segundo Karland et al. (1960), nas crianças evidenciou-se síndrome

neurológica de descorticação, e as que foram expostas ao metilmercúrio na fase

fetal nasceram com síndrome de paralisia cerebral. Autópsias de pessoas e animais

(pássaros e gatos) intoxicados e mortos mostraram grande destruição do cerebelo,

do córtex e dos gânglios cerebrais basais.

1.5.2 Acidentes com fungicidas

Na década de 70, no Iraque, Paquistão, Gana e Guatemala ocorreram vários

casos de contaminação de agricultores e seus familiares, que utilizavam grãos, para

confecção de pão caseiro, tratados com fungicidas a base de metil e etilmercúrio. No

caso particular do Iraque, mais de 6.900 pessoas foram hospitalizadas e pelo menos

459 morreram. Em 1969, nos Estados Unidos, a intoxicação resultou da ingestão de

carne de porco alimentado com grãos tratados com fungicidas organomercuriais

(Barce, 2006).

Com base nos estudos epidemiológicos dos casos de Minamata e de

envenenamento por ingestão de grãos contaminados com fungicida mercurial no

Iraque, a Organização Mundial de Saúde (WHO, 1990) estabeleceu as

recomendações da concentração máxima de mercúrio no peixe segura para a

saúde. De acordo com a OMS, peixes contendo até 300 ng/g (partes por bilhão)

podem ser consumidos diariamente, enquanto peixes contendo entre 300 e 500 ng/g

deverão ser consumidos eventualmente, enquanto que peixes contendo acima do

limite de 500 ng/g não deverão ser consumidos. Grupos de risco como as mulheres

grávidas e crianças devem estar mais atentos devido à

sua elevada sensibilidade em relação à intoxicação do mercúrio.

1.5.3 A questão do garimpo de ouro na Amazônia

A poluição ambiental pelo mercúrio, resultante da utilização desse metal na

atividade garimpeira de ouro, é um exemplo importante de ameaça à saúde de

populações da Amazônia decorrente da ocupação acelerada dessa região pelo

homem nas últimas décadas (Silveira et al., 2004).

No início da década de 1970, com o aumento da produção do ouro, o

interesse da sociedade capitalista voltou-se para os garimpos, os quais foram

parcialmente mecanizados, com a introdução de retroescavadeiras, pás mecânicas,

bombas de água potentes, uso de explosivos, entre outros. A transformação desses

ambientes foi expressa pelo desmatamento, pela poluição dos rios com o mercúrio

advindo do processamento do ouro, assoreamento e desvios dos cursos dos rios, e

aparecimento de gigantescas crateras, à medida que a frente garimpeira avançou

(Couto, 1990).

O crescimento acentuado da produção brasileira de ouro nas décadas de

1970 e 1980 colaborou para uma alteração marcante do padrão de morbidade na

região amazônica (Santos et al., 1995).

Dada a elevada contribuição do ouro do garimpo para a produção total, bem

como a notória dependência da garimpagem em relação à mão-de-obra, pode-se

desde logo concluir que o crescimento do produto implicou intensa mobilização de

contingentes humanos. É difícil precisar o número de garimpeiros existentes no

Brasil naquele período. A única fonte oficial que existe é um cadastro realizado pelo

Departamento Nacional de Produção Mineral em 1990. Este cadastro mostrou um

número, provavelmente subestimado, de 419.920 trabalhadores, distribuídos

principalmente no Estado do Pará (52,7%), sendo seguido por Mato Grosso,

Rondônia e Goiás (Santos et al., 1995).

A poluição da Amazônia em termos de mercúrio representa grave problema

ambiental. De acordo com Meech et al. (1997), 70 a 170 toneladas são lançadas

anualmente no meio ambiente pelas atividades informais de mineração de ouro,

além dos incêndios, em que a vegetação queimada constitui uma fonte primária de

emissões de Hg. Essa grande quantidade do metal sofre metilação, acumulando-se

em peixes da cadeia alimentar.

A oxidação do metal, que permite sua melhor dissolução para posterior

metilação, garantindo sua estabilidade em ambientes aquáticos, foi avaliada por

análises termodinâmicas e eletroquímicas. Evidenciou-se que, na presença de

ácidos orgânicos, há formação de complexos orgânico-Hg. Embora a metilação

dessas espécies solúveis de mercúrio não seja totalmente elucidada, a formação de

tais complexos em águas de rios deve contribuir para aumentar a disponibilidade do

Hg ali presente como contaminante (Meech et al., 1997).

As comunidades ribeirinhas e grupos indígenas são os principais afetados

pela contaminação de mercúrio. Estudos demonstraram que em algumas regiões a

concentração de MeHg nos peixes está abaixo do limite recomendado para consumo

pela legislação brasileira, porém o consumo contínuo de peixes e em grande

quantidade pelas comunidades indígenas pode tornar-se um importante fator de

risco de toxicidade crônica (Lebel et al., 1998).

A região Oeste do Estado do Pará apresenta um histórico de intensa atividade

garimpeira arcaica com grande derramamento de mercúrio no ambiente. Os níveis

do mercúrio detectados por diferentes trabalhos em populações expostas da bacia

do Rio Tapajós foram elevados em certas comunidades (São Luís do Tapajós,

Barreiras e Rainha), no entanto, apresentando uma diminuição gradual com o passar

dos anos (Sá et al., 2006).

O risco de intoxicação pela ingestão de peixe contaminado depende de

alguns fatores, sendo que o teor de mercúrio, a quantidade ingerida e a freqüência

de ingestão são determinantes para a acumulação de metilmercúrio no organismo

humano. Cuidados especiais, no entanto, devem ser tomados com grupos de risco,

como gestantes, pós-gestantes e recém-nascidos (Yallouz et al., 2001).

Segundo Harada et al. (2001), o aparecimento, na Amazônia, de

manifestações clínicas semelhantes às do Mal de Minamata, deverá seguir a regra

da evolução da contaminação ambiental, em cinco estágios: 1) contaminação

ambiental pelo mercúrio inorgânico; 2) transformação do mercúrio inorgânico em

mercúrio orgânico (biometilação); 3) acúmulo do mercúrio orgânico na cadeia

alimentar aquática; 4) acúmulo do organo-metal pelo homem através da ingestão de

peixes; 5) aparecimento dos sinais e sintomas do Mal de Minamata.

1.6 PEIXES DA BACIA DO TAPAJÓS

A população ribeirinha do Tapajós, Estado do Pará, encontra no pescado sua

principal fonte de alimentação. Nos últimos anos, alguns estudos têm demonstrado

que peixes da região podem apresentar teores de mercúrio acima do recomendável

para o consumo humano, tornando essa população grupo de risco de contaminação

ambiental pelo metal (Pinheiro et al., 2000), dados nem sempre confirmados por

outros autores.

A Bacia do Tapajós é uma das regiões mais estudadas da Amazônia, sendo

vários os trabalhos encontrados sobre determinação dos teores de Hg total em

peixes. Para esta região os peixes mais comumente analisados são dourado, jaú,

piraíba, mandubé, cachorro, traíra, apapá, pescada, tucunaré, filhote, pirarucu,

acará, aruanã, pacu, surubim, matrinxã, jaraqui, sarda, jiju, jacundá, tambaqui e

aracu. As concentrações de Hg total para estas espécies em área de mineração

variaram de 0,02 até 2,75 mg/kg e ficaram abaixo de 0,1 mg/kg para peixes

coletados em rios não contaminados (Malm et al., 1997).

Vieira et al. (2005) quantificaram o teor de mercúrio total em peixes

provenientes de Itaituba-Pará, através de análise por espectrofotometria de

absorção atômica com amalgamação em lâminas de ouro dos teores de mercúrio

em amostras de filé de peixes. A concentração média de mercúrio total em

Colossoma macrapomum (tambaqui) foi de 0,28±0,08µg/g, enquanto que em Cichla

sp. (tucunaré) foi de 0,35±0,09µg/g. Os dados indicam que os teores médios do

metal nas espécies analisadas, encontram-se abaixo do limite máximo permitido

pela legislação vigente, isto é 0,5 µgHg/g. Entretanto, em dois exemplares, um de

cada espécie, correspondente a 4,25% das amostras, os valores superaram tal

limite, caracterizando, assim, a possível exposição humana ao metal.

A dinâmica específica dos ambientes aquáticos da região, em função do

processo de inundação sazonal, pode causar modificações na alimentação dos

peixes e/ou facilitar o desenvolvimento de condições favoráveis à produção do

MeHg. De acordo com o estudo de Roulet et al. (2000), realizado no baixo Tapajós,

os espaços adjacentes aos cursos d’água constituem sítios importantes para a

produção do MeHg. Nesses sítios, a produção e a acumulação do MeHg é

estreitamente relacionada à inundação e à degradação da matéria orgânica

(Guimarães et al., 2000).

1.7 ANÁLISES DE GENOTOXICIDADE

Um aspecto comum a todos os metais pesados é uma forte afinidade por

enxofre e sua interação com sistemas biológicos é geralmente por meio da ligação

com grupamentos sulfidrila (–SH) de proteínas. Resíduos cisteinil têm papéis

essenciais na função de muitas enzimas, particularmente aquelas envolvidas em

hidrólises e reações do tipo redox, como a glutationa redutase (Bilitewski & Turner,

2000).

O mercúrio, como alguns outros metais e certos compostos organomercuriais,

tem demonstrado propriedades mutagênicas. Essa toxicidade ocorre sobre a

tubulina, a subunidade estrutural dos microtúbulos das células, os quais estão

envolvidos na organização citoplasmática e constituem as fibras do fuso, interferindo

na polimerização e provocando contração dos cromossomos na metáfase, retardo

na divisão do centrômero e movimento anafásico reduzido (Cassidy & Furr, 1978;

Thier et al., 2003).

Análises de genotoxicidade são aquelas que levam em consideração a

vulnerabilidade do material genético (DNA) a agressões impostas pelo ambiente.

Tais avaliações dividem-se basicamente em análises mutagênicas, carcinogênicas e

teratogênicas (Ferreira, 2004). De acordo com a mesma autora, dentre as análises

mutagênicas mais comuns realizadas com organismos aquáticos, podem-se

destacar: teste de aberrações cromossômicas, teste de trocas entre cromátides-

irmãs, teste dos micronúcleos, deformidades citoplasmáticas e nucleares, e ensaio

cometa.

O teste de aberrações cromossômicas consiste na avaliação de alterações

provocadas por xenobióticos, em uma ou ambas as cromátides e que resultam de

quebras apenas ou quebras seguidas de soldadura. As quebras resultam na

diminuição do tamanho do cromossomo e são identificadas por um fragmento

deslocado, não alinhado com o resto da cromátide ou que apresenta

descontinuidade em relação ao resto do cromossomo, maior que a largura da própria

cromátide (Rabelo-Gay, 1991).

A respeito do teste das trocas entre cromátides-irmãs (TCI), Varela-Garcia

(1991) fez um relato sobre o histórico, execução e viabilidade. Como descrito por

esse autor, as TCI são manifestações citológicas de quebras que ocorrem no

mesmo lócus das duas cromátides de um cromossomo, seguidas de intercâmbio e

reparo. Para a coloração assimétrica das cromátides-irmãs podem ser utilizados

fluorocromos (por exemplo, alaranjado de acridina), que requerem análise ao

microscópio de epifluorescência, ou corantes como Giemsa.

O teste do micronúcleo desenvolvido por Schmid (1975) usando células da

medula óssea de mamíferos tem sido aplicado extensivamente para testar a

genotoxicidade de compostos químicos. Excelentes resultados têm sido obtidos com

esse teste em invertebrados, peixes e anfíbios, no monitoramento de áreas

contaminadas (Campana et al., 2003).

Os micronúcleos (MN) provêm de fragmentos cromossômicos acêntricos ou

cromossomos inteiros que se atrasaram e não foram incorporados ao núcleo

principal da célula-filha durante a divisão celular. São considerados micronúcleos

clássicos aquelas estruturas esféricas ou ovais, bem delimitadas, de mesma

refringência que o núcleo principal, não ligadas a este. No caso específico dos

peixes, devido ao tamanho normalmente reduzido dos cromossomos, os

micronúcleos variam na faixa de 1/30 a 1/10 do tamanho do núcleo normal (Al-Sabti

& Metcalfe, 1995; Ayllon & Garcia-Vazquez, 2000).

Pelo teste dos micronúcleos podem-se detectar compostos que interferem na

formação do fuso mitótico, alterando a distribuição eqüitativa dos cromossomos

durante a divisão celular, ou ao nível de proteínas diretamente envolvidas na

segregação cromossômica, com a vantagem de ser mais rápido que a análise de

aberrações cromossômicas (Al-Sabti & Metcalfe, 1995). Assim, este teste detecta

tanto eventos aneugênicos (alterações no número de cromossomos do genoma,

devido a erros na distribuição destes durante o processo de divisão celular), quanto

eventos clastogênicos (quebras que produzem alterações na estrutura dos

cromossomos).

Uma das vantagens é que pode ser aplicado em qualquer população de

células em proliferação sem depender do cariótipo envolvido. Devido aos peixes

terem um grande número de cromossomos, e muitas vezes de pequeno tamanho, as

análises das metáfases para avaliação de aberrações cromossômicas são

dificultadas, enquanto que o estudo de micronúcleos é fácil e possível de ser

realizada em eritrócitos, devido ao fato destes serem nucleados (Hayashi et al.,

1998).

Micronúcleos resultam de lesões no DNA ou cromossomos, ou em nível de

proteínas direta ou indiretamente envolvidas na segregação cromossômica (como a

tubulina, por exemplo). A formação de micronúcleos depende da perda de

fragmentos cromossômicos ou de cromossomos inteiros, e requer divisão mitótica ou

meiótica (Kirsch-Volders et al., 2003).

Sabe-se que perdas cromossômicas e a não segregação de cromossomos

(não disjunção), são importantes eventos no câncer e que eles são causados por

defeitos no fuso, centrômero ou como uma conseqüência da não-condensação da

estrutura cromossômica antes da metáfase (Fenech, 2000).

As vantagens do teste do micronúcleo incluem, além da simplicidade e

rapidez: (1) MN pode ser observado durante o ciclo celular, e o número de células

contáveis é ilimitado; (2) A contagem pode ser feita por qualquer pessoa com pouco

treinamento em citogenética; (3) não é necessário um cariótipo favorável; (4) o MN

formado persiste pelo menos até a próxima intérfase; (5) não é necessário nenhum

reagente para bloquear o fuso (Heddle et al., 1983).

É possível fazer a contagem de MN por programas computacionais; como o

Cytoscan, que é um programa de captura de imagens que não requer a contínua

transferência de informação digital do microscópio para o computador, podendo

escanear uma área de 10cm2 por lâmina em 5 minutos (Al-Sabti & Metcalfe, 1995).

Carrasco et al. (1990) sugerem que se utilize, além da contagem dos MN,

também a contagem de alterações morfológicas nucleares. Estas alterações foram

descritas e classificadas como:

(1) Blebbed: núcleos com uma pequena evaginação da membrana nuclear,

parecendo conter eucromatina ou heterocromatina (mais escuro). Os tamanhos

destas evaginações situam-se na faixa de pequenas protuberâncias até estruturas

completamente circunscritas, semelhantes aos micronúcleos, mas ainda ligadas ao

núcleo principal.

(2) Lobed: núcleos com evaginações mais largas do que as descritas para

Blebbed. Sua estrutura não é tão definida como a anterior. Alguns núcleos

apresentam várias destas estruturas.

(3) Vacuolated: núcleos que apresentam uma região que lembra os vacúolos

no seu interior. Estes “vacúolos” apresentam-se destituídos de qualquer material

visível no seu interior.

(4) Notched: núcleos que apresentam um corte bem definido em sua forma.

Geralmente com uma profundidade apreciável no núcleo. Estes cortes parecem não

possuir nenhum material nuclear e parecem ser delimitados pelo envelope nuclear.

As deformidades citoplasmáticas e nucleares são produzidas em resposta

a xenobióticos e consideradas como manifestações quantificáveis de genotoxicidade

em organismos aquáticos. Muitas vezes essas estruturas observadas nas células do

sangue periférico de vertebrados aquáticos, exibindo DNA extranuclear, podem ser

confundidas com micronúcleos. Tais alterações caracterizam-se por fragmentações

e vacuolização de eritrócitos, irregularidades na carioteca, eritrócitos exibindo

aglomerados de cromatina e aumento dos espaços de intercromatina (Ferreira,

2004).

O ensaio cometa , também conhecido como SCGE (single cell gel

electrophoresis), é uma técnica rápida e sensível de análise e quantificação de

danos ao DNA de células individuais. Assim, é usada na pesquisa de câncer,

avaliação de genotoxicidade e efetividade da quimioprevenção. A imagem que é

obtida lembra um “cometa” com cabeça e cauda distintas. Esta técnica foi

desenvolvida por Östling & Johansson em 1984, porém Singh et al. (1988) a

modificaram, como o Ensaio Cometa Alcalino.

A técnica do ensaio cometa consiste em células individualizadas,

colocadas em agarose sobre uma lâmina de microscopia, lisadas, submetidas

a eletroforese e coradas com brometo de etídio. O resultado é observado ao

microscópio, sendo que as células sem DNA danificado apresentam um

núcleo redondo, enquanto o DNA resultante de quebras simples ou múltiplas

migra para fora do núcleo, formando uma cauda, parecendo um cometa.

Como a cabeça é composta de DNA intacto e a cauda consiste de DNA danificado

ou quebrado, a extensão da migração do DNA reflete a extensão dos danos

(Fairbairn et al., 1995).

O papel da lise no ensaio cometa é o de remover os conteúdos

celulares, com exceção do material nuclear. O DNA permanece bem

condensado devido à presença de uma pequena quantidade de proteínas

não-histônicas. Porém, quando colocado na solução de eletroforese, a qual

possui um pH > 13, a espiralização do DNA começa a relaxar a partir de

pontos de quebra da fita. Permitindo desta maneira que os mesmos sejam

revelados pela eletroforese na seqüência do teste (Yendle et al., 1997; Collins

et al., 1997).

O ensaio cometa é habitualmente realizado com eritrócitos, pois estes são

facilmente obtidos por métodos não destrutivos e não necessitam do passo adicional

de isolamento, porém outros tecidos também têm sido testados, pois os efeitos de

genotoxicidade de contaminantes podem ser muitas vezes tecido-específicos. Os

tecidos mais pesquisados, além do sanguíneo, são do fígado, por se tratar do

principal órgão do metabolismo, das brânquias, devido ao seu contínuo contato com

a fase aquosa e do rim, tecido produtor de sangue em peixes (Belpaeme et al.,

1998).

Ao contrário de outros tipos de ensaio como os testes de micronúcleo, de

aberrações cromossômicas ou de trocas de cromátides irmãs, que necessitam de

células em proliferação para sua viabilidade, o ensaio cometa não necessita desta

condição, podendo ser utilizado em, virtualmente, qualquer tipo de célula. Também

não pode ser esquecido que o tipo de dano observado pelo ensaio é possivelmente

reversível, o que já foi observado por vários autores em estudos de monitoramento

ambiental (Pandrangi et al., 1995).

As vantagens dessa técnica incluem além da sensibilidade na

detecção de dano no DNA: (a) a coleta de dados em nível de células

individuais; (b) o uso de um número pequeno de células para a análise; (c) a

possibilidade de aplicação em qualquer população de células eucarióticas

isoladas (Tice & Vasquez, 1999).

Uma das dificuldades do uso do teste cometa em trabalhos

ambientais, é a comparação dos resultados com diferentes métodos de

quantificação do dano. Atualmente utiliza-se tanto tamanho da cauda com

relação ao núcleo quanto porcentagem de fragmentação da cauda, ou ambos

(Lee & Steinert, 2002).

Várias são as metodologias empregadas para avaliar a extensão do

dano ocasionado ao DNA. Uma das medidas utilizadas na avaliação deste

dano é feita pela relação entre o raio do núcleo e a extensão das caudas

formadas pelo DNA em migração (classificados como classe 0 = nenhum

dano, até classe 4 = máximo dano). Esta análise tanto pode ser feita

visualmente como através de softwares especiais (Ferraro et al., 2004).

Durante o curso de doutoramento reunimos numerosas publicações

abordando o uso do Ensaio cometa na avaliação de efeitos genotóxicos em peixes,

o que nos permitiu a elaboração de uma breve revisão intitulada “Evaluation of

Genotoxic Effects of Xenobiotics in Fishes Using Comet Assay – A Review”, a qual

foi publicada no periódico Reviews in Fisheries Science 17(2): 170–173, 2009. O

referido artigo encontra-se em um apêndice ao final deste trabalho.

1.7.1 Estudos de efeitos genotóxicos de metais pes ados em peixes

Para melhor compreender os efeitos de xenobiontes nos ecossistemas, são

realizados bioensaios com a utilização de biomarcadores. Os bioensaios auxiliam no

conhecimento das reações biológicas de um xenobionte em um dado ser vivo dentro

de uma cadeia trófica. Este conhecimento permite comparações com dados obtidos

diretamente do ambiente, ou ainda deduzir se a concentração do agente genotóxico

utilizado pode ou não provocar alterações no DNA ou patologias nos tecidos e

órgãos (Lopes-Poleza, 2004).

Pode-se detectar se o agente genotóxico está interagindo com o material

genético pelo aparecimento de adutos em proteínas (albumina e hemoglobina) e no

DNA, assim como pelas trocas entre cromátides-irmãs, refletindo uma exposição

primária. Um resultado positivo a este nível, entretanto, não indica necessariamente

conseqüências adversas, já que parte do dano genotóxico primário pode ser

reversível (Benito, 2002).

O uso de bioensaios permite estudar os efeitos tóxicos de determinados

contaminantes de forma isolada ou associados, minimizando a influência das

variáveis ambientais. Os resultados obtidos através de bioensaios não podem ser

transferidos diretamente para o ambiente, mas auxiliam no fornecimento de uma

base de dados visando um melhor entendimento dos fatores que estão interferindo

na saúde dos organismos e/ou alterando as condições do próprio ambiente

(Ramsdorf, 2007). A maioria dos estudos que avaliam a toxicidade de poluentes aos

organismos aquáticos e seus sistemas têm investigado exposições a tóxicos

individuais (Bagdonas & Vosyliené, 2006).

Um número considerável de estudos dos efeitos genotóxicos e mutagênicos

de metais pesados e seus compostos inorgânicos e orgânicos em peixes foi

publicado nos últimos 10 anos, tanto provenientes de trabalhos de biomonitoramento

in situ, quanto de bioensaios. Alguns são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 – Recentes estudos de genotoxicidade de metais pesados em diversas espécies de peixes.

Organismos Tipos de Célula Técnicas Metais Contaminantes Referências

Anguilla Anguilla Células de Rim Teste do Micronúcleo Cádmio e Mercúrio Sanchez-Galan et al., 2001.

Hoplias malabaricus Eritrócitos Aberrações Cromossômicas e Ensaio

Cometa Chumbo Cestari et al., 2004.

Hoplias malabaricus Eritrócitos Aberrações Cromossômicas Ensaio Cometa e Teste do Micronúcleo

Chumbo Ferraro et al., 2004.

Hoplias malabaricus Eritrócitos Aberrações Cromossômicas Ensaio Cometa e Teste do Micronúcleo

Mercúrio Lopes-Poleza, 2004.

Danio rerio Eritrócitos Citometria de Fluxo e Teste do

Micronúcleo Urânio Barillet et al., 2005.

Cyprinus carpio, Carassius gibelio e Corydoras paleatus

Eritrócitos e Células de Brânquias e de Fígado

Teste do Micronúcleo Cobre e Cádmio Cavas et al., 2005.

Prochilodus nigricans, Mylossoma duriventris e Hoplias malabaricus

Eritrócitos Teste do Micronúcleo Mercúrio Porto et al., 2005.

Genidens genidens, Cathorops spixii, Sciadeichtys luniscutis, Haemulon steindachneri e Micropogonias furnieri

Eritrócitos Teste do Micronúcleo Mercúrio Ramos et al., 2005.

Oncorhynchus mykiss Eritrócitos Teste do Micronúcleo Cobre e Zinco Bagdonas & Vosyliené, 2006.

Oreochromis niloticus Eritrócitos Ensaio Cometa e Teste do

Micronúcleo Cromo Matsumoto et al., 2006.

Clarias gariepinus, Alburnus orontis e Mugil cephalus

Eritrócitos Teste do Micronúcleo Cobre, Cádmio, Níquel e

Chumbo Ergene et al., 2007.

Oncorhynchus mykiss Eritrócitos Teste do Micronúcleo Cobre, Zinco, Chumbo, Níquel,

Cromo e Manganês Andreikënaitë et al., 2007.

Carassius auratus auratus Eritrócitos e Células

Epiteliais de Brânquias e Nadadeiras

Teste do Micronúcleo Mercúrio e Chumbo Cavas, 2008

Chondrostoma nasus e Barbus capito pectoralis

Eritrócitos Teste do Micronúcleo Cobre, Zinco, Cádmio, Cobalto

e Chumbo Koca et al., 2008.

Sanchez-Galan et al. (2001) utilizaram as análises de teor de cádmio e de

mercúrio no fígado e o Teste do Micronúcleo em células renais da enguia Anguilla

anguilla de sítios de rios com diferentes níveis de poluição com esses metais

pesados. Apesar do teor de cádmio no fígado apresentar associação com o nível de

cádmio dos sedimentos, as outras análises (teor de mercúrio no fígado,

micronúcleos) não apresentaram resultados significativos.

Lopes-Poleza (2004) avaliou o efeito genotóxico do metilmercúrio por via

trófica na traíra Hoplias malabaricus, um peixe predador de hábito alimentar

piscívoro. As análises foram feitas através das freqüências de aberrações

cromossômicas (rim anterior), de micronúcleos e alterações na forma dos núcleos e

do Ensaio Cometa em eritrócitos de sangue periférico. Neste estudo, apenas foram

observadas diferenças significativas entre os grupos controle e contaminado no

Teste de Aberrações Cromossômicas.

Porto et al. (2005) utilizaram o Teste do Micronúcleo em três espécies de

peixes Characiformes de diferentes hábitos alimentares para avaliar efeitos

genotóxicos da poluição por mercúrio. Obtiveram distintas freqüências de

micronúcleos nos peixes coletados em dois rios da Bacia Amazônica: rio Madeira

(área poluída) e rio Solimões (área não poluída). Também observaram que a

freqüência média de MN na espécie piscívora foi cerca de cinco vezes maior que

nas espécies detritívora e onívora.

Ramos et al. (2005) avaliaram a contaminação por mercúrio em tecido

muscular, sangue total, plasma e hemácias de cinco espécies de peixes (Genidens

genidens, Cathorops spixii, Sciadeichtys luniscutis, Haemulon steindachneri e

Micropogonias furnieri) da Baía do Ribeira, município de Angra dos Reis (RJ, Brasil).

Um dos objetivos foi avaliar efeitos genotóxicos por meio do teste do micronúcleo e

núcleo bilobado em eritrócitos, comparando com resultados anteriores em

espécimes de Netuma barba da Baía de Guanabara. Foi verificado que tanto a

freqüência de micronúcleos quanto a de núcleos bilobados eram estatisticamente

diferentes nas duas áreas, sugerindo que os peixes da Baía de Guanabara

apresentaram uma freqüência maior de efeitos cromossômicos por estarem

expostos a diversos tipos de contaminantes, inclusive o mercúrio.

Cavas (2008) utilizou o Teste do Micronúcleo, sob coloração por alaranjado

de acridina, para avaliação in vivo da genotoxicidade do cloreto de mercúrio e do

acetato de chumbo em diferentes células de Carassius auratus auratus. As

freqüências de MN nos três tipos de células foram elevadas nos peixes expostos

tanto ao cloreto de mercúrio quanto ao acetato de chumbo. Por outro lado, as

freqüências de MN, tanto no grupo controle quanto no contaminado, foram maiores

em células de brânquias que nas outras células testadas. O estudo também

confirmou que a coloração por alaranjado de acridina é conveniente para o estudo

de micronúcleos in vivo em peixes.

1.8 JUSTIFICATIVA

O trabalho proposto se justifica ao considerarmos que a forma mais tóxica do

mercúrio, o metilmercúrio (MeHg), é um composto orgânico com grande estabilidade

química, o que aliado à sua alta afinidade por lipídios (membranas biológicas) o

conduz a um trânsito preferencial e estável pela biota. O MeHg, por outro lado,

apresenta o fenômeno de biomagmificação de forma mais eficiente do que qualquer

outro poluente metálico e este fenômeno é muito melhor documentado em sistemas

aquáticos onde, dependendo do grau de poluição ambiental, podem ser

contaminados organismos de vários níveis tróficos (WHO, 1989; WHO, 1990; Lebel

et al., 1998; Boening, 2000; UNEP, 2002; Azevedo, 2003; Barkay et al., 2003;

Lacerda & Malm, 2008).

A ingestão pelo homem representa a passagem do MeHg a um elo mais

elevado na cadeia alimentar, o que pode representar conseqüências dramáticas à

saúde de populações humanas com hábitos alimentares restritos, que incluem

basicamente peixes e outros organismos aquáticos contaminados. Além disso,

particularmente na região do rio Tapajós, diversas comunidades humanas têm

exposição confirmada ao metilmercúrio (MeHg), exibindo, algumas vezes, índices

acima dos limites de segurança (WHO, 1990; Malm et al., 1997; Lebel et al., 1998;

Pinheiro et al., 2000; Harada et al., 2001; Silveira et al., 2004; Schwartz, 2005; Vieira

et al., 2005; Almeida et al., 2006; Sá et al., 2006).

Na literatura encontramos um grande número de trabalhos sobre

biomagnificação de metais pesados, como o mercúrio, o que lhe garante uma

condição de conhecimento relativamente bem documentado. Constatamos também

a carência de trabalhos que, como este, avaliem as respostas genotóxicas de peixes

isentos da influência de suas posições tróficas.

Além disso, os peixes freqüentemente respondem aos tóxicos de forma

semelhante aos vertebrados superiores, podendo ser usados em bioensaios para

exposição aos xenobiontes que têm potencial de causar efeitos teratogênicos e

cancerígenos em humanos (Al-Sabti & Metcalfe, 1995; Lopes-Poleza, 2004).

Finalmente, devido à ainda escassa informação sobre genotoxicidade em espécies

nativas, trabalhos como este se fazem necessários como contribuição na geração de

bancos de dados mais consistentes (Cestari et al., 2004).

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar as alterações genotóxicas induzidas pelo cloreto de metilmercúrio

(CH3HgCl), por via hídrica em peixes que ocupam diferentes níveis da cadeia trófica

no rio Tapajós, porém com o intuito de demonstrar possíveis diferenças específicas,

independentemente de suas relações tróficas no ambiente natural. As avaliações

foram feitas por meio de bioensaios, utilizando o Ensaio cometa e o Teste do

micronúcleo.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Os seguintes objetivos específicos foram delineados:

• Determinar o dano no DNA através do Ensaio Cometa em núcleos de

eritrócitos de sangue periférico de Colossoma macropomum e

Aequidens tetramerus;

• Determinar a freqüência de Micronúcleos Písceos (MNP) e de

alterações morfológicas nucleares em eritrócitos de sangue periférico

de Colossoma macropomum e Aequidens tetramerus;

• Comprovar a provável diferença entre efeitos genotóxicos primários e

efeitos mutagênicos do cloreto de metilmercúrio nos peixes estudados;

• Verificar se existe diferença significativa de respostas entre as espécies

Colossoma macropomum e Aequidens tetramerus, quanto aos efeitos

genotóxicos e mutagênicos do MeHg.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 MATERIAIS

3.1.1 Organismos utilizados como bioindicadores

Foram utilizados peixes de duas espécies neotropicais (Colossoma

macropomum e Aequidens tetramerus) que ocorrem naturalmente nas bacias da

Amazônia e que ocupam diferentes nichos tróficos. Essas espécies foram escolhidas

por serem de fácil adaptação e manutenção nas condições laboratoriais:

Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) – o tambaqui (Figura 5), de hábito

onívoro, nativo da Bacia Amazônica, Orinoco e seus rios afluentes, como o Tapajós.

C. macropomum, pertencente à família Characidae, constitui-se num dos maiores

peixes de valor econômico da região Amazônica. É o segundo maior peixe de

escamas e o maior Characiforme do rio Solimões/Amazonas que, no ambiente

natural, pode chegar até 100 cm de comprimento e 30 kg de peso (Araújo-Lima &

Goulding, 1998). Por possuir carne bastante apreciada pela população local e por

apresentar certo declínio na captura em ambiente natural, o tambaqui é a principal

espécie cultivada na região Norte, destacando-se na piscicultura de seis dos sete

estados da região (Val et al., 2000). Estudos citogenéticos demonstram que C.

macropomum apresenta um número diplóide 2n = 54, com o cariótipo composto de

20 metacêntricos e 34 submetacêntricos, e um número fundamental (NF) de 108

(Almeida–Toledo et al., 1987; Nirchio et al., 2003).

Aequidens tetramerus (Heckel, 1840) – o acará sela (Figura 6), de hábito

carnívoro (mais precisamente piscívoro) é amplamente distribuído na bacia do Rio

Amazonas, incluindo rios do Peru, Colômbia, Equador, Brasil e Bolívia. Também

ocorre no Rio Tocantins, Rio Parnaíba, na Guiana Francesa, Suriname, Guiana, e na

bacia do Rio Orinoco. A análise cariotípica realizada em A. tetramerus revelou a

presença de 48 cromossomos, fórmula cariotípica 8M-SM+40ST-A (Ribeiro, 2007).

Figura 5 – Espécime de Colossoma macropomum. Foto: O autor (2008).

Figura 6 – Espécime de Aequidens tetramerus. Foto: O autor (2008).

1 cm

1 cm

3.1.2 Coleta e aclimatação dos animais

Os tambaquis utilizados nos bioensaios foram fornecidos pela Estação de

Piscicultura da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), no município de

Castanhal, a 70 km de Belém; os acarás foram doados pelo professor Augusto

César Paes de Souza, de seu cultivo particular em Belém.

Os peixes, de ambas as espécies, foram mantidos em aquários (Figura 7),

sob manejo, no Laboratório de Biologia Aquática do Instituto Federal de Educação,

Ciência e Tecnologia do Pará (IFPA), em Belém – PA.

Figura 7 - Visão geral dos aquários no Laboratório de Biologia Aquática do IFPA, onde ocorreram os períodos de aclimatação e exposição dos animais. Foto: O autor (2008).

Os aquários funcionaram em sistema semi-estático, com limpeza e troca de

1/3 da água a cada 48 horas. Durante este período os peixes foram alimentados

diariamente, com ração comercial (28% de proteína bruta). Estas condições foram

mantidas durante o período de aclimatação. Após a contaminação, apenas foi

suspensa a troca de água. Os peixes foram mantidos em água desclorificada,

temperatura controlada (em torno de 28ºC), aeração constante e periodicidade

luminosa (12/12 h) por um período de aclimatação de 30 dias.

3.2 MÉTODOS

3.2.1 Tratamento dos animais e obtenção do sangue p ara os bioensaios

Tambaquis e acarás foram submetidos ao tratamento com metilmercúrio na

concentração inicial de 2 mg.L-1. A escolha da concentração foi baseada no maior

valor encontrado na literatura (Magalhães, 1995), bem como em nossos

experimentos prévios buscando a dose máxima tolerada.

As duas espécies de peixes foram contaminadas a partir da água (via hídrica).

Decorrido o período de aclimatação, cada bioensaio teve início.

Para a obtenção do sangue, os peixes foram primeiramente anestesiados

com gelo, por cerca de 3 minutos (Normann et al., 2008). Em seguida, com o auxílio

de uma seringa heparinizada, o sangue foi coletado, sendo 1 mL de sangue

periférico de cada animal armazenado em microtubos de 1,5 ml, para o Ensaio

Cometa. Uma gota de sangue, da mesma seringa, foi colocada em lâmina e

imediatamente feito o esfregaço para o Teste do micronúcleo (foram confeccionadas

duas lâminas de cada animal).

Figura 8 – Esquema resumido dos bioensaios. Elaboração: O autor (2009).

3.2.2 Ensaio Cometa

Para o Ensaio cometa usamos o procedimento de Singh et al. (1988), com

pequenas modificações (Hartmann & Speit, 1997). Foram preparadas duas lâminas

de cada animal. Utilizamos lâminas previamente cobertas com agarose normal

(Gibco). Do sangue coletado, 10 µL foram diluídos em 1 mL de soro bovino fetal.

Desta solução, foram coletados 10 µL e misturados com 120 µL de gel de agarose

com baixo ponto de fusão (“low melting point” – LMP), previamente preparada e

levemente aquecida (37ºC). As lâminas foram então incubadas em tampão de lise

(2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 10% DMSO, 1% TRITON X-100), pH 10,

por 1 hora, na ausência de luz, para remoção das proteínas celulares.

Posteriormente, as lâminas passaram pelo processo em tampão de

desnaturação (NaOH 30 mM, 1 mM EDTA) pH > 13, pré-resfriado entre 4-8 ºC e

incubadas de maneira a cobrir as lâminas, por 10 minutos. A eletroforese foi feita em

uma cuba horizontal e transcorreu a 25 V e 300 mA, por um período de 20 minutos.

Todas as etapas anteriores foram realizadas sob luz amarela ou no escuro para

prevenir danos adicionais ao DNA. Após a eletroforese, as lâminas foram removidas,

neutralizadas (Tris 0,4 M, por 10 minutos), fixadas em etanol absoluto e coradas

com 20 µL de 20 µL/mL de brometo de etídio.

Figura 9 – Resumo das sucessivas etapas que integram o Ensaio cometa. Elaboração: O autor (2009).

Para a visualização dos danos do DNA, as lâminas foram observadas em

aumento 400X, usando-se microscópio de epifluorescência equipado com filtro de

excitação de 515–560 nm e um filtro de barreira de 590 nm. Foram analisadas 100

células (nucleóides) por lâmina, estipulando-se previamente, de acordo com Collins

et al. (2001), cinco Classes de Danos. A avaliação foi visual, segundo o

comprimento da cauda nas classes e para a análise estatística foram atribuídos

valores numéricos (Ranques) de 0 a 4 para cada uma das classes, respectivamente.

As células foram ranqueadas visualmente, de acordo com a intensidade relativa de

fluorescência do DNA na cauda (de 0 = incólumes, sem DNA na cauda; a 4 =

maximamente danificadas, mais de 80% de DNA na cauda). O escore total para 100

células (entre 0 e 400) foi obtido multiplicando o número de nucleóides de cada

classe pelo ranque da classe de dano. Assim, o índice de dano (ID) foi indicado

usando a seguinte fórmula:

ID = (0 x n0) + (1 x n1) + (2 x n2) + (3 x n3) + (4 x n4),

onde n = número de células em cada classe analisada. (Collins et al., 1995; Silva et

al., 2000; Collins et al., 2001). Finalmente, o escore total por espécime corresponde

à média dos escores de suas duas lâminas e representa, então, a freqüência de

quebras no seu DNA.

Em nosso estudo, o Ensaio cometa foi realizado no ano de 2008, no

Laboratório de Oncologia Experimental, do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia da Universidade Federal do Ceará.

[

3.2.3. Teste do Micronúcleo

Para a análise dos Micronúcleos (MN) foi empregada a técnica descrita por

Heddle (1973), com algumas modificações. Assim, uma vez coletado o sangue do

peixe, imediatamente foi pingada uma gota em lâmina bem limpa; com o auxílio de

uma lamínula, foi feito o esfregaço, que secou ao ar, em temperatura ambiente.

Após a secagem, fez-se a fixação em etanol absoluto por 10 minutos e a

lâmina foi corada com solução de Giemsa 10%, diluída em tampão fosfato a pH 6,8,

por 10 minutos e lavada em água corrente. Somente foram consideradas as células

com a membrana citoplasmática intacta. As laminas para o escore de MN foram

observadas ao microscópio sob ampliação de 1000X, no Laboratório de Citogenética

Humana e Genética Toxicológica da Universidade Federal do Pará. Foram

analisados, em teste cego, 2.000 eritrócitos por lâmina e, assim, 4.000 por animal.

Em nosso estudo os MN foram definidos como corpos citoplasmáticos

esféricos ou ovais, não conectados ao núcleo principal, com diâmetro de 1/30 – 1/10

do núcleo maior e no mesmo plano óptico deste (Al-Sabti & Metcalfe, 1995; Ayllon e

Garcia-Vazquez, 2000). Três outras anormalidades nucleares foram também

consideradas: brotos, lobos e invaginações (Ayllon & Garcia-Vazquez, 2000;

Bolognesi et al., 2006).

]

3.2.4 Biensaios com Colossoma macropomum

Os espécimes de C. macropomum foram mantidos sob densidade de três

indivíduos por aquário de 30 L (Figura 10). Para esses bioensaios foram utilizados

18 indivíduos, os quais constituíram dois grupos de nove, sendo um grupo exposto

ao metilmercúrio 2 mg.L-1 e o outro, não exposto, utilizado como controle. Após 120

horas (cinco dias) de exposição, os tambaquis de ambos os grupos foram

anestesiados e sacrificados e o sangue coletado para os bioensaios.

Figura 10 – Visão de aquários no Laboratório de Biologia Aquática do IFPA, por ocasião da exposição de C. macropomum ao metilmercúrio. Foto: O autor (2008).

No Ensaio cometa, as lâminas foram observadas em microscópio de

epifluorescência usando-se aumento de 400X. Foram analisados 100 nucleóides por

lâmina e, assim, 200 por indivíduo. No total, foram averiguados 3.600 nucleóides

neste bioensaio.

O Teste de micronúcleos foi realizado pela análise de 4.000 eritrócitos por

animal, incluindo aquelas com micronúcleos típicos e alterações na forma do núcleo.

No total, foram averiguados 72.000 eritrócitos neste bioensaio.

3.2.5 Bioensaios com Aequidens tetramerus

Nos bioensaios com A. tetramerus um protocolo diferente foi adotado. Devido

à sua agressividade, a manutenção foi feita em aquários individuais de 15 L até

coleta do sangue.

Foram utilizados 33 espécimes, divididos em três grupos de 11: um grupo

controle (C) e dois grupos expostos (A) e (B). O metilmercúrio foi adicionado à água

até a concentração planejada (2 mg.L-1) e a obtenção do sangue para as análises

feita após 24 h e 120 h, respectivamente.

No Ensaio cometa, as lâminas foram observadas em microscópio de

epifluorescência usando-se aumento de 400X. Foram analisados 100 nucleóides por

lâmina e, assim, 200 por indivíduo. No total, foram averiguados 6.600 nucleóides

neste bioensaio.

As laminas para o escore de MN foram observadas ao microscópio usando

ampliação de 1000X. Foram analisados 2.000 eritrócitos por lâmina e, assim, 4.000

por animal. No total, foram averiguados 132.000 eritrócitos neste bioensaio.

[

3.2.6 Análises estatísticas

Para comparar diferenças entre grupos controle e tratados, os resultados

foram avaliados por meio de três testes não paramétricos: teste de Mann-Whitney,

teste de Kuskal-Wallis e teste do Qui-quadrado (χ2). Para isso, usamos o programa

BioEstat 5.0 (Ayres et al., 2007) e o nível mínimo de significância considerado nas

análises foi de 0,05.

As análises estatísticas dos resultados obtidos no Ensaio Cometa foram

efetuadas com os testes de Mann-Whitney (teste U) e de Kuskal-Wallis, de acordo

com Ferraro (2003), Ferraro et al. (2004), Rigonato et al. (2005), Benincá (2006),

Bücker et al. (2006) e Vanzella (2006), por se tratar de dados não paramétricos e

independentes.

O teste U baseia-se no seguinte raciocínio: se na amostra A os valores são,

em geral, menores do que na amostra B, quando se ordenam do menor ao maior os

valores das duas amostras juntas, os postos ocupados pelos indivíduos da amostra

A serão, em geral, menores do que os ocupados pelos da amostra B.

conseqüentemente, o posto médio em A será também menor do que o posto médio

em B. Uma diferença estatisticamente significativa entre os dois postos médios

estará indicando que a população A tem valor de tendência central menor do que a

população B. O teste de Kuskal-Wallis é uma generalização do teste de Mann-

Whitney e serve, portanto, para se compararem duas ou mais populações (Cellegari-

Jacques, 2003).

Este tipo de teste estatístico nos permitiu comparar os grupos

simultaneamente. Os escores utilizados nos testes foram estimados por 100 células.

Assim, o escore máximo possível nos experimentos foi de 400 (dano máximo) e o

escore mínimo de zero (nenhum dano).

Aos resultados do Teste do Micronúcleo foi aplicado o teste do Qui-quadrado,

de acordo com Ferraro (2003), Ferraro et al. (2004), Lopes-Poleza (2004), Banasik

et al. (2005) e Cavas et al. (2005). Como não existe hipótese para o esperado, o qui-

quadrado foi obtido através de tabelas de contingência.

4. RESULTADOS

4.1 RESULTADOS DOS EXPERIMENTOS COM C. MACROPOMUM

No Ensaio cometa, a avaliação foi feita analisando-se visualmente 100

nucleóides por lâmina, 200 por espécime, os quais foram distribuídos em cinco

classes, de acordo com a intensidade da cauda. Procedeu-se o somatório do

número de células identificadas em cada classe e a multiplicação pelo valor da

classe. Em seguida, o escore total por indivíduo foi obtido pela média dos escores

de suas duas lâminas, representando, portanto, o nível de danos no seu DNA.

No gráfico da Figura 11 estão representados os resultados encontrados na

análise do Ensaio Cometa, com as informações sobre as classes de danos. Foram

analisados 3.600 nucleóides, 1.800 de cada grupo. Do total, 1.380 nucleóides do

grupo controle e 112 do grupo contaminado não apresentaram danos (classe 0). No

caso dos nucleóides com cauda (células com danos), verificou-se maior freqüência

da classe 1 tanto no grupo controle quanto no tratado.

Ensaio cometa em C. macropomum

0

100

200

300

400

500

600

700

800

classes de danos

frequ

ênci

a/90

0 cé

lula

s

Série1 Série2

Figura 11 – Freqüência de nucleóides por classe de dano.

Os resultados observados foram tratados estatisticamente com o teste de

Mann-Whitney e a diferença mostrou-se significativa entre os grupos controle e

contaminado (Figuras 12 e 13).

Controle Tratado

0 1 2 3 4

Figura 12 – Resultados do teste de Mann-Whitney obtidos no BioEstat 5.0 (Ayres et al., 2007) mostrando diferença significativa entre os grupos controle e tratado no Ensaio cometa em C. macropomum (p < 0,0005).

Ensaio Cometa: Controle x Exposição ao MeHg

Figura 13 – Gráfico representativo dos escores obtidos (por 100 células) em C. macropomum. Ensaio cometa para os animais tratados e os do grupo controle.

Esc

ores

das

cla

sses

de

nucl

eóid

es /

100

célu

las

No Teste do Micronúcleo, foram analisadas 4.000 células por espécime. Do

total de 72.000 células, o número de micronúcleos típicos (Figura 14) foi bastante

reduzido, o que dificultaria bastante a análise estatística. Entretanto, de acordo com

nossa proposta, os micronúcleos foram incluídos com as alterações morfológicas

nucleares, que apareceram com maior freqüência.

Figura 14 - Eritrócitos de C. macropomum corados com Giemsa, em ampliação de 1.000X. A seta indica um micronúcleo.

Das 72.000 células analisadas, uma metade foi do grupo controle e a outra do

grupo exposto ao xenobiótico. No primeiro grupo, 307 células se apresentaram

alteradas (micronúcleos típicos + alterações morfológicas nucleares); no grupo

exposto foram 367 células alteradas. Esses resultados foram tratados

estatisticamente com o teste do qui-quadrado através da montagem de uma tabela

de contingência (2 x 2). A hipótese H0 (a proporção de células alteradas é

independente da exposição ao metilmercúrio) foi testada e rejeitada, devido à

significativa diferença entre os grupos controle e tratado (Figura 15), onde p < 0,05.

Figura 15 – Resultado do teste do qui-quadrado obtido no BioEstat 5.0 (Ayres et al., 2007), demonstrando que houve diferença significativa entre a ocorrência de células alteradas nos grupos controle e exposto ao metilmercúrio (p < 0,05).

Os dados são também apresentados na Tabela 2 e no gráfico da Figura 16,

onde estão disponibilizadas as médias e os desvios padrões de micronúcleos e

alterações morfológicas nucleares.

Tabela 2 – Médias e desvios de micronúcleos (MN) e alterações morfológicas nucleares (AMN) de C. macropomum expostos ao metilmercúrio 2 mg.L-1.

MÉDIA E DESVIO PADRÃO DE MN E AMN / 4000 CÉLULAS

MN AMN MN + AMN

Controle 9,66 ± 5,02 24,44 ± 9,48 34,11 ± 13,84

MeHg /120 h 8,44 ± 7,42 32,33 ± 6,61 40,77 ± 12,19

Figura 16 – Representação das freqüências de micronúcleos + alterações morfológicas nucleares (por 4.000 eritrócitos) em C. macropomum.

Ainda durante o curso de doutoramento reunimos numerosas publicações

abordando o uso do Teste do micronúcleo em peixes, na avaliação de riscos da

exposição a xenobióticos. A esta breve revisão, acrescentamos nossos resultados

com espécimes de C. macropomum expostos ao metilmercúrio e produzimos o

artigo “The Micronucleus Assay in Fish Species as an Important Tool for Xenobiotic

Exposure Risk Assessment – A Brief Review and an Example Using Neotropical Fish

Exposed To Methylmercury”, que foi publicado no periódico Reviews in Fisheries

Science 17(4):478–484, 2009. O referido artigo encontra-se em um apêndice ao final

deste trabalho.

Núm

ero

de c

élul

as a

ltera

das

/ 4.0

00 c

élul

as

Teste do Micronúcleo: Controle x Exposição ao MeHg

4.2 RESULTADOS DOS EXPERIMENTOS COM A. TETRAMERUS

No Ensaio cometa, a avaliação foi feita analisando-se visualmente 100

nucleóides por lâmina, 200 por espécime. Após sua distribuição em classes, de

acordo com a intensidade da cauda, procedeu-se o somatório do número de células

identificadas em cada classe e a multiplicação pelo valor da classe. O escore total

por indivíduo foi então obtido pela média dos escores de suas duas lâminas,

representando o nível de danos no seu DNA.

Verificou-se um aumento muito significativo de nucleóides com cauda nos

eritrócitos de peixes tratados com MeHg em relação aos do grupo controle não

tratado (Figura 17).

Comparativo

C 24h 120h0

50

100

150

200

250

300

350

Exposição

Índi

ce d

e da

no

Figura 17 – Ensaio cometa em A. tetramerus. Comparação do índice de danos nos grupos controle (C) e tratados com MeHg 2mg.L-1 nos dois tempos de exposição. Gráfico obtido no programa GraphPad.Prism.5.

No gráfico da Figura 18 estão representados os resultados encontrados na

análise do Ensaio Cometa, com as informações sobre as classes de danos. Foram

analisados 6.600 nucleóides, 2.200 de cada grupo. Do total, 1.976 nucleóides do

grupo controle e 58 do grupo exposto por 24h não apresentaram danos, porém

todos os nucleóides do grupo exposto por 120h apresentaram algum nível de dano.

No caso dos nucleóides com cauda (células com danos), verificou-se maior

freqüência da classe 1 no grupo C (controle), da classe 2 no grupo A (exposto por

24h) e da classe 3 no grupo B (exposto por 120h).

Ensaio cometa em A. tetramerus

0

200

400

600

800

1000

1200

classes de danos

frequ

ênci

a/11

00 c

élul

as

Série1 Série2 Série3

Figura 18 – Freqüência de nucleóides por classe de dano.

Os resultados observados foram tratados estatisticamente com o teste de

Kruskal-Wallis (Figuras 19 e 20) e a diferença mostrou-se altamente significativa

entre os grupos controle e tratados (p < 0,0001). A opção por esse teste estatístico

decorreu principalmente de sua semelhança operacional com o teste de Mann-

Whitney e da sua capacidade de comparar os três grupos simultaneamente.

Figura 19 – Resultados do teste de Kruskal-Wallis obtidos no BioEstat 5.0 (Ayres et al., 2007) para os escores do Ensaio cometa em A. tetramerus. Na tabela, temos: 1 = grupo C, 2 = grupo A e 3 = grupo B.

Controle

0 1 2 3 4

MeHg 24 h MeHg 120 h

Como se pode notar, houve diferença altamente significativa entre o grupo

controle (C) e cada um dos grupos tratados, porém entre estes (A e B) a diferença

no índice de danos não chegou a ser significativa. Os escores médios e desvios em

cada grupo podem ser observados no gráfico da Figura 20.

Ensaio Cometa: Controle x Exposição ao MeHg

Figura 20 – Ensaio cometa em A. tetramerus. Comparação do índice de danos ao DNA nos grupos controle (C) e tratados com MeHg 2mg.L-1 nos dois tempos de exposição.

Foram analisadas 132.000 células de Aequidens tetramerus no Teste do

micronúcleo, 44.000 em cada grupo. No grupo controle, 314 células se

apresentaram alteradas; no grupo exposto ao MeHg por 24h foram 553 células

alteradas e no grupo exposto por 120h foram 824 células alteradas. Os resultados

foram tratados estatisticamente com o teste do qui-quadrado através da montagem

de uma tabela de contingência (3 x 2). A hipótese H0 (a proporção de células

alteradas é independente das exposições ao metilmercúrio) foi testada e rejeitada,

devido à diferença altamente significativa entre os grupos controle e tratado, onde p

< 0,0001 (Figura 21).

Esc

ores

das

cla

sses

de

nucl

eóid

es /

100

célu

las

Figura 21 – Resultado do teste do qui-quadrado, demonstrando que houve diferença significativa entre a ocorrência de células alteradas nos grupos controle e exposto ao metilmercúrio (p < 0,0001).

Os dados são também apresentados na Tabela 3 e no gráfico da Figura 22,

onde estão disponibilizadas as médias e os desvios padrões de micronúcleos e

alterações morfológicas nucleares.

Tabela 3 – Médias e desvios de micronúcleos (MN) e alterações morfológicas nucleares (AMN) de A. tetramerus expostos ao metilmercúrio 2 mg.L-1.

MÉDIA E DESVIO PADRÃO DE MN E AMN / 4000 CÉLULAS

MN AMN MN + AMN

Controle 2,27 ± 4,45 26,27 ± 20,74 28,54 ± 24,65

MeHg /24 h 2,27 ± 2,14 48,00 ± 29,59 50,27 ± 30,98

MeHg /120 h 7,45 ± 6,15 67,45 ± 16,07 74,90 ± 15,43

Figura 22 – Representação das freqüências de micronúcleos + alterações morfológicas nucleares (por 4.000 eritrócitos) em A. tetramerus.

Núm

ero

de c

élul

as a

ltera

das

/ 4.0

00 c

élul

as

5. DISCUSSÃO

O uso de diferentes ensaios e sistemas biológicos garante uma triagem mais

acurada dos efeitos causados por contaminantes no ambiente aquático. Nesse

sentido, vários biomarcadores estão sendo desenvolvidos e dentre eles, os

biomarcadores genéticos vêm alcançando grande aceitação (Ramsdorf, 2007).

O desenvolvimento de novas metodologias e aplicação de técnicas mais

refinadas para a avaliação da genotoxicidade em ambientes aquáticos são objeto de

muitos estudos científicos (Van der Oost et al., 2003). Em nosso estudo, o Ensaio

cometa e o Teste do micronúcleo foram utilizados para avaliar os efeitos do

metilmercúrio em Colossoma macropomum e Aequidens tetramerus, espécies de

distribuição relativamente ampla na região neotropical.

Os resultados obtidos no presente trabalho mostraram, primeiramente, que os

peixes, neste caso C. macropomum e A. tetramerus, podem representar um bom

modelo experimental, sendo considerados ótimos indicadores de efeitos genotóxicos

de xenobiontes, pelo menos se o poluente for mercurial. Por outro lado, a

bioacumulação de compostos organometálicos pode ser comparada à do homem,

pois tanto em um quanto no outro, tais compostos têm capacidade de reagir com

ligantes intracelulares.

Em nosso estudo, C. macropomum e A. tetramerus foram expostos ao

metilmercúrio na concentração de 2 mg.L-1, o maior valor encontrado na literatura

(Magalhães, 1995) para algumas áreas da baía de Minamata (Japão) nas décadas

de 50 e 60. Neste sentido, as chances de observação de efeitos genotóxicos eram

praticamente totais. Assim, nosso principal foco de análise direcionava-se às

diferenças de resultados entre os testes de genotoxicidade empregados e entre as

espécies usadas nos bioensaios.

5.1 USO DE ERITRÓCITOS PERIFÉRICOS

Testes de genotoxicidade em peixes são habitualmente realizados com

eritrócitos, pois estes são nucleados (Hayashi et al., 1998), facilmente obtidos por

métodos não destrutivos e não necessitam do passo adicional de isolamento, porém

outros tecidos também têm sido testados, pois os efeitos de genotoxicidade de

contaminantes podem ser muitas vezes tecido-específicos. Os tecidos mais

pesquisados, além do sanguíneo, são do fígado, do rim (Belpaeme et al., 1998),

além das brânquias (Cavas et al., 2005; Cavas, 2008).

Apesar de alguns estudos com MN demonstrarem maior sensibilidade das

células epiteliais de brânquias em relação aos eritrócitos, como Hayashi et al. (1998)

e Cavas (2008), o uso de células do sangue periférico tem predominado pela sua

facilidade técnica, possível obtenção sem necessariamente sacrificar os animais da

amostra e, principalmente, pela possibilidade de comparações reais dos resultados

com um maior número de publicações na área (Cestari et al., 2004; Ferraro et al.,

2004; Lopes-Poleza, 2004; Barillet et al., 2005; Porto et al., 2005; Ramos et al.,

2005; Bagdonas & Vosyliené, 2006; Matsumoto et al., 2006; Ergene et al., 2007;

Andreikënaitë et al., 2007; Koca et al., 2008; Ferraro, 2009).

5.2 MAIOR SENSIBILIDADE DO ENSAIO COMETA

As diferenças de respostas nos grupos controle e contaminados, para ambas

as espécies, foram significativas tanto no Ensaio cometa quanto no Teste do

micronúcleo, porém com maiores índices de danos no primeiro. Provavelmente esta

diferença relaciona-se aos eficientes mecanismos de reparo do DNA e à seleção

que elimina grande número de células danificadas. Muitos outros estudos de

genotoxicidade têm obtido resultados semelhantes, ou seja, com dados mais

significativos no Ensaio cometa (Benincá, 2006; Bücker et al., 2006; Vanzella, 2006).

A alta porcentagem de células apoptóticas foi descrita em peixes marinhos

expostos a efluente de refinaria de petróleo (Frenzilli et al. 2004,). Este fenômeno

ocorre quando os danos celulares são intensos e os mecanismos de defesa não

conseguem repará-los. Em conseqüência, o número de células micronucleadas

disponíveis para a análise, também decresceria.

Embora nos Ensaios Cometa e dos Micronúcleos Písceos sejam analisados

eritrócitos circulantes, a natureza do dano detectado é diferente. No Ensaio cometa,

analisam-se danos que envolvem segmentos muito curtos na molécula de DNA,

enquanto que no Teste do micronúcleo os danos detectáveis são, em termos de

escala, de natureza muito maior (Ferraro, 2003).

5.3 TESTE DO MICRONÚCLEO

Em nossa pesquisa de micronúcleos e outras anormalidades nucleares,

analisamos 4.000 eritrócitos por espécime, porém há na literatura uma grande

divergência quanto ao número de células que devem ser utilizadas: 1.000 (Ayllon

and Garcia-Vazquez, 2000; Gravato and Santos, 2002; Russo et al., 2004); 1.500

(Cavas, 2008); 2.000 (Palhares and Grisolia, 2002; Ramsdorf, 2007; Normann et al.,

2008, Ferraro, 2009; Kirschbaum et al., 2009); 3.000 (Galindo and Moreira, 2009;

Grisolia et al., 2005; Grisolia et al., 2009); 4.000 (Metcalfe, 1988; Ferraro et al., 2004;

Bolognesi et al., 2006); 5.000 (Porto et al, 2005; Andreikënaitë et al., 2007). De

acordo com Bolognesi et al. (2006), a grande variabilidade interindividual associada

à baixa freqüência basal deste biomarcador confirma a necessidade de avaliação de

um número consistente de células (em torno de 4000) em um adequado número de

animais.

Tal como em alguns estudos anteriores (Ferraro, 2003; Ferraro et al., 2004;

Bolognesi et al., 2006; Andreikënaitë et al., 2007; Grisolia et al., 2009), no presente

trabalho também houve dificuldades em observar a presença de micronúcleos mas

nem tanto de alterações morfonucleares. A freqüência espontânea de micronúcleos

típicos é geralmente muito baixa (Ferraro et al., 2004). No nosso caso, MN foram

pouco freqüentes em todos os grupos. Quando as amostras foram consideradas

como um todo, reunindo MN típicos e outras alterações nucleares, o teste do qui-

quadrado apresentou diferença significativa entre os grupos controle e contaminado.

Do mesmo modo que em Ferraro (2003), algumas das alterações

morfológicas nucleares descritas em trabalhos anteriores foram encontradas e

fotografadas no presente estudo. Embora, muitas destas pudessem ser facilmente

identificadas dentro de um determinado tipo, outras mostraram-se dúbias quanto à

sua caracterização e, por este motivo, todas as alterações morfológicas nucleares

foram computadas em conjunto.

Vanzella (2006), trabalhando com Prochilodus lineatus, concluiu que em

testes de micronúcleos a exposição de 24h é o melhor tempo experimental para

detectar alterações, pois neste intervalo de tempo as lesões celulares ocorridas não

foram reparadas. Nossos resultados com A. tetramerus expostos ao MeHg por 24h e

120h, entretanto, não corroboram tal conclusão, pois verificamos aumento no índice

de danos em função do tempo de exposição.

Ayllon & Garcia-Vazquez (2000), trabalhando com as espécies Phoxinus

phoxinus e Poecilia latipinna, verificaram que agentes reconhecidamente

genotóxicos, com forte ação clastogênica tanto in vivo como in vitro, podem agir de

maneiras diferentes. Enquanto a colchicina e a mitomicina C induziram aumento na

freqüência de micronúcleos e de anormalidades nucleares, a ciclofosfamida induziu

apenas aumento de anormalidades, não levando à formação de micronúcleos.

Esses resultados indicam que alguns compostos podem agir formando

anormalidades nucleares, porém sem a formação de micronúcleos. Dessa forma,

mais estudos são necessários para se conhecer melhor o mecanismo de formação

das anormalidades nucleares, para que possa ser determinada mais precisamente a

ação genotóxica dos contaminantes.

Por outro lado, se considerarmos que alterações morfológicas nucleares são

indicadores de citotoxicidade e micronúcleos típicos são indicadores de

genotoxicidade, como proposto por Cavas et al. (2005), nossos resultados indicam

que os danos promovidos pelo metilmercúrio nos eritrócitos de peixes são tão

citotóxicos quanto genotóxicos.

5.4 MAIOR ÍNDICE DE DANOS NO ACARÁ

Por fim, como pode ser visto na Tabela 4, os resultados encontrados indicam

que nas condições empregadas em nosso estudo, o metilmercúrio mostrou-se

altamente genotóxico nas espécies estudadas, o que foi demonstrado pelos

elevados escores obtidos no Ensaio cometa, com A. tetramerus (acará)

apresentando níveis mais acentuados de danos em comparação com C.

macropomum (tambaqui). Neste caso tal diferença não pode ser atribuída ao

fenômeno de biomagnificação, uma vez que ambos apresentaram baixo nível de

danos no grupo controle e foram expostos ao xenobionte por via hídrica. Os efeitos

clastogênicos e aneugênicos avaliados no Teste do micronúcleo não foram tão

marcantes quanto as lesões do DNA detectadas no Ensaio cometa, mas foram

significativas nas duas espécies e novamente mais acentuadas em A. tetramerus.

Tabela 4 – Efeitos genotóxicos e mutagênicos do MeHg 2mg.L-1. Comparação entre os resultados nas duas espécies usadas nos bioensaios.

Colossoma macropomum Aequidens tetramerus

MÉDIAS DOS ESCORES NO ENSAIO COMETA

Controle 27,28 10,18

MeHg 24 h – 243,00

MeHg 120 h 140,83 303,13

MÉDIAS DE FREQUÊNCIAS DE MN + AMN

Controle 0,85% 0,71%

MeHg 24 h – 1,25%

MeHg 120 h 1,02% 1,87%

Percebe-se, portanto, que além da influência do nível trófico e

conseqüentemente do fenômeno de biomagnificação nas possíveis agressões de

contaminantes no ambiente aquático, existem variações interespecíficas que podem

resultar de diferenças na sensibilidade entre as espécies ou na susceptibilidade à

bioacumulação, ou ambas.

6. CONCLUSÕES

a) O metilmercúrio apresenta acentuados efeitos genotóxicos em peixes na

concentração de 2mg.L-1, o que foi demonstrado pelas diferenças significativas entre

grupos controles e tratados;

b) As espécies neotropicais Colossoma macropomum e Aequidens tetramerus

funcionam como bons modelos para a análise de exposições a produtos à base de

mercúrio;

c) Os dois testes de genotoxicidade, Ensaio cometa e Teste do micronúcleo,

tiveram sua eficiência confirmada na avaliação de danos ao material genético de

peixes por contaminantes ambientais;

d) O nível de danos detectados pelo Ensaio cometa foi maior que pelo Teste

do micronúcleo, o que pode ser considerado normal, haja vista que o primeiro teste

avalia danos primários ao DNA, muitos dos quais não são passados às futuras

gerações de células e, então, não podem ser detectados pelo segundo teste;

e) A espécie carnívora Aequidens tetramerus apresentou maior índice de

danos em ambos os testes, quando comparada à espécie onívora Colossoma

macropomum. Entretanto, neste caso, a diferença não deve ser atribuída ao seu

comportamento trófico no ambiente natural, uma vez que suas condições de manejo

foram as mesmas e a contaminação exclusivamente por via hídrica.

f) O nível de danos genotóxicos provocados por metais pesados, como o

mercúrio, depende da associação de diferentes fatores. Além da já bem

documentada magnificação trófica, devem também ser consideradas, para cada

espécie, sua sensibilidade ao contaminante e sua susceptibilidade à bioacumulação

do mesmo.

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ANEXOS

TABELAS DE RESULTADOS

Número de nucleóides de eritrócitos analisados, normais e alterados, com os respectivos danos, em C. macropomum não contaminados (controle) e

contaminados com metilmercúrio 2 mg.L-1.

Número de células Classes/100 células Escores

Analisadas Alteradas 0 1 2 3 4 Controle

C1 200 56 72 22.5 5 0.5 0 34

C2 200 52 74 22 2.5 1.5 0 31.5

C3 200 70 65 27 8 0 0 43

C4 200 39 80.5 16 3 0.5 0 23.5

C5 200 60 70 24.5 5.5 0 0 35.5

C6 200 46 77 18 4 0.5 0.5 29.5

C7 200 28 86 14 0 0 0 14

C8 200 16 92 8 0 0 0 8

C9 200 53 73.5 26.5 0 0 0 26.5

Total 1800 420 690 178.5 28 3 0.5 X= 27.28

Tratado

Hg1 200 200 0 24 22.5 38 15.5 245

Hg2 200 181 9.5 53 30.5 7 0 135

Hg3 200 169 15.5 60.5 20 3.5 0.5 113

Hg4 200 195 2.5 70 20 5.5 2 134.5

Hg5 200 198 1 60.5 31 5 2.5 147.5

Hg6 200 189 5.5 73 18 3.5 0 119.5

Hg7 200 183 8.5 70.5 17 3.5 0.5 117

Hg8 200 183 8.5 77 13 1.5 0 107.5

Hg9 200 190 5 55 31 4.5 4.5 148.5

Total 1800 1688 56 543.5 203 72 25.5 X= 140.83

C= controle; X= média; Hg= tratado.

Número de células com núcleos normais e alterados em Colossoma macropomum (tambaqui) nos grupos controle e exposto.

Células Normais

Células

Alteradas TOTAL Alt Morf MN

Controle C1 3972 23 5 4000 C2 3975 20 5 4000 C3 3954 32 14 4000 C4 3965 23 12 4000 C5 3960 30 10 4000 C6 3947 39 14 4000 C7 3969 21 10 4000 C8 3957 27 16 4000 C9 3994 5 1 4000

Total 35693 220 87 36000

MeHg 2mg/L 120h Hg20 3965 30 5 4000 Hg21 3955 35 10 4000 Hg22 3957 36 7 4000 Hg23 3971 26 3 4000 Hg24 3937 45 18 4000 Hg25 3944 33 23 4000 Hg26 3963 36 1 4000 Hg27 3970 24 6 4000 Hg28 3971 26 3 4000 Total 35633 291 76 36000

Número de nucleóides de eritrócitos analisados, normais e alterados, com os respectivos danos, em A. tetramerus não contaminados (controle) e contaminados

com metilmercúrio 2 mg.L-1. Número de células Classes/100 células

Escores Analisadas Alteradas 0 1 2 3 4

Controle

C1 200 22 89 11 0 0 0 11

C2 200 15 92.5 7.5 0 0 0 7.5

C3 200 20 90 10 0 0 0 10

C4 200 18 91 9 0 0 0 9

C5 200 18 91 9 0 0 0 9

C6 200 14 93 7 0 0 0 7

C7 200 32 84 16 0 0 0 16

C8 200 28 86 14 0 0 0 14

C9 200 18 91 9 0 0 0 9

C10 200 19 90.5 9.5 0 0 0 9.5

C11 200 20 90 10 0 0 0 10

Total 2200 224 988 112 0 0 0 X = 10.18

MeHg 2mg/L 24h

Hg14 200 190 5 14 31.5 35 14.5 240

Hg15 200 200 0 8.5 34 40 17.5 266.5

Hg18 200 200 0 9.5 29.5 50 11 262.5

Hg19 200 200 0 15.5 39.5 39.5 5.5 235

Hg20 200 200 0 5 46.5 46.5 13.5 268.5

Hg21 200 183 8.5 15.5 31.5 25.5 19 231

Hg22 200 200 0 18 38.5 34.5 9 234.5

Hg23 200 177 11.5 17 35.5 24 12 208

Hg24 200 200 0 20 39.5 30 10.5 231

Hg38 200 197 1.5 9.5 33.5 33.5 22 265

Hg39 200 195 2.5 15.5 40 32.5 9.5 231

Total 2200 2142 29 148 399.5 391 144 X = 243

MeHg 2mg/L 120h

Hg25 200 200 0 0 23.5 51 25.5 302

Hg26 200 200 0 0 21.5 48.5 30 308.5

Hg27 200 200 0 0 29 46 25 296

Hg28 200 200 0 0 27 45.5 27.5 300.5

Hg29 200 200 0 0 22.5 51 26.5 304

Hg30 200 200 0 0 21 53 26 305

Hg31 200 200 0 0 23 50 27 304

Hg32 200 200 0 0 23 48.5 28.5 305.5

Hg33 200 200 0 0 26.5 47 26.5 300

Hg34 200 200 0 0 19 56 25 306

Hg35 200 200 0 0 21.5 54 24.5 303

Total 2200 2200 0 0 257.5 550.5 292 X = 303.13

C= controle; X= média; Hg= tratado

Número de células com núcleos normais e alterados em Aequidens tetramerus (acará) nos grupos controle e exposto.

Células Normais

Células

Alteradas TOTAL Alt Morf MN

Controle 1 3990 10 0 4000 2 3991 9 0 4000 3 3982 18 0 4000 4 3950 43 7 4000 5 3986 14 0 4000 6 3977 20 3 4000 7 3977 22 1 4000 8 3910 76 14 4000 9 3962 38 0 4000

10 3965 35 0 4000 11 3996 04 0 4000

Total 43686 289 25 44000

MeHg 2mg/L 24h 14 3975 21 4 4000 15 3980 18 2 4000 18 3976 24 0 4000 19 3960 40 0 4000 20 3986 13 1 4000 21 3965 35 0 4000 22 3915 83 2 4000 23 3937 61 2 4000 24 3917 79 4 4000 38 3943 54 3 4000 39 3893 100 7 4000

Total 43540 528 25 44000

MeHg 2mg/L 120h 25 3926 60 14 4000 26 3928 56 16 4000 27 3903 91 6 4000 28 3917 71 12 4000 29 3942 50 8 4000 30 3918 66 16 4000 31 3936 59 5 4000 32 3953 47 0 4000 33 3927 70 3 4000 34 3925 73 2 4000 35 3901 99 0 4000

Total 43176 742 82 44000

APÊNDICES

APÊNDICE 1:

Artigo* “Evaluation of Genotoxic Effects of Xenobio tics in Fishes Using Comet Assay – A Review”

*Publicado em Reviews in Fisheries Science 17(2):170–173, 2009.

APÊNDICE 2:

Artigo* “The Micronucleus Assay in Fish Species as an Important Tool for Xenobiotic Exposure Risk Assessment—A Brief Review and an Example Using

Neotropical Fish Exposed To Methylmercury”

*Publicado em Reviews in Fisheries Science 17(4):478–484, 2009.

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