1. By W. S. 111Coordenadores:WILLIBALDO SCHMIDELL URGEL DE ALMEIDA LIMA EUGNIO AQUARONE WALTER BORZANIBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL. VOLUME 11ENGENHARIA BIOQUMICA~EDITORA EDGARD BLCHER LTDA.' /

2. v ,W-1-1-I-1_11L_. ... _. ... _a 11- .J - .. __t.__-, _1,' - 1 - l 1 ----r-.J ----.l a 1 - a 11 ar-"" 1 r-""-Este conjunto de quatro volumes, reunidos sob o ttulo amplo de BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL, o resultado do trabalho de um grupo de profissionais com vistas atualizao da coleo BIOTECNOLOGIA, cuja publicao foi iniciada em 1975 e terminada em 1983. A experincia acumulada e as muitas mudanas ocorridas nestes ltimos vinte anos, ao lado da indiscutvel e crescente importncia das aplicaes da BIOTECNOLOGIA em diversos setores de produo de bens e servios, justificam plenamente - assim pensam os Coordenadores e o Editor desta nova Coleo - esta primeira atualizao, principalmente pelo fato de se destinar ao ensino em cursos de graduao. Nosso primeiro objetivo, nesta Apresentao, tomar conhecimento do que, hoje, se entende por BIOTECNOLOGIA, e do que vem a ser BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL. A demarcao ntida do campo de atuao de qualquer ramo do conhecimento sempre tarefa muito difcil, para no dizer impossvel. Tanto isto verdade que, com certa freqncia, tratados relativos a um dado setor do conhecimento atacam diretamente o exame de uma srie de temas sem tentar esboar, preliminarmente, um quadro que, em largos traos, indique os objetivos e as apJjcaes do que vai ser estudado. Tal maneira de agir, principalmente em cursos de graduao, no nos parece aconselhvel. Julgamos importante, no incio dos estudos, a apresentao de um panorama que d, aos alunos, uma idia, ainda que no bem definida, daqueles objetivos e aplicaes. No nos parece que seja imprescindvel transcrever, aqui, todas as propostas de "definio" do que se deva entender por Biotecnologia. Algumas delas sero suficientes para que seja possvel alcanar nosso objetivo. Iniciaremos com a proposta que o Prof. Antonio Paes de Carvalho, em seu trabalho intitulado "Patentes para a Biotecnologia", apresentou, em dezembro de 1993, em reunio realizada na Academia Brasileira de Cincias:"Entende-se por Biotecnologia o conjunto de conhecimentos, tcnicas e mtodos, de base cientfica ou prtica, que permite a utilizao de seres vivos como parte integrante e ativa do processo de produo industrial de bens e servios". 3. VIO Office of Technology Assessment, por sua vez, "definiu" Biotecnologia como sendo: . "O conjunto de processos industriais que englobam processos biolgicos".Por outro lado, a Union Intemationale de Chimie Pure et Applique, conceituou Biotecnologia como:"Aplicao da Bioqumica, da Biologia, da Microbiologia e da Engenharia Qumica aos processos e produtos industriais (incluindo os produtos relativos sade, energia e agricultura) e ao meio ambiente". Finalmente, o Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), em seu Programa Nacional de Biotecnologia, "definiu" Biotecnologia nos seguintes termos:"A utilizao de sistemas celulares para obteno de produtos ou desenvolvimento de processos industriais". . As poucas tentativas de definio aqui transcritas mostram, nitidamente, que a Biotecnologia tem por base vrios ramos do conhecimento que poderiam ser classificados de FUNDAMENTAIS (como, por exemplo, Bioqumica, Fisiologia, Gentica, Microbiologia, Virologia, Botnica, Zoologia, Ecologia) ao lado de outros que poderiam ser agrupados sob a denominao genrica de ENGENHARIAS (principalmente a Engenharia Qumica). Trata-se, portanto, de um campo de trabalho tipicamente multidisciplinar, o que toma absolutamente imprescindvel a efetiva colaborao de profissionais atuantes em diferentes setores do conhecimento. Destaque-se, porm, que essa atividade multidisciplinar no deve ser entendida como resultante de uma simples justaposio de profissionais, cada um deles com sua formao especializada e preocupado apenas com sua rea especfica. Importa que seja, de fato, um trabalho de vrios profissionais efetivamente integrados, de modo que cada um deles tenha conhecimento, obviamente no aprofundado, dos princpios e das tcnicas dos campos de atuao dos demais. Assim, apenas para citar um exemplo, caso um microbiologista participe de um grupo que estuda a otimizao de um dado processo, desejvel que tenha alguns conhecimentos, mesmo que superficiais, a respeito das estratgias empregadas para a modelagem matemtica. Vice-versa, o especialista em modelagem deve efetuar um esforo adicional para compreender as caractersticas do sistema microbiano em estudo, a fim de incorpor-las ao modelo. Somente desta forma a atividade multidisciplinar efetivamente existir e poder ser mais eficiente. 4. VIlSe verdade, por um lado, que a Biotecnologia s passou a ser considerada altamente prioritria h relativamente pouco tempo, tambm verdade, por outro, que processos biotecnolgicos vm sendo utilizados na produo de vrios bens, principalmente alimentos, desde a mais remota antigidade. Basta, neste particular, fazer referncia ao preparo de bebidas fermentadas a partir de cereais na Babilnia e no Egito (8.000 a 6.000 anos a.C.), produo de po, utilizando fermentos, no Egito (4.000 anos a.C.) e produo de vinhos na Grcia (2.000 a.C.). A Biotecnologia encontra muitas aplicaes importantes nas seguintes reas de atividade: Agricultura Pecuria Sade Preservao do meio ambiente Indstria Suas aplicaes na indstria constitutem o objetivo primordial da Biotecnologia Industrial. A Fig. 1, adaptada de um artigo publicado pelo Prof. Rainer Jonas, uma boa representao grfica da "localizao" da Biotecnologia Industrial e de sua interao com outros ramos do conhecimento.Figura I cimento.Re presentao esquemtica da interao da Biotecnologia Industrial com outros ramos do con he- 5. VIIIConvm, finalmente,,ressaltar que, como ocorre em outros campos de trabalho, as reas de aplicao da Biotecnologia, anteriormente apontadas, no so "gavetas" estanques. H entre elas, freqentemente, fortes interaes. Apenas para citar um exemplo, considere-se o caso de uma dada vacina, desenvolvida na rea da Sade. Na etapa final de produo dessa vacina em larga escala surgiro, muito provavelmente, problemas de cunho tecnolgico e de engenharia que podero tomar imprescindvel a efetiva participao da Biotecnologia Industrial na busca das solues mais adequadas. A presente Coleo consta de quatro volumes. No primeiro- FUNDAMENTOS - renem-se, como o prprio nome claramente indica, temas fundamentais indispensveis ao estudo de processos biotecnolgicos. O segundo- ENGENHARIA BIOQUMICA- focaliza os principais problemas de engenharia envolvidos naqueles processos, ao lado de assuntos correlatos de mbito mais geral, mas importantes na produo em larga escala. Os dois ltimos volumes - PROCESSOS FERMENTATIVOS E ENZIMTICOS e BIOTECNOLOGIA NA PRODUO DE ALIMENTOS - foram dedicados descrio e discusso de processos biotecnolgicos de importncia industrial. Todos os temas foram tratados partindo-se do pressuposto de que a obra se destina, primordialmente, a cursos de graduao. A bibliografia indicada no final de cada captulo poder servir como ponto de partida pra os que pretenderem um exame mais aprofundado de um ou outro tpico. Os Coordenadores, o Editor e, seguramente, tambm os Autores, agradecem todas as sugestes relativas estrutura da Coleo ou de qualquer de suas partes, bem como a identificao de falhas ou incorrees, infelizmente sempre possveis, que lhes sejam encaminhadas pelo leitor.Literatura Recomendada 1) Ancies, W. & Cassiolato, J.E. Biotecnologia: seus impactos no setor industrial. CNPq, Braslia, 1985. 2) Haelm, H. Bioqumica de las fermentaciones. Aguilar S.A. de Ediciones, Madri, 1956. 3) Jonas, R. GBF -Scientific Annual Report (pp. 35-46). Alemanha, 1990. 4) Paes de Carvalho, A. Patentes para a Biotecnologia. Apresentad Academia Brasileira de Cincias em 6.12.1993. 6. IXCuando la coleccin "Biotecnologia", editada por los profesores Eugnio Aquarone, Walter Borzani y Urgel de Almeida Lima, apareci en 1975, caus un hondo impacto entre los biotecnlogos latinoamericanos. Se trat de la primera obra sobre el tema escrita y publicada en nuestra regin y represent una contribucin especialmente valiosa al estudio y ensefianza de esa pujante disciplina. "Biotecnologia" const originalmente de tres volmenes: Tecnologia das Fermentaes, Tpicos de Microbiologia Industrial y Engenharia Bioqumica, a los cuales se sum en 1981 Corroso Microbiolgica y luego Alimentos e Bebidas produzidos por Fermentao en 1983. Ahora, pasados ya ms de veinte afios, losmismos editores, com la participacin del profesor Willibaldo Schmidell, nos brindam la oportunidad de apreciar y disfrutar la nueva coleccin "Biotecnologia Industrial" como una sucesora natural de "Biotecnologia". El contenido de la nueva obra h sido totalmente renovado y actualizado en concordancia com los notables avances experimentados por el conocimiento en esta rea en las ltimas dcadas,.incluyendo las modernas tcnicas de la ingeniera gentica y el uso de microorganismos recombinantes en bioprocesos. La nueva coleccin est dividida en cuatro volmenes que abarcan los mas variados tpicos relacionados com la biotecnologa industrial: Fundamentos, Ingeniera Bioqumica, Procesos Fermentativos y Enzimticos y Biotecnologa en la Producccin de Alimentos. En total son 74 captulos escritos por distinguidos especialistas brasileros, conteniendo informacin actualizada acerca tanto de los aspectos bsicos como de los aplicados de la utilizacin de clulas microbianas y no microbianas para finalidades productivas. El Volumen 1, Fundamentos, entrega un completo panorama del estado del conocimiento en microbiologa, gentica, bioqumica y enzimologa, finalizando com un panorama de las aplicaciones industriales de la biotecnologa, abriendo as el camino a los prximos volmenes. En el Volumen 2, Ingeniera Bioqumica, se exponen los principales aspectos relacionados com la cuantificacin de los procesos microbianos y enzimticos y el disefio y operacin de los equipos de proceso requeridos en una instalacin industrial. El Volumen 3~ Procesos Fermentativos y Enzimticos, presenta y discute la aplicacin de los microorganismos a la produccin de una amplia gama de metabolitos y enzimas de inters prctico, el uso de enzimas como biocatalizadores industriales y la aplicacin de los procesos microbianos a diversos sectores industriales y a la descontaminacin de efluentes lquidos y resduos slidos. Finalmente, el Volumen 4, Biotecnologa en la Produccin de Alimentos, 7. Xdetalla la aplicacin de la biotecnologa a una amplia variedad de industrias de ese importante sector. Por su estructura y contenido, y por la indiscutible autoridad de sus editores y autores, estoy cierto que Biotecnologia Industrial est destinada a constituirse en una obra insustituble para la ensefi.anza universitaria de pre y post-grado, as como tambin en una valiosa fuente de consulta para el biotecnlogo en la industria. Fernando Acevedo Profesor Escuela de Ingeniera Bioqumica Universidad Catlica de Valparaso Valparaso, Chile 8. XIa.LJ_,_aU .....Adalberto Pessoa Junior Professor Doutor Universidade de So Paulo Faculdade de Cincias Farmacuticas Departamento de Tecnologia Bioqumica-Farmacutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 05508-900, So Paulo, SP, Brasil Aberto Colli Badino Jr. Professor Adjunto I Universidade Fderal de So Carlos Departamento de Engenharia Qumica Caixa Postal, 676 13565-905, So Carlos, SP, Brasil Antonio Bonomi .Pesquisador Coordenador Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do Estado de So Paulo S.A. Diviso Qumica , Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, So Paulo, SP, Brasil Beatriz Vahan Kilikian Professora Associada Universidade de So Paulo Escola Politcnica Departamento de Engenharia Qumica Caixa Postal, 61548 05424-970, So Paulo, SP, Brasil Deise Maria Fontana Capalbo Pesquisadora Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria EMBRAPA/CNPMA Rodovia SP 340, km 127,5 Caixa Postal, 69 13820-000, Jaguarina, SP, BrasilI l,~Haroldo Hiss Pesquisador Cientfico Insituto Butant Av. Vital Brasil, 1500 05503-900, So Paulo, SP, Brasil Iracema de Oliveira Moraes Professora Titular Universidade de Guarulhos Centro de CinCias Exatas e Tecnolgicas Praa Teresa Cristina, 1 07033-070, Guarulhos, SP, Brasil Joo Carlos Monteiro de Carvalho Professor Doutor Universidade de So Paulo Faculdade de Cincias Farmacuticas Departamento de Tecnologia Bioqumica-Farmacutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 05508-900, So Paulo, SP, Brasil Jos Geraldo da Cruz Pradella Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do Estado de So Paulo S.A. Diviso Qumica Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, So Paulo, SP, Brasil Josef Emst Thiemann Pesquisador Snior Biobrs S.A. Avenida C, 1413- Distrito Industrial Caixa Postal, 377 39404-004, Montes Claros, MG, Brasil. 9. XIILuiz Carlos Urenha Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do Estado de So Paulo S.A. Diviso Qumica Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, So Paulo, SP, BrasilPedro Srgio Pereiralima Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do Estado de So Paulo S.A. Diviso de Mecnica e Eletricidade Agrupamento de Sistemas de Controle Caixa Postal, 0141 01064-970, So Paulo, SP, BrasilManuel Filgueira Barrai Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do Estado de So Paulo S.A. Diviso Qumica Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, So Paulo, SP, BrasilRafael Almudi Villen Professor Associado Centro Universitrio do Instituto Mau de Tecnologia Escola de Engenharia Mau Departamento de Engenharia Qumica e de Alimentos Praa Mau, 1 09580-900, So Caetano do Sul, SP, BrasilMaria Cndida Reginato Facciotti Professora Titular Universidade de So Paulo Escola Politcnica Departamento de Engenharia Qumica Caixa Postal, 61548 05424-970, So Paulo, SP, BrasilSunao Sato Professor Titular Universidade de So Paulo Faculdade de Cincias Farmacuticas Departamento de Tecnologia Bioqumico-Farmacutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 05508-900, So Paulo, SP, BrasilMaria Filomena de Andrade Rodrigues Pesquisadora Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do Estado de So Paulo S.A. Diviso Qumica Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, So Paulo, SP, BrasilUrgel de Almeida Lima Professor Pleno Centro Universitrio do Instituto Mau de Tecnologia Escola de Engenharia Mau Departamento de Engenharia Qumica e de Alimentos Praa Mau, 1 09580-900, So Caetano do Sul, SP, Brasil Michele Vitolo Professor Titular Universidade de So Paulo Faculdade de Cincias Farmacuticas Departamento de Tecnologia . Bioqumico-Farmacutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 05508-900, So Paulo, SP, BrasilVanildo Luiz Del Bianchi Professor Doutor Universidade Estadual Paulista Intituto de Biocincias, Letras e Cincias Exatas Rua Cristovo Colombo, 2265 15054-000, So Jos do Rio Preto, SP, Brasil 10. XIIIWalter BorzaniWillibaldo SchmidellProfessor PlenoProfessor TitularCentro Universitrio do Instituto Mau de Tecnologia Escola de Engenharia Mau Departamento de Engenharia Qumica e de Alimentos Praa Mau, 1 09580-900, So Caetano do Sul, SP, BrasilUniversidade de So Paulo Escola Politcnica Departamento de Engenharia Qumica Caixa Postal, 61548 05424-970, So Paulo, SP, Brasil( 11. XVCDN1ENGENHARIA BIOQUMICA: UMA APLICAO SUl GENERIS DA ENGENHARIA QUMICA .................................................................................... 1Literatura recomendada ........................... :...................................................... 3 2MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA PARA UTILIZAO INDUSTRIAL ..................................................................................................................... 5 2.1 Introduo .............................................................................................................. 5 2.2 Fontes de microrganismos de interesse ............................................................. 7 2.3 Caractersticas desejveis de microrganismos e meios de cultura para aplicao industrial ............................................................................. :..... 10 2.4 Consideraes finais ........................................................................................... 18 Referncias bibliogrficas : 18 ESTERILIZAO DO EQUIPAMENTO ............................................................... 19 3.1 Introduo ............................................................................................................ l9 3.2 Terminologia e modo de atuao ..................................................................... 20 3.3 Esterilizao por agentes fsicos ....................................................................... 25 3.4 Esterilizao e desinfeco por agentes qumicos ......................................... 33 Referncias bibliogrficas .....................................................:............................ 38 ESTERILIZAO DE MEIOS DE FERMENTAO POR AQUECIMENTO COM VAPOR . ............... :: ............................................................ 39 4.1 Introduo ............................................................................................................ 39 4.2 Descrio sumria dos processos de esterilizao por calor mido ........... 40 4.3 Cintica da destruio trmica de microrganismos ....................................... 45 4.4 Destruio de nutrientes do meio corno conseqncia da esterilizao .... 51 4.5 Consideraes geris a respeito do clculo do tempo de esterilizao ...... 53 4.6 Clculo do tempo de esterilizao por processo descontnuo ..................... 56 4.7 Clculo do tempo de esterilizao por processo contnuo ........................... 60 Literatura recomendada .................................................................................... 62 ESTRILIZAO DE AR. : ~:: ........... 63 5.1 Introduo ............................... :............................................................................ 63 5.2 Aerossis microbianos ........................................................................................ 64 5.3 Arnostradores ...................................................................................................... 65 5.4 Mtodos para a esterilizao de ar .......... ......................................................... 75 5.5 Consideraes finais .....................................:..................... :............................... 90 Referncia.s biliogrficas .................................................................................... 90 12. XVI 6CINTICA DE PROCESSOS FERMENTATIVOS . ............................................. 93 6.1 Introduo ................................................. ;........................................................... 93 6.2 Parmetros de transformao ' 95. 6.3 Clculo das velocidades .................................................................................. 101 6.4 A curva de crescimento microbiano ............................................................... 103 6.5 Classificao dos processos fermentativos ................................................... 107 6.6 Influncia da concentrao do substrato sobre a velocidade especfica de crescimento .. .............................................................................. 110 Apndice ............................................................................................................ 114 Referncias bibliogrficas ................................................................................ 1217MODELAGEM MATEMTICA E SIMULAO DE PROCESSOS FERMENTATIVOS . ..................................................................................................... 123 7.1 Introduo .......................................................................................................... 123 7.2 Formulao dos modelos matemticos de processos fermentativos ........ 124 7.3 Ajuste de parmetros do modelo formulado ............................................... 148 7.4 Avaliao do modelo matemtico .................................................................. 164 7.5 Simulao de processos fermentativos .......................................................... 172 Referncias bibliogrficas ........................................... ,.................................... 175 BIORREATORES E PROCESSOS FERMENTATIVOS . ................................. 179 8.1 Introduo .......................................................................................................... 179 8.2 Classificao dos biorreatores : 180 8.3 Formas de conduo de um processo fermentativo ................................... . 185 8.4 Exemplos de comparao de desempenho de biorreatores ....................... 189 Referncias bibliogrficas ............................................................................. ... 190 FERMENTAO DESCONTNUA. ................. :.................................................... 193 9.1 Introduo .......................................................................................................... 193 9.2 Inculo ................................................................................................................ 194 9.3 Mosto ........................................................................................ .......................... 196 9.4 Classificao ............. ......................................................................................... 199 9.5 Nmero de domas ............................................................................................ 200 Referncias bibliogrficas .........:......................... : 204 FERMENTAO DESCONTNUA ALIMENTADA . ...................................... 205 10.1 Introduo::.................................... 205 10.2 Aplicaes .......................................................................................................... 207 10.3 Classificao ............................................................... ....................................... 210 10.4 Modelos matemticos ....................................................................................... 212 Referncias bibliogrficas ................................................................................ 216 FERMENTAO SEMICONTNUA ..................................................................... 219 11.1 Definio ........................................................... :................................................ 219 11.2 Produtividade do processo semicontnuo .......................................... ~ ......... 220 11.3 Comentrios finais ................................................ ............................................ 222 Referncias bibliogrficas ...... ..................................................... ..................... 222 FERMENTAO CONTNUA . ............................................................................... 223 12.1 Conceitos bsicos .................................... .......................................................... 223 12.2 Vantagens e desvantagens do processo contnuo em relao ao descontnuo .................................................................................................. 22489101112 13. XVII12.3 12.413@~ )Formas de operao no sistema contnuo ............... ...................................... 225 Formao de produtos no sistema contnuo ....... .......................................... 242 Referncias bibliogrficas ............................................................ :................... 245FERMENTAO EM ESTADO SLIDO. ......................................................... 247 13.1 Introduo .......................................................................................................... 247 13.2 Histria do processo da FSS ...................... .......... ....................................... ..... 248 13.3 Microrganisrhos comumente utilizados ............................,........................... 250 13.4 Substratos: caractersticas e composio ....................................................... 250 13.5 Reatores para fermentao semi-slida ......................................................... 254 13.6 Controles do processo ............................... ................................................... .... 259 13.7 Vantagens e desvantagens ............................................................................... 264 13.8 Exemplos de casos ....................................................................................... ..... 266 Referncias bibliogrficas ............................................................................ .... 270 AGITAO E AERAO EM BIORREATORES . ........................................:.. 277 14.1 A importncia da transferncia de oxignio ............ ........................... ......;... 277 14.2 Sistemas para a transferncia de oxignio .................................................... 279 14.3 Concentrao de oxignio dissolvido em soluces saturadas ................... 281 14.4 Transferncia de oxignio e respirao microbiana ................................. .... 284 14.5 Transferncia de oxignio em sistemas agitados e areados ........................ 308 14.6 Consideraes finais .......................................... .................................. ......... .... 329 R:ferncias bibliogrficas ................................................................................ 329L!..?/ VARIAAO DE ESCALA. ...................,.................................................................... 333 15.1 15.2 15.3 15.4 15.5Introduo .......... ,...........................:...................................... .............................. 333 Critrios para a ampliao de escala ................................ ............................. 336 Comparaes entre critrios para a ampliao de escala ........................... 348 Reduo de escala ................................................ ;........... .'................ ~ ............... 351 Consideraes finais .................................................................................... :.... 352 Referncias bibliogrficas ...................................................: ~ ............... ......... 353 ....16REATORES COM CLULAS IMOBILIZADAS . .........................................:.... 355 16.1 Introduo ...... ,....................................................... ...... ........................... ........... 355 16.2 Mtodos de imobilizao ................................................................................. 356 16.3 Tipos de biorreatores empregados .............................. ,........ .................... ...... 360 16.4 Aspectos relativos ao transporte de massa ..................................... .... .......... 363 16.5 Processos que utilizam clulas imobilizadas ................................................ 366 . 16.6 Concluses ................................................. ........................................................ 370 Referncias bibliogrficas .................................................... :........................... 37117REATORES COM ENZIMAS IMOBILIZADAS ............................................... 373 17.1 Introduo ..................................................................................... ;.................... 373 17.2 Reatores enzimticos .................................................... :................................... 374 17.3 Exemplos de processos enzimticos .............. .......... ,.................... ................. 388 Referncias bibliogrficas ...........................................;.. :................................. 39518AUTOMAO E CONTROLI;: DE PROCESSOS FERMENTATIVOS . ... 397 18.1 Introduo .......................................................................................................... 397 18.2 Principais instrumentos para monitorao ein linha de processos fermentativos .................... .. .......... ..................................................................... 398 14. XVIII18.31920OPERAO DE INSTALAES INDUSTRIAIS DE FERMENTAO . ........................................ :.............................................................. .425 19.1 Princpios gerais para operao ...................................................................... 425 19.2 Condies gerais para a execuo de um processo fermentativo ............. 426 19.3 Operao de uma indstria ............................................................................. 429 19.4 Operao de um processo frmentativo assptico ...................................... 434 19.5 Exemplo de operao de indstria de fermentao ................................... .435 Bibliografia ............................................................................................... ......... 439 CONSTRUO DE EQUIPAMENTOS DE FERMENTAO . ................. .441 20.1 Introduo .......................................................................................................... 441 20.2 Caractersticas bsicas de reatores para cultivo de bactrias ou clulas animais .................................................................................................. 442 20.3 20.4 20.5 20.6 20.72122Controle aplicado a processos fermentativos ............................................... 411 Referncias bibliogrficas ................................................................................ 423Construo do fermentador ........................................................................ .... 448 Cultivo de clulas animais .............................................................................. 468 Obteno e manuteno das condies de esterilidade e 4 biossegurana ..................................................................................................... _70 Vlvulas e purgadores de vapor .................................................................... 480 Outros tipos de reatores ................................................................................... 485 Bibliografia ........................................................................................................ 489PURIFICAO DE PRODUTO~ BIOTECNOLGICOS . ............................493 21.1 Introduo ..............................:......... :......................................................:........... 493 21.2 Classificao ......................................... :............................................................. 494 21.3 Rompimento de clulas microbianas ............................... ,............................. 501 21.4 Precipitao ....................................................................................................... 504 21.5 Ultrafiltrao ..................................................................................................... 507 21.6 Extrao em sistemas de duas fases aquosas ............................................... 507 21.7 Cromatografia ................................................................................................... 510 21.8 Tratamentos finais ............................................................................................ 514 21.9 Rotinas analticas .............................................................................................. 515 21.10 O processo integrado de purificao ............................................................. 518 Referncias bibliogrficas ...................................................................~. ~ .......... 520 ASPECTOS ECONMICOS . .................................................................................. 523 22.1 Introduo .......................................................................................................... 523 22.2 Consideraes sobre as diferentes variveis e suas relaes existentes em todo o estudo econmico ............................ :........................... 523 22.3 Anlise de viabilidade econmica ......................................... :....................... 528 22.4 Aspectos econmicos de processos fermentativos ...................................... 530 22.5 Mtodos de avaliao de investimento ........................... ;............................. 535 Bibliografia ........................................................................................................ 541--- --- ------~---------- 15. ------- - - - - -- - -- - -- -- - ---Walter BorzaniDurante a Segunda Grande Guerra (1939-1945), os ento "Aliados" concentraram esforos considerveis na consecuo de um objetivo muito especfico: transferir para escala industrial o processo de laboratrio, ento conhecido, de produo de penicilina por fermentao. Ao lado de profissionais j de longa ~ata envolvidos no estudo de atividades microbianas, passaram ento a atuar engenheiros qumicos, com vistas soluo de questesbastante complexs inerentes desejada ampliao de escala. Foi nesse perodo que nasceu o ramo da Engenharia Qumica que, mais tarde, por suas peculiaridades, receberia o nome de Engenharia Bioqumica. Neste praticamente meio sculo de existncia, esse novo ramo da Engenharia Qumica progrediu rapidamente, conduzindo a muitos resultados de indiscutvel importnda-prtica. O objetivo da Engenharia Bioqumica a aplicao dos conhecimentos da Engenharia Qumica na soluo de problemas que se apresentam na implantao de processos biotecnolgicos em larga escala, e em sua otimizao. Segundo AIBA, HUMPHREY e MILLIS: "Biochemical engineering is concerned with conducting biological processes on an industrial scale, providing the links between biology and chemical engineering. The authors believe, moreover, that the heart of biochemical engineering lies in the scale-up and management of cellular processes". BAILEY e LLIS, por sua vez, dizem: "Processing of biological materiais and processing using biological agents such as cells, enzymes or antibodies are the central domain of biochemical engineering. Success in biochemical engineering requires integrated knowledge of governing biological properties and principies and of chemical engineering methodology and strategy. (... ) Reaching this objective clearly requires years of careful study and practice". Convm citar que o primeiro livro dedicado Engenharia Bioqumica foi publicado em 1958, por STEEL. 16. 2Engenharia bioqumica: uma aplicao sui generis da engenharia qumicaOs problemas que se apresentam no mbito da Engenharia Bioqumica so, com alguma freqncia, de difcil soluo, dadas as peculiaridades e a complexidade dos sistemas em que se desenvolvem os processos biotecnolgicos. O estudo de vrios desses problemas constitui o principal objetivo deste volume, mas parece-nos aconselhvel, neste primeiro captulo, comentar alguns deles, com a nica finalidade de dar, aos alunos, uma idia das questes que sero examinadas. Comecemos tecendo alguns comentrios a respeito dos balanos materiais em processos fermentativos. A clula microbiana responsvel pela transformao que nos interessa em um dado processo realiza, alm dessa transformao, um grande nmero de outras reaes com o objetivo, para ela absolutamente primordial, de manter-se viva e multiplicar-se. Isso pode dificultar o estabelecimento de balanos materiais, alm de afetar o rendimento do processo considerado. O conhecimento das provveis vias metablicas que se desenvolvem nas clulas , neste particular, de grande auxlio, fornecendo muitas vezes informaes que indicam a maneira mais adequada de conduzir o processo que nos interessa. O fato inevitvel, apontado hpouco, de a clula ter a nica "preocupao" de manter-se viva e multiplicar-se, tambm pode acarretar srios problemas no estudo da cintica da transformao que se tem em vista, uma vez que a velocidade de formao do produto que nos interessa pode ser profundamente afetada pelas velocidades de outras reaes integrantes do metabolismo do microrganismo. Isso pode dificultar o estabelecimento de modelos matemticos, cuja importncia na otimizao e no controle de processos j foi constatada muitas vezes. A manuteno de um razovel grau de "homogeneidade" no reator, para que todos os agentes da transformao se encontrem, pelo menos aproximadamente, nas mesmas condies (temperatura, pH, concentraes de substncias do meio), outro problema a ser considerado, principalmente em reatores industriais. Consideremos, agora, a operao de esterilizao de grandes volumes de meio, operao esta muito freqente em indstrias de fermentao. Como proceder: eliminar os microrganismos por filtrao do meio ou destru-los por aquecimento? Se a esterilizao por aquecimento tiver sido escolhida, que processo ser utilizado: o descontnuo ou o contnuo? Que temperatura de esterilizao ser adotada e qual o correspondente tempo do tratamento trmico? Quais sero as dimenses dos equipamentos e os controles necessrios em cada caso? O meio, uma vez esterilizado, ser encaminhado ao fermentador onde ser transformado pela ao das clulas microbianas. Aqui nos depararemos com muitas alternativas. Sero utilizados microrganismos em suspenso no meio ou clulas imobilizadas em suportes inertes? Que processo de fermentao ser utilizado: o descontnuo, o semicontnuo ou o contnuo? Com ou sem recirculao do microrganismo? Se for escolhido o processo descontnuo, ser o descontnuo simples ou o descontnuo alimentado? Se o processo adotado for o semicontnuo, que frao de meio fermentado ser periodicamente retirada do reator e substituda por igual volume de meio novo? No caso de se ter optado pelo processo contnuo, adotar-se- um nico reator de mistura, vrios reatores de mistura ligados em srie, ou um reator pistonado? Quais sero as dimenses e o form~to do reator? Como controlar as condies de fermentao? Como adicionar alguns nutrientes: 17. Engenharia bioqumica: uma aplicao sui generis da engenharia qumica3todos de uma s vez no preparo do meio, ou de maneira programada durante o andamento do processo? No caso de se tratar de um processo enzimtico contnuo com enzimas imobilizadas, lanar-se- mo de um reator de leito fixo, ou de leito fluidizado? Outro tpico a ser lembrado, o da ampliao da escala de trabalho ("scale-up"): se bons resultado~ foram obtidos, em certas condies, em um reator de pequena capacidade, como operar um reator industrial para que os mesmos resultados sejam alcanados? Finalmente, para no alongarmos demasiadamente estes comentrios, nunca ser demais ressaltar a importncia de que se reveste a escolha dos processos que sero utilizados, tanto na separao dos produtos e subprodutos, como no tratamento, ou no aproveitamento dos resduos. A soluo adequada de muitas das questes com que se defronta a Engenharia Bioqumica passa, necessariamente, pelo estabelecimento de modelos matemticos, como se constatar ao longo deste Volume. Parece-nos oportuno, por esse motivo, ressaltar a utilidade desses modelos, valendo-nos de um artigo publicado por FREDRICKSON e colaboradores em 1970: "1. Models serve to correlate data and so provide a concise way of thinking about a system or process.2. Models allow one- within limits- to predict quantitatively the performance of a system or process.-Thus~ they can reduce the amount of experimentallbor necessary to design and/ or optimize a process. 3. Models help to sharpen thinking about a system or process and can be used to guide one's reasoning in the design of experiments, to isolate important parameters and elucidate the nature of the system r process. That is to say,' the combinations of mathematical modelling and experilllen_ research often suggests new experiments that need to be ta} done."Literatura recomendada (1) AIBA, S., HUMPHREY, A.E. & MILLIS, N .F. Biochemical Engineering. University of Tokyo Press, Tquio, 1973. (2) BAILEY, J.E. & OLLIS, D.F. Biochemical Engineering Fundamentais. McGraw-Hill Book Company, Nova York, 1986. (3) SIMON, P. & MEUNIER, R. Microbiologie Industrielle et Gnie Biochimique. Masson et Cie., diteurs, Paris, 1970. 18. 5- - - - - - - - - - - - - -- -- -Willibaldo Schmidell2.1 - Introduo O objetivo central do presente captulo reside na descrio das caractersticas gerais que microrganismos e meios de cultura devem apresentar, a fim de ser possvel utiliz-los em uma operao industrial de grande porte, ou seja, executada em biorreatores com volumes de dezenas de milhares de litros. Apesar de se procurar mencionar, ao longo do texto, alguns exemplos, no h a preocupao em de$crever caractersticas particularmente importantes para um determinado processo fermentativo, pois isto tornaria o tema extremamente longo, alm de apresentar uma importncia questionvel, tendo em vista o escopo geral do presente captulo. Retomando as idias j abordadas no Captulo 9 (Vol. 1), na Figura 2.1 encontra-se um esquema geral de um processo fermentativo, na qual buscou-seressaltar alguns pontos essenciais, que permitem um incio de discusso dentro do objetivo acima traado. Conforme se pode observar na Figura 2.1, o sucesso de um dado processo fermentativo depende muito de uma correta definio de quatro pontos bsicos: o miCrorganismo, o meio de cultura, a forma de conduo do processo fermentativo e as etapas de reclperao do produto. Na verdade, esses quatro pilares de um processo fermentativo interagem enormemente, sendo necessrio buscar defini-los de forma conjunta, levando em considerao aspectos biolgicos e econmicos, o que torna bastante complexa esta adequada definio. Para tornar clara essa idia, pode-se mencionar que sempre se pretende empregar meios de cultura baratos, mas deve-se lembrar que o microrganismo deve encontrar neste ineio condies adequadas para realizar a converso pretendida. 19. 6Microrganismos e meios de cu~ura para utilizao industrialEm termos de formas de conduo do processo fermentativo, seria difcil imaginar a produo presente de etanol no Brasil (algo como 15 bilhes de litros por ano), caso no se operasse os biorreatores em sistema descontnuo alimentado, ou mesmo contnuo, porm com o reciclo das clulas. Da mesma forma, o grande avano alcanado pela digesto anaerbia no tratamento biolgico de guas resi.durias, deveu-se muitssimo ao surgimento dos reatores contnuos operados com fluxo ascendente e reciclo interno de clulas.Matrias-primasl Prei>r11-----------------+--------------~80E ~60c.40/__... //vvY#.........-I--f-- 1--20o o102030405060708090100Tempo (min)Figura 3.6 - Curva de aquecimento em autoclave vertical de um reator com volume til de I O lrt:ros. O ponto a indica o momento em que o termmetro da autoclave marcou 121 C. O ponto b indica o momento em que a temperatura da autoclave passou a ser controlada em 121oc.4v 211 1210o o o oo o o o7Figura 3.7 - Alguns detalhes a serem considerados no projeto de reatores esterilizveis por calor mido. 44. Esterilizao por agentes ffsicos3.1A linha de exausto de gases tambm deve conter um filtro esterilizante adequado (4), que evite tanto a contaminao do reator por microrganismos do ambiente como a contaminao do ambiente por microrganismos e aerossis originados no reator. O sistema de agitao do lquido deve preferencialmente ser colocado na parte superior do reator. Dessa maneira, o selo que permitir a vedao do orifcio por onde penetra o eixo Q5) dever ser projetado para reter apenas gases. Quando for mais conveniente a colocao do eixo pelo fundo do reator, o sistema de selagem dever ser capaz de reter lquidos. Em geral, selos para gases so mais eficientes e de manuteno mais simples. As linhas de inoculao (6), amostragem (7), e esgotamento (9) devem tambm ser esterilizadas pela passagem de vapor saturado. A de amostragem deve ser esterilizada aps cada retirada de amostra. Um procedimento comum para esterilizao descontnua do reator o seguinte: (a) o reator recebe o meio de cultura e aplica-se uma agitao baixa; (b) aquece-se o meio atravs da serpentina ou camisa (8, 10) at cerca de 96 a 97C; (c) simultaneamente ao item b, injeta-se vapor pelas linhas de entrada superior de ar (11) e de inoculao (6), deixando o vapor fluir pela linha de exausto (4) e se possvel pela vlvula de segurana (3); (d) inicia-se a aplicao de vapor vivo ao tanque pela linha de entrada inferior de ar (12) e, se necessrio, pelas linhas de esgotamento do tanque (9) e de amostragem (7); (e) quando o meio de cultura atingir 100C, as vlvulas de exausto, de segurana, de entrada superior de ar (12) e de inoculao (6) so fechadas; (f) quando a temperatura e presso internas atingirem as indicadas para esterilizao (em geral, 121 C e 1 atm), as vlvulas de entrada inferior (12), de esgotamento do tanque (9) e de amostragem (7) devem ser fechadas; (g) manter a presso e temperatura de esterilizao pelo tempo necessrio atravs da aplicao de alor pela serpentina ou camisa; (h) atingido o tempo necessrio, iniciar o resfriamento pela aplicao de gua fria atravs da serpentina ou camisa; (i) quando a temperatura do meio de cultura atingir 100C, iniciar a pressurizao do tanque com ar estril (1, 11), o suficiente para evitar formao de vcuo no reator; (j) quando a temperatura atingir 'cerca de 85C, abrir a vlvula de exausto de gases (4); (k) continuar o resfriamento do tanque at a temperatura desejada. A manuteno peridica do reator deve incluir a limpeza e eventual substituio de todas as vlvulas que tenham contato direto com o reator ou com as linhas esterilizadas (ar, inculo, amostragem, exausto, descarga, etc.). Outros pontos sensveis so o sistema de selagem do eixo do agitador e as soldas e conexes do reator. Pequenos vazamentos em vlvulas, selos, conexes e soldas podem ser detectados, fechando-se todas as sadas do reator e pressurizando-o com ar at cerca de 1 atm. Fecha-se o ar e verifica-se se a presso mantidapor perodos longos (24 h). Caso haja perda de presso, deve-se buscar e corrigir os vazamentos. Vazamentos na serpentina ou camisa podem ser detectados, secando-se totalmente o reator e circulando-se gua sob presso no sistema de aquecimento/resfriamento por um perodo longo (24 h). Se houver vazamento, aparecer gua no interior do reator. 45. 32E~erilitao do equipamento3 .3 .3 - Esterilizao por calor seco A esterilizao por calor seco empregada para vidrarias, ;metais e slidos resistentes ao calor. levada a efeito em fornos ou estufas que atingem temperaturas superiores a 150C. Na ausncia de umidade, a transferncia de calor mais lenta e os microrganismos apresentam maior resistncia inativao. Dessa forma, os tempos de exposio ao calor devem ser muito maiores (cerca de 3 a 4 horas), para garantir a 2 eficincia da operao de assepsia.3.3.4- Esterilizao por radiao ultravioleta Radiao ultravioleta utilizada para esterilizar materiais slidos, como vidrarias, utenslios metlicos, embalagens, etc. Os raios ultravioleta agem diretamente sobre o DNA e RNA, alterando a estrutura dessas molculas e provocando danos ao processo de manuteno e diviso celular. Em funo do tempo de exposio, esses danos normalmente levam os microrganismos morte. Ultravioleta jamais deve ser usado na presena de pessoas ou animais. A fonte de ultravioleta normalmente uma lmpada emissora dessa radiao. A emisso diminui com o tempo, exigindo um controle sobre o tempo de vida til dessas lmpadas. A esterilizao feita simplesmente expondo os materiais radiao em ambiente fechado, pelo tempo adequado (vrias horas). Como a capacidade de penetrao da radiao ultravioleta muito baixa, apenas a superfcie do material exposto eo ar ao redor so esterilizados.3.3.5- Esterilizao por radiao gama Rdiao gama, em geral produzida por cobalto 60 ou csio 137, tem poder de penetrao extremamente alto. O bombardeio de microrganismos por gama gera grande quantidade de alteraes nas molculas de DNA, danificando-as, em geral irreversivelmente. Adicionalmente, inmeras molculas internas aos microrganismosso ionizadas (a gua, por exemplo), dando origem a espcies txicas al4 tamente reativas, como os perxidos e vrios radicais livres. Essas molculas . desestruturam o equilbrio bioqumico dos microrganismos, mesmo esporulados. Os materiais expostos radiao gama no guardam resqucios radiativos, da ser um mtodo seguro de esterilizao. O bombardeio com radiao gama deve ser feito em cmaras especiais, em geral muito grandes. Uma vez posta em operao, no mais possvel impedir a emisso da radiao, de forma que essas cmaras operam continuamente. A esterilizao feita colocando-se o material a ser esterilizado em um continer, que por sua vez colocado em uma esteira que circula pelo interior da cmara de irradiao. O material pode entrar e sair da cmara vrias vezes, at atingir o nvel de irradiao adequado. 46. Esterilizao e desinfeco por agentes qufmicos33Dada a complexidade do mtodo, apenas materiais como vidrarias, metais, e materiais slidos como ps, solo, alimentos, sementes, embalagens, etc. so submetidos a esse processo de esterilizao. A unidade de medida da irradiao no SI o gray. Materiais pouco contaminados so submetidos a doses de 10 a 30 quilograys. Materiais mais contaminados requerem doses maiores, como 50 a 75 quilograys. O microrganismo mais resistente radiao chama-se Deinococcus radiodurans e exige cerca de 60 . quilograys para ser inativado. Esporos de Clostridium botulinum demandam 5 a 22 quilograys para serem inativados. O gray substituiu a unidade rad, muito utilizada. Na converso, 1 gray corresponde a 100 rad.3.4- Esterilizao e desinfeco por agentes qumicos 3.4.1 -Germicidas qumicos A utilizao do calor mido , de longe, a tcnica mais utilizada para proporcionar a esterilizao e a desinfeco de equipamentos dentro de uma indstria de fermentao. Os agentes qumicos de esterilizao e desinfeco so utilizados quando equipamentos de operaes unitrias ou componentes de uma instalao industrial no admitem esterilizao pelo vapor de gua saturado. Isso pode ocorrer em virtude da incompatibilidade dos materiais de construo desses componentes com temperaturas elevadas (por exemplo, filtros; bombas, centrfugas, secadores, vlvulas, linhas de transferncias de fluidos e equipamentos de medio, etc.). Nesses casos, para atingir o grau de sanitizao necessrio a um dado processo, faz-se uso de agentes sanitizantes lquidos denominados germicidas qumicos. Diferentemente da esterilizao pelo calor, essas substncias agem temperatura ambiente, necessitando entretanto tempos maiores de contato para produzir o efeit() _ esejado. Alm disso, sua capacidade sanitizante est fortemente d relacionada a fatores ligados s propriedades fsicas do material a ser tratado (material plstico ou metlico, superfcie lisa ou rugosa, porosidade do material, ausncia ou presena de locais de difcil acesso) e s caractersticas qumicas do ambiente (pH, presena de matria orgnica contaminante, formao de filmes e depsitos no material, dureza da gua utilizada na diluio do princpio ativo, presena de resduos de sabo). Todos esses fatores podem afetar negativamente o processo de esterilizao ou desinfeco, e somente a prtica pode dar ensejo a um procedimento padronizado que conduza a um nvel de sanitizao adequado a um determinado processo industrial. Em razo dos grandes problemas advindos das infeces em ambientes hospitalares, especialmente pelo fato do surgimento de linhagens bacterianas patognicas resistentes, responsveis por doenas como a tuberculose, meningite e pneumonia e de vrus como o da hepatite B e o HIV, promotor da SIDA/ AIDS (Sndrome da Imunodeficincia Adquirida), um grande trabalho de pesquisa e de regulamentao vem sendo dedicado ao uso de germicidas qumicos no controle dessas infeces. Como conseqncia, o uso desses compostos tem se transformado em um mtodo bastante conveniente e efetivo de esterilizao e desinfeco e 47. 34Esterilizao do equipamentoum grande nmero de formulaes comerciais surgiram no mercado. At o incio dos anos 90, havia nos Estados Unidos, registrados na EP A (Environmental Protection Agency), uma das agncias americanas responsveis pelo registro e legislao sobre o uso desses produtos, cerca de 14.000 formulaes comerciais com ao germicida. Baseado na experincia prtica, possvel estabelecer-se urna ordem de resistncia dos microrganismos exposio aos germicidas qumicos (Tabela 3.2). Tabela 3.2 - Ordem descendente de resistncia a germicidas qumicos e nvel de atividade requerido para esterilizao (adaptado de Favero; Bond 7) .TIPO DE MICRORGANISMOBACTRIA ESPORULANTE Bacillus subtilis Clostridium sporogenesNVEL DE ATIVIDADE REQUERIDOAltoMICOBACTRIA Mycobacterium tuberculosis var. bovisAlto a intermedirioVRUS PEQUENOS OU NO LIPDICOS poliovrus rhinovrusAlto a intermedirioFUNGOS Trichophyton spp. Cryptococcus spp. Candida spp.Intermedirio a baixOIBACTRIA VEGETATIVA Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Salmonella choleraesuisVRUS MDIOS OU LIPDICOS vrus da Herpes simplex CitomegalovrusBaixoBaixo 48. Esterilizao e desinfeco por agentes qumicos35Essa tabela mostra que as bactrias formadoras de esporos, exemplificadas aqui por Bacillus subtilis e Clostridium sporogehes, so as mais resistentes aos germicidas, enquanto que, em ordem descendente de resistncia, os vrus de tamanho mdio ou que possuem componentes lipdicos em sua composio tendem geralmente a possuir a mais baixa resistncia aos germicidas. Esporos bacterianos necessitam alto nvel de atividade germicida para serem destrudos. Essa condio pode ser conseguida com a utilizao de solues aquosas de glutaraldedo, perxido de hidrognio de 6 a 30% e produtos que contm mistura a baixas concentraes de cido peroxiactico e perxido de hidrognio (0,1% e 1,0%, respectivamente). O dixido de cloro (Cl0 2 ) pode ser usado a concentraes variadas. Porm, por ser .fortemente oxidante, seu uso limitado, devido ao efeito altamente corrosivo em superfcies de metal ou de plstico. O uso de formaldedo em solues aquosas de 6 a 8% efetivo, embora haja controvrsias devido ao seu possvel efeito carcinognico. Germicidas de nvel intermedirio no necessariamente causam a destruio de esporos bacterianos, mas devem possuir a caracterstica de inativar Mycobacterium tuberculosis var. bovis, assim como fungos, vrus lipdicos ou no lipdicos e bactrias vegetativas. Exemplos desses germicidas so solues hidroalcolicas 70 a 90% de etanol ou isopropanol, compostos clorados com cerca de 500 a 5.000 ppm de cloro livre, soluo aquosa de perxido de hidrognio 3a 6%, algumas preparaes fenlicas e os iodophors (preparaes que conseguem carrear 12 concentrao de 40 a 50 ppm de iodo livre). Os germicidas qumicos de nvel baixo so capazes de destruir formas vegetativas de bactrias, a maioria dos fungos (mas no todos), assim como vrus que contm lipdios em sua composio. Esses germicidas no conseguem inativar Mycobacterium tuberculosis var. bovis nem tampouco bactrias esporuladas. Exemplos desses desinfetantes so as formulaes de compostos quaternrios de amnio concentrao de 0,1 a 0,2%. Como foi dito, a prtica de desinfeco/esterilizao industrial utilizando-se germicidas qumicos depende de uma srie de fatores ambientais, que devem ser levados em conta quando do estabelecimento do protocolo de sanitizao de um determinado equipamento. De uma maneira geral, um ciclo de desinfeco I esterilizao qumic de um equipamento contm as seguintes etapas: a) desmontagem do equipamento (se for o caso); b) limpeza dos componentes, procedendo-se remoo de todo tipo de resduos de meio de cultura, biomassa e produtos, fazendo uso de detergentes, se necessrio; c) lavagem dos componentes com gua com baixo teor de dureza para remoo dos detergentes utilizados; d) montagem do equipamento e introduo da soluo aquosa do germicida, propiciando o tempo de exposio preestabelecido para a ao germicida requerida; ....._____ _ _ e) dren-~ge~ ~a soluo germicida do sistema;J ' ----- ~-- 49. 36I IEsterilizao do equipamentof) remoo dos resduos do germicida atravs de circulao cuidadosa de gua ou outro fluido estril. A Tabela 3.3 descreve algumas utilizaes tpiCas de germicidas qumicos. Existem disponveis no comrcio vrias preparaes com caractersticas semelhantes s descritas nessa tabela. No Brasil, a regulamentao e recomendao do uso de um germicida particular realizada por organismos como o INCQS (Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade). A Tabela 3.3, pretende, dessa maneira, ser meramente didtica. Tabela 3.3 - Utilizao tpica de germicidas qumicos (N.A.=nvel de atividade, sol.aq.=soluo aquosa) GERMICDA QUMICOATIVIDADE E CARACTERSTICASUTILIZAO TPICACompostos quaternrios de amnio sol. aq. at 0,2%Bactrias vegetativas, gramnegativas, podem ser resistentes, N.A. baixoLimpeza geral e manutenoCompostos fenlicos, sol. aq. at 5%Pode ser ativo at contra vrus no lipdicos, N.A. baixo a intermedirioDesinfeco de reas de laboratrio e produoSol. aq. etanol ou isopropanol a 70%Bactrias vegetativas, fungos e amplo espectro de vrus, N.A. intermedirioDesinfeco de materiais por imerso na soluoSol. aq: 0,5% cloro livreAmplo espectro, pode inativar bactrias esporuladas, limitao de uso pela atividade corrosiva, N .A. intermedirioDesinfeco de equipamentos, reas de laboratrio e produoSol. aq. Formaldedo 4 a 8%Amplo espectro, pode inativar bactrias esporuladas, potencial carcinognico, irritante, N.A. intermedirio a altoDesinfeco de equipamentosSol. aq. Formaldedo 8% e etanol ou isopropanol a 70%Amplo espectro, ao contra micobactrias e bactrias esporuladas, potencial carcinognico, irritante, N.A. altoEsterilizao de equipamentos, dependendo do tempo de exposioSol. aq. glutaraldedo 2% e surfactanteAmplo espectro, ao contra micobactrias e bactrias esporuladas, iritante, N.A. altoEsterilizao de equipamentos, dependendo do tempo de exposioFormulaes contendo perxido de hidrognio 6 a 10%Amplo espectro, ao contra micobactrias e bactrias esporuladas, N.A. altoEsterilizao de equipamentos, dependendo do tempo de exposio 50. Esterilizao e desinfeco por agentes qumicos31Assim, recomenda-se fortemente utilizar as formulaes comerciais disponveis no mercado, segundo a orientao do fabricante, de acordo com seu registro nos rgos governamentais competentes. Desde que as operaes preliminares de limpeza das partes a serem desinfetadas ou esterilizadas tenham sido feitas cuidadosamente, o tempo de exposio para se atingir um determinado nvel de destruio microbiana em um dado equipamento vai depender fundamentalmente do germicida escolhido e das caractersticas da populao microbiana remanescente, ou seja, tipo e nmero de microrganismos presentes. Embora a temperatura seja um fator relevante nos processos de destruio microbiana, no estamos levando isto em conta, pois supe-se que o procedimento de desinfeco I esterilizao seja realizado temperatura ambiente. O tempo necessrio para se atingir um determinado nvel de sanitizao, dessa forma, varia bastante. Uma simples desinfeco, com a qual se pretenda destruir a populao ativa de bactrias vegetativas, a maioria dos fungos e os vrus lipdicos, rode ser conseguida utilizando-se etanol 70% em gua em cerca de 10 8 minutos. Uma populao de esporos de bactrias aerbias bastante elevada (10 esporos) pode ser destruda em 60 minutos com exposio a uma soluo de per8 xido de hidrognio a 10%. Por outro lado, uma soluo de formaldedo 8% e isopropanol 70% pode levar at cerca de 18 h para a eliminao de uma alta 7 populao de esporos bacterianos. A escolha de um germicida qumico particular vai se basear, dessa maneira, no nvel de desinfeco requerido pelo processo e em aspectos econmicos.3 .4. 2 - Agentes gasosos Agentes gasosos no o mtodo de escolha em indstrias de fermentao, sendo rara, para no dizer inexistente, sua utilizao para esterilizao e desinfeco de equipamentos. A assepsia de salas e laboratrios, porm, comumente realizada com vapores de formaldedo. Os agentes de esterilizao gasosos mais importantes so os seguintes: xido c;!e etileno, xido de propileno, formaldedo e betapropiolactona. O primeiro utilizado principalmente na esterilizao dos mais diversos itens hospitalares, artigos plsticos de laboratrio e outros materiais. O processo se d em cmaras especiais s!melhantes a autoclaves de esterilizao por vapor. A cmara carregada com os itens a serem esterilizados, onde a seguir insuflada uma mistura gasosa do agente ativo e um gs inerte como co2 ou freon (fluoroclorocarbono). Aps um determinado tempo de exposio, a mistura gasosa drenada da autoclave e esta cuidadosamente limpa pela passagem de ar, para 9 eliminao total de resduos do xido de etileno. 10 O xido de propileno utilizado na esterilizao de alimentos. Vapores de formaldedo e betapropiolactona so utilizados principalmente para desinfeco de cmaras, salas e ambientes onde assepsia desejvel. A resistncia de bactrias vegetativas e esporuladas, vrus e fungos aos mtodos de esterilizao por gases bastante varivel, e depende do agente utilizado, sua concentrao, umidade relativa do ambiente e temperatura do processo. 6 Por exemplo, uma populao de 10 esporos de Bacillus subtilis v ar. niger pode ser 51. 38Esterilizao do equipamentoinativada -a 50% de umidade, 47,5C e 500 ppm de xido de etileno, em cerca de 50 minutos. Outros microrganismos possuem resistncias menores ao xido de etileno. Detalhes a respeito da utilizao de gases como agentes desinfetantes e esterilizantes podem ser encontrados em literatura sobre o assunto. 10' 11Referncias bibliogrficas (1) BAILEY, J.E.; OLLIS,D.F. Biochem. Engineering Fundamentais. McGraw-Hill Book Company, Nova York. 1986.965 p. (2) SCRAGG, A.H. Bioreactors in Biotechnology. A Practical Approach. Ellis Horwood, Nova York. 1991. 328 p. (3) RICHARDS, J.W. Introduction to Industrial Sterilization. Academic Press, Londres. 1968. 173 p. (4) BLOCK, S.S. Disinfection, Sterilization, and Preservation. Lea and Febiger, 2nd edition, Filadlfia. 1991. 1162 p. (5) REDDISH, G.F. Antiseptics, Disinfectants, Fungicides, and Chemical and Physical Sterilization. Lea and Febiger, 2nd edition, Filadlfia. 1957. 953 p. (6) QUESNEL, L.B. Sterilization and Sterility. In: Bullock, technology. Academic Press, Londres. (1987). 545 p.J.; Kristiansen, B. Basic Bio-(7) FAVERO, M.S.; BOND, W.W. Chemical Disinfection of Medicai and Surgical Materiais. In: Block,S.S. Disinfection, Sterilization, and Preservation. Lea and Fabiger, 2nd edition, Filadlfia. 1991. Chapter 35, pp.617-641 (8) WARDLE, M.D.; RENNINGER, G.M. Biocidal effect of hydrogen peroxide in spacecraft bacterial isolates. Appl. Microbiol.,30, 710-711, 1975. (9) PARISI, A.P.; YOUNG, W.E. Sterilization with Ethylene Oxide and other Gases, In: Block,S.S. Disinfection, Sterilization, and Preservation. Lea and Febiger, 2nd edition, Filadlfia. 1991. Chapter 33, p. 580-595. (10) ALGUIRE, D.E. Effective sterilization with 100% ethylene oxide. Bul. Par. Drug Assoc.,17,1-8,1963: (11) CHAIGNEAU, M. Strilisation et Dsinfection par les Gaz. Maisonneuve Editeur, Saint-Ruffine. 1977. 329 p. 52. 39=---=-=l!.SftRIBZA~O-DE=MEIOS-=~: A -::=.:..-::_~-~oE=t=-ERIUIENTAJO=P-OR===---~-: -G~u~~IMENr:O=c-GM::VAP-OR~ ------------------------------------------------------- - -- ---- ---- -J . .Walter Borzani4.1 - Introduo Em muitos processos fermentativos, a presena de microrganismos estranhos (e, s vezes, de vrus) denominados, genericamente, "contaminantes", pode levar a prejuzos considerveis. . No caso da produo de penicilina, por exemplo, os contaminantes podem produzir penicilinase, enzima que decompe a penicilina, resultando meios fermentados com baixa ou mesmo nula concentrao do antibitico. Outro exemplo que merece citao o da fermentao acetona-butanlica. A bactria responsvel por sse processo pode ser rapidamente destruda por vrus bacterifagos, paralisando completamente a fermentao. Outras vezes os contaminantes afetam negativamente o processo, principalmente pelo fato de consumirem nutrientes do meio, competindo assim com os microrganismos responsveis pela fermentao desejada. o que acontece, por exemplo, na produo de enzimas, vitaminas, antibiticos, etanol, etc. H, porm, casos em que a presena de contaminantes pouco ou nada interfere no processo. Assim, por exemplo, na fermentao ltica de hortalias, no tratamento biolgico de resduos, na produo de vinagres, na lixiviao bacteriana de minrios, a boa marcha do processo assegurada pelas prprias condies de trabalho, sendo dispensvel eliminar eventuais contaminantes. Entre os dois casos extremos, isto , aqueles processos em que a presena de contaminantes compromete seriamente o resultado, e aqueles em que os contaminantes praticamente no interferem no bom andamento da fermentao, h um grande nmero de situaes intermedirias. Em resumo, o grau de eliminao de containinantes com o objetivo de obter bons resultados depende de cada caso. Informaes pormenorizadas a respeito desse assunto sero fornecidas, quando necessrio, no Volume 3 desta Coleo, ao se estudar vrios processos fermentativos industriais. 53. 40Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vaporNo podemos deixar de lembrar que, s vezes, a operao de eliminao total de contaminantes pode inviabilizar economicamente o processo, como o caso da fermentao para produo de etanol a partir de caldo de cana-de~acar. No presente captulo examinaremos apenas os processos de destruio de contaminantes por aquecimento com vapor, tambm chamados "esterilizao por calor mido".4.2 - Descrio sumria dos processos de esterilizao por calor mido Consideraremos aqui apenas os dois processos mais importantes de esterilizao de meios em escala industrial, utilizando-se vapor como fluido de aquecimento: o processo descontnuo (tambm chamado processo de batelada) e o processo contnuo. No processo descontnuo, o meio quase sempre colocado no fermentador e, a seguir, aquecido com vapor. Nessas condies, esterilizam-se simultaneamente o meio e o fermentador. O aquecimento do sistema pode ser efetuado, quer borbulhando-se diretamente vapor no meio ( o chamado aquecimento com "vapor direto"), quer passando-se vapor por uma serpentina mergulhada no meio ou por uma camisa que envol_ve o fermentador ( o aquecimento com "vapor indireto"). Em qualquer dos casos, o meio agitado mecanicamente, a fim de assegurar, tanto quanto possvel, a mesma temperatura em todos os pontos do sistema. O aquecimento com vapor direto acarreta, obviamente, diluio do meio (da ordem de 10 a 15%), como conseqncia da condensao do vapor injetado. Na esterilizao descontnua distinguem-se nitidamente trs fases (ver Figs. 4.1, 4.9 e 4.10): a) aquecimento, que eleva a temperatura inicial do meio (sempre prxima da temperatura de preparo do meio) at temperatura de esterilizao (geralmente da ordem de l20C); b) esterilizao, na qual a temperatura mantida aproximadamente constante durante um intervalo de tempo adequado, chamado tempo de esterilizao; c) resfriamento, quando, com auxlio de gua fria passando pela serpentina ou pela camisa, a temperatura reduzida at se atingir a temperatura de fermentao. A rigor, a destruio trmica dos microrganismos no se d apenas na fase chamada "esterilizao". No aquecimento, e tambm durante o resfriamento, enquanto a temperatura for superior denominada "temperatura mnima letal" (da ordem de 80 a 100C), tambm h destruio de microrganismos (ver Fig. 4.1) . Voltaremos a examinar esse assunto mais admte. 54. Descrio sumria dos processos de esterilizao por calor mido41Algumas horasTempoFigura 4.1 - Representao esquemtica da variao de temperatura do meio durante sua esterilizao por processo descontnuo. 1: Aquecimento. 11: Esterilizao. 111: Resfriamento. Te: temperatura de esterilizao. Ti: temperatura inicial. T t: temperatura final do meio esterilizado = temperatura de fermentao. T m: temperatura mnima letal. tempo de esterilizao.e:Se, por um lado, a esterilizao descontnua apresenta a vantagem de esterilizar simultaneamente o meio e o fermentador, reduzindo assim os perigos de contaminao nas operaes de transferncia do meio para a dorna, ela apresenta, por outro lado, algumas srias desvantagens, a saber: a) manuteno do meio em temperaturas relativamente altas (acima de 100C), por perodos bastantes longos (da ordem de algumas horas), favorecendo o desenvolvimento de reaes qumicas no meio com possveis alteraes indesejveis em sua composio (decomposio de nutrientes, por exemplo); b) elevados consumos de vapor (no aquecimento) e de gua (no resfriamento), conseqentes da eficincia relativamente baixa do sistema de troca de calor; c) problemas de corroso ocasionados pelo contato prolongado do fermentador com o meio aquecido; d) tempo "no produtivo" relativamente elevado, uma vez que o fermentador utilizado apenas como um tanque de esterilizao durante o processo de destruio dos contaminantes. Passemos agora ao exame da esterilizao por processo contnuo, representado esquematicamente na Figura 4.2.: o meio recentemente preparado enviado, pela bomba B, ao trocador de calor TCl (de tubos, ou de placas), onde atua como fluido de resfriamento do meio j esterilizado e ainda quente; desse trocador de calor, o meio, agora preaquecido, mistura-se com vapor enviado ao injetor I onde a temperatura sobe quase instantaneamente, at alcanar a temperatura de esterilizao; a essa temperatura, praticamente constante, o meio percorre o tubo de re- 55. 42Esterilizao de meios de fennentao por aquecimento com vaporteno ou de espera TE (quase sempre termicamente isolado), dimensionado de modo a que o tempo de residncia do meio no tubo seja igual ao tempo de esterilizao; o meio j esterilizado, mas ainda a uma temperatura muito alta, passa pela vlvula de reduo de presso V e vai, em seguida, ao trocador de calor TCl j citado; deste ltimo, o meio esterilizado encaminhado a um segundo trocador de calor (TC2), onde sua temperatUra reduzida at alcanar o valor desejado; o fluido de resfriamento no trocador TC2 gua fria . Tratando-se, pelo que foi descrito, de aquecimento com vapor direto, haver diluio do meio, da ordem de 10 a 15%. O mosto esterilizado, e j na temperatura de fermentao, ento enviado ao fermentador. Vapor pTE----------- --- -- ------------ ---- --------, I I,------------------------- --- -- ------ --I-- -- -- -- --- -- ------- -- --- ----- --- --- -- -. IIFermenta dorTC1TC2-- -- --------- ---- i--------i - ------- - -------- t - - - - - - ' '-------+---- -- -- ------- --AguaMeio BFigura 4.2 - Representao esquemtica de um esterilizador contnuo. B:.bomba. TC I e TC2: trocadores de calor. 1 injetor de vapr. T: termmetro. P: manmetro. TE: tubo de reteno ou de espera. V: vlvula de reduo de pres: so.A Figura 4.3 mostra, esquematicamente, a variao da temperatura do meio durante a esterilizao contnua. Nesse caso, a destruio de microrganismos durante o aquecimento e durante o resfriamento pode ser desprezada. 56. Descrio sumria dos processos de esterilizao por calor mido43eAlguns minutosTempoFigura 4.3 - Representao esquemtica da variao de temperatura do meio durante sua esterilizao por procesSo contnuo. Ti: temperatura inicial. Tt : temperatura final do meio esterilizado= temperatura de fermentao. Te: temperatura de esterilizao. Tm: temperatura mnima letal. 9 : tempo de esterilizao.Na esterilizao contnua, o aquecimento do meio at temperatura de esterilizao tambm pode ser efetuado com vapor indireto, substituindo-se o injetor de vapor I (Figura 4.2) por um trocador de calor. Neste caso, no haver diluio do meio. A Figura 4.4 representa, de maneira esquemtica, um tubo de espera. Um tubo de espera como o representado na Figura 4.4, desde que adequadamente projetado (o nmero de ramos em U deve ser sempre maior que o necess- rio, para assegurar a esterilizao do meio), permite, por um lado, a execuo de eventuais reparos sem interromper o processo e, por outro, alterar, dentro de certos limites, o tempo de permanncia do meio na temperatura de esterilizao sem variar a vazo. Seguem alguns valores numricos relativos s condies de operao dos esterilizadores contnuos: a) vapor de aquecimento: vapor saturado com presso de 6,8 a 8,5 atm; b) bomba de recalque do mosto n~o esterilizado: podem ser utilizadas bombas centrfugas, rotativas ou de pisto; c) dimetro do tubo de espera: 4 a 12 polegadas (10 a 30 em, aproximadamente); d) tempo de enchimento do fermentador: no superior a 8 h; e) velocidade do meio no tubo de espera: 3 a 60 cm/s, sendo mais utilizado o intervalo de 6 a 12 em/ s; f) nmero de Reynolds no tubo de espera: 36.000 a 80.000; g) temperatura de esterilizao: 130 a 165C. 57. 44 Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapor-----.c..,. ____ _ ..,.____ _Figura 4.4 - Representao esquemtica de um tubo de espera. A: meio temperatura de esterilizao. B: tubos verticais. C: tubos em U dispostos em planos horizontais. D : meio esterilizado. As setas indicam o percurso do meio no tubo de espera com os registros I , 2 e 3 fechados.Para se colocar em funcionamento um aparelho de esterilizao contnua, procede-se do seguinte modo: em primeiro lugar injeta-se em todo o sistema, incluiTI.do o fermentador, vapor a 1 atm (aproximadamente 121 oq durante 2 horas; a seguir, injeta-se ar esterilizado no fermentador de modo a nele se ter uma sobrepresso de 0,3 atm; regulam-se ento as cndies de trabalho utilizando-se gua em vez do mosto; quando as condies estiverem ajustadas, comea-se a bombear o meio a ser esterilizado; uma vez eliminada toda a gua existente no aparelho, abre-se o registro para o fermentador, que ento carregado com meio esterilizado. O processo contnuo de esterilizao apresenta, em relao ao descontnuo, algums vantagens, a saber: a) por se trabalhar a temperaturas mais elevadas, e tambm por serem muito rpidas as operaes de aquecimento e resfriamento do mosto, o tempo de permanncia do meio em alta temperatura relativamente pequeno (da ordem de 5 a 15 min), o que acarreta menor destruio de nutrientes (como veremos mais adiante); como conseqncia deste fato, a prtica tem mostrado, em vrios casos, que a fermentao de um meio esterilizado por processo contnuo apresenta rendimento substancialmente maior do que o obtido na fermentao do meio esterilizado por processo descontnuo (5 a 6 vezes maior na produo de riboflavina, e cerca de 10 vezes maior na produo de vitamina B12, por exemplo); b) pelo fato de ser de dimenses relativamente pequenas, o tubo de espera pode ser construdo com ligas especiais, evitando a contaminao metlica (muitas vezes prejudicial fermentao) do mosto que poderia resultar do ataque da parede do tubo pelo meio; 58. Cintica da destruio trmica de microrganismos45c) quando o meio apresenta densidade ou viscosidade relativamente alta, como no caso de mostos de cereais, o processo contnuo dispensa os motores de potncia elevada que seriam necessrios para o acionamento dos agitadores no processo descontnuo de esterilizao; d) economia de vapor, e de gua de resfriamento, em relao ao processo descontnuo, desde que os trocadores de calor e o isolamento trmico da tubulao sejam adequadamente dimensionados; e) os esterilizadores dmtnuos podem ser tambm utilizados nos processos de cozimento e sacarificao de matrias.:.primas amilceas. Importa, contudo, no esquecer que as viabilidades tcnica e econmica do processo contnuo dependem das dimenses e do regime de trabalho dos fermentadores da instalao industrial.4.3 - Cintica da destruio trmica de microrganismos A velocidade de destruio pelo "calor mido" de microrganismos presentes em um dado meio depende de vrios fatores, a saber: a) do microrganismo (gnero, espcie, linhagem; idade da cultura, existncia ou no de esporos); b) do meio (composio, pH, presena de slidos em suspenso); c) da temperatura. Imaginemos um experimento em que um determinado microrganismo, em suspenso em um dado meio, mantido a uma temperatura constante e superior temperatura mnima letal. Se durante o ensao determinarmos o nmero de microrganismos vivos existentes no sistema, como a temperatura superior mnima letal esse nmero de microrganismos vivos ser uma funo descrescente do tempo. A experincia mostra que, com boa aproximao, os resultados podem ser representados como indica ,a Figura 4.5,z EFigura 4.5 - Representao esquemtica da variao do nmero de microrganismos vivos (N) aps um tempo t de manuteno do meio a uma temperatura letal constante T N 0 =nmero de microrganismos vivos no instante t = O. 59. 46Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vaporIsso nos mostra que, do ponto de vista cintico, a destruio do microrganismo se comporta como se fosse uma reao de primeira ordem, isto : (4.1)dN -=-k N dtsendo N o nmero de microrganismos vivos existentes no meio aps um tempo t de aquecimento do sistema a uma dada temperatura constante. A constante k denominada constante de velocidade de destruio trmica do microrganismo. O valor de k depende dos fatores citados no incio deste item. Para um dado microrganismo em um dado meio, k depender apenas da temperatura. Sendo N 0 o nmero de microrganismos vivos no instante t =O, a eq. (4.1) nos d: (4.2)lnN=lnN 0 -ktequao esta que nos permite, a partir de valores experimentais resultantes de medidas de N para diferentes valores de t, calcular a constante k do microrganismo em estudo, no meio considerado, na temperatura ensaiada. A ttulo de exemplo, consideremos os valores da Tabela 4.1, obtidos de experimentos realizados com esporos de Bacillus stearothermophilus, suspensos em soluo tampo de pH = 7,0, temperatura de 105C. Tabela 4.1 - Destr_uio trmica de esporos de Bocillus steoro thermophilus a Ioso c. '*~t (minutos)N258,5. 104503,5. 104 ..1006,0200. .'~~... 103~~,'"~2,0. 102250 ..~ j~ "-i!40 --.~....-!,_::;.~w-.~T:!"."';;r-::iE~jA partir dos valores da Tabela 4.1, por regresso linear obtemos (ver Fig. 4.6), no intervalo de tempo 25 mina 250 min: ln N=12,1626- 0,0341 t (r= -0,9998)sendo r o coeficiente de correlao. Nesse caso, o valor de k 0,0341 min- 1 Se o experimento tivesse sido realizado no a 105C, .mas a 121 oc, valores de k prximos de 3 min - 1 poderiam ser obtidos, dependendo da variedade do Bacillus 60. Cintica da destruio trmica de microrganismos47stearothermophilus utilizada (ver Fig. 4.8). A influncia da temperatura no valor de k ser considerada mais adiante. 128z E4o o100200300t (min)Figura 4.6- Representao grfica dos resultados da Tabela 4.1 .Mostra a experincia que os esporos so bastante mais resistentes destruio trmica do que as clulas vegetativas. Alm disso, observa-se que no h, nesse caso, obedincia, eq. 4.2 no intervalo de tempo inicial de exposio d suspenso de esporos temperatura considerada, como indica a Figura 4.7. No cabe, neste livro, o exame desse problema. Considerando-se, porm, que a destruio trmica de esporos , na prtica, sempre realizada em temperaturas elevadas (pelo menos l20C), e considerando-se que, nessas temperaturas, o desvio da curva experimental em relao eq. 4.2. geralmente pequeno, pode-se, para fins de clculos de interesse industri;Il, considerar aplicvel a expresso 4.2. No estudo da destruio trmica de microrganismos, costuma-se definir um outro parmetro: o tempo de reduo decimal, indicado por D . o tempo necessrio para reduzir o nmero de microrganismos a 1/10 do valor inicial (em outras palavras, para destruir 90% dos microrganismos vivos existentes). Se na equao 4.2 fizermos N = 0,1 N 0 , teremos, de acordo com a definio de tempo de reduo decimal, t = D. Logo: ln(O,lN 0 )=lnN 0 -kDe, portanto: D= 2,303k(4.3) 61. 48Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vaporz EFigura 4.7- Representao esquemtica de curvas de destruio trmica de esporos a diferentes temperaturas (Tl , Tz e T 3) No caso do exemplo indicado na Tabela 4.1, teremos: D=67,5min isto , temperatura de 105C, 90% dos microrganismos presentes no meio considerado sero destrudos em 67,5 min. A eq. 4.3 mostra, ainda, que os fatores que afetam o valor de k afetam tambmD. ' Uma vez fixados o microrganismo e o meio, vejamos de que maneira a temperatura afeta o valor de k. D11as equaes foram propostas com o objetivo de correlacionar k e a temperatura, a saber: a) Equao de Arrhenius k=Aexp(-a I RT)(4.4)onde A uma constante emprica, R a constante universal dos gases perfeitos, T a temperatura absoluta e a a denominada energia aparente de ativao de destruio trmica do microrganismo (ou simplesmente energia de ativao de destruio do microrganismo). b) Equao de Bigelow k =A' exp (!) T')(4.5)onde A'e!) so constantes empricas e T' a temperatura medida em C ou em F. 62. II Cintica da destruio trmica de microrganismos49As eqs. 4.4 e 4.5 conduzem, respectivamente, a: a 1 lnk=lnA---(4.6)lnk=lnA'+f3T'(4.7)R TConhecendo-se os valores de k para diferentes temperaturas, as eqs. (4.6) e (4.7) permitem calcular, por regresso linear, os valores das constantes nelas indicadas. Em particular, a equao 4.6 nos dar o valor da energia de ativao a. A Figura 4.8 mostra a influncia da temperatura no valor da constante de velocidade de destruio trmica de esporos de Bacillus stearothermophilus. Observe-se a obedincia eq. 4.4. Neste exemplo, os valores experimentais representados na Figura 4.8 conduzem a um valor de a igual a 68,7 kcal/mol. Para muitos microrganismos encontram-se valores de a entre 65 e 85 kcal/mol.3 0,1 0,05 26025526510 5 /T (K- 1)Figura 4.8 - Influncia da temperatura (T) na constante de velocidade de destruio trmica (k) de esporos de Bacil-lus stearothermophilus.Se aplicarmos as equaes de Arrhenius e de Bigelow a um mesmo microrganismo, no mesmo meio e mesma temperatura, teremos: . Aexp(-a.I RT) =A'exp(f3 T')Logo: , 1 A a 1 T =-ln----13 A' f3 R T(4.8) 63. ~. 50Esterilizao de meios de fermento por aquecimento com vaporLembrando que A, A ', a,~ e R so constantes, a eq. 4.8 nos diz que T' varia linearmente com 1IT, o que um absurdo, uma vez que T' (expressa em oq igual a T-273 . Acontece, porm, que a equao 4.8 permite, com boa aproximao, calcular T' em funo de T, desde que no se considerem intervalos de temperatura muito amplos. Assim, por exemplo, no intervalo de 100 a 160C, a seguinte equao pode ser obtida por regresso linear: (4.9)T' = 532,9 -1,620(10 5 I T) (r = -0,9992)onde T' a temperatura em C, T a temperatura absoluta e r o coeficiente de correlao. Se considerarmos apenas o intervalo de 120 a 160C, que do ponto de vista de aplicaes prticas o mais importante, teremos: T' = 552,4 -1,701 (10 5 IT)(4.10)(r =- 0,9995)A Tabela 4.2 mostra, para vrios valores de por T-273 e pelas eqs. (4.9) e (4.10). T, 'OSvalores de T' calculadosTabela 4.2 - Aplicao das equaes 4.9 e 4. 1O.T (K)T-273Eq. 4.9Eq. 4.1037310098,6-j383110109,9-l't'irr-------------r-------------+-----~------+-----------~rfrr-------------r-------------+-------------+-------------~~-3393120120,7119,6. '.'~---- o3 4_____~_______o____-+_____ _o,9 13 13 _ ____-r____1 3~_____~t~ _ 0, 3413140140,6140,5~r r-----4 2- 3----~------1-5------+-----1- 9,~ 0 4- 9----~------0-----~~! 15 ,3 433Explica-se, portanto, levando-se em conta os erros experimentais que afetam os valores de k (principalmente os inerentes s medidas dos nmeros de clulas vivas), a possibilidade de cqrrelacionar k com a temperatura, tanto pela eq. 4.4 quanto pela 4.5. 64. Destruio de nutrientes do meio como conseqncia da esterilizao5I4.4 - Destruio de nutrientes do meio como conseqncia da esterilizao O aquecimento de um meio com o objetivo de destruir microrganismos nele existentes acarreta, simultaneamente, alteraes em sua composio. Reaes indesejveis (como por exemplo, decomposio de vitaminas e reaes entre glicose e aminocidos), cujas vlocidades aumentam com a temperatura, podem prejudicar a posterior atividade dos microrganismos da fermentao, conduzindo a rendimentos ou produtividades menores do que os esperados. A temperatura escolhida para a esterilizao do meio desempenha, nesse particular, papel relevante. A experincia mostra que, quanto mais elevada for a temperatura escolhida para se conseguir a destruio de uma dada quantidade de microrganismos do meio, menor ser a destruio de nutrientes existentes nesse meio e, conseqentemente, melhores sero os resultados obtidos na fermentao posterior. Isso uma conseqncia do fato de ser a energia de ativao da destruio trmica dos microrganismos (65 a 85 kcal/mol) maior que a da destruio trmica de nutrientes. A Tabela 4.3 mostra valores da energia de ativao de destruio trmica de alguns nutrientes. Tabela 4.3 - Energia de ativao de destruio trmica de alguns nutrientes. SubstnciaEnergia de ativao (kcal/mol),.Vitamina C23,1cido flico16,8'~Vitamina B1223,1f.Vitamina A14,6Vitamina B1 -,:;... ..26,0-:~: l":i. ... ~~- ,...,_!:.8Por sua importncia prtica, tanto na esterilizao de meios de fermentao como na esterilizao de alimentos, essa afirmativa deve ser demonstrada. Consideremos um dado volume de meio contendo N 0 microrganismos vivos, nmero esse que deve ser reduzido a N 1 < N 0 Seja 50 a concentrao de um nutriente termolbil no meio, antes do tratamento trmico. Suponhamos que esse tratamento trmico seja realizado a duas temperaturas constantes TI e T2 , com T2 > TI. Sejam: ti = tempo para reduzir.o nmero de microrganismos vivos de N o a N 1, quando a temperatura TI; . t 2 = tempo para reduzir o nmero de microrganismos vivos de N o a N fl quando a temperatura T 2; ki = constante de velocidade de destruio dos microrganismos temperatura T,; 65. 52Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vapork2 = constante de velocidade de destruio dos microrganismos temperatu-ra Tz;a = energia de ativao de destruio dos microrganismos; 5 1 = concentrao final do nutriente aps o tratamento do meio temperatura T 1; 5 2 = concentrao final do nutriente aps o tratamento do meio temperatu-ra T 2;k1' =constante de velocidade de destruio do nutriente temperatura T1; kz' = constante de velocidade de destruio do nutriente temperatura T2; a ' =energia de ativao de destruio do nutriente. A eq. 4.2 nos permite calcular t 1 e t 2 :1 N0 t 2 = - l n kzNfLogo: (4.11)Mas, pela eq. 4.4, temos: (4.12)k 2 =Aexp(-a. I RT2 )(4.13)Substituindo-se, na eq. 4.11, os valores de k 1 e k 2 dados pelas eq. 4.12 e 4.13, teremos: (4.14)Vejamos, agora, o que aconteceu com a concentrao do nutriente. Admitin.do, apenas para simplificar a demonstrao, que a destruio trmica do nutriente seja de primeira ordem, teremos: 66. 53Consideraes gerais a respeito do clculo do tempo de esterilizao(4.15)Pela equao de Arrhenius:Logo, a eq. 4.15 nos d:!.1_ = ln (5 0 I 51) exp(~. T2- T1, J t2 (5 0 I 52) R T1 T2(4.16)As expresses 4.14 e 4.16 permitem, ento, escrever: "(aT1 T1 T2exp - T 2 R-J=ln (5 0 I 5 1) exp (a' T (5 0I 52)RT1 . T1 T2 2 -JtfLembrand? que a >a', teremos:N:.~Ficando assim demonstrado que a concentrao final do nutriente no tratamento trmico do meio, temperatura T 2 , maior do que a concentrao final do nutriente no tratamento trmico do meio temperatura T 1 < T 2 , isto , a destruio do nutriente . menor quando o meio termicamente tratado a temperatura mais alta.4.5Consideraes gerais a respeito do clculo do tempo de esterilizaoJ vimos que a eq. 4.2 nos d: (4.17)~ .l,.ij 67. 54Esterilizao de meios de fermentao por aquecimento com vaporexpresso esta que nos permite, conhecido o valor de k, calcular o tempo necessrio para reduzir o nmero de microrganismos vivos de N 0 at N. A aplicao dessa equao a clculos de tempos de esterilizao no to simples como pode parecer primeira vista. O primeiro problema que se apresenta, decorre do fato que os meios de fermentao a esterilizar no possuem uma nica espcie de microrganismo a ser destruda. Nos meios utilizados na prtica encontramos microrganismos vivos pertencentes a diferentes gneros e espcies, alguns esporulados e outros no, que devem ser eliminados para assegurar a inexistncia de contaminantes na fermentao posterior. Lembrando que o valor de k depende do microrganismo, a aplicao da eq. 4.17 torna-se praticamente impossvel. Contorna-se esse problema escolhendo-se um microrganismo de referncia conhecido, altamente resistente ao calor, e admitindo-se que todos os microrganismos existentes no meio a ser esterilizado apresentem uma resistncia destruio trmica igual do microrganismo de referncia. bastante freqente a escolha do Bacillus stearothermophilus esporulado como microrganismo de referncia. O segundo problema que surge ao tentarmos aplicar a eq. 4.17 a casos reais reside no fato de a constante de velocidade k depender, tambm, do meio e da temperatura. Uma vez escolhido o microrganismo de referncia, preciso, portanto, conhecer os valores de k desse microrganismo em suspenso no meio a ser esterilizado e a diversas temperaturas, o que pode, com freqncia, implicar na realizao de experimentos preliminares de determinao de k. Como primeira aproximao, quando no se conhecem valores de k, pode-se admitir k ~ 1 ~in- 1 (a 121 oq e a~ 75 kcal/ mol. O terceiro problema a ser considerado conseqente do fato de, nos meios a esterilizar, as clulas microbianas a serem destrudas poderem se encontrar na forma de aglomerados, ou ainda protegidas por partculas slidas em suspenso no meio. Isso acarreta um verdadeiro aumento da resistncia dos microrganismos destruio trmica, aumento esse de quantificao muito difcil. Finalmente, outro problema na aplicao da eq. 4.17 ao clculo do tempo de esterilizao decorre da prpria definio de esterilizao. De fato, lembrando que a esterilizao a operao que tem por finalidade destruir todos os microrganismos vivos existentes no meio, o nmero final de microrganismos vivos dever ser N =O e, neste caso, a eq. 4.17 deixa de ser aplicvel. Esse ltimo problema pode, porm, ser resolvido a partir da definio de probabilidade de falha de uma esterilizao. Sendo: E1 = nmero total de operaes de esterilizao realizadas nas mesmas condies; E1 = nmero de operaes de esterilizao que falharam, isto , que no conduziram a um meio esterilizado. Define-se probabilidade de falha (P) dessa esterilizao pela relao: (4.18) 68. 55Consideraes gerais a respeito do clculo do tempo de esterilizaoMultiplicando-se por 100 essa ltima frao, a probabilidade de falha ser expressa em porcentagem. Suponhamos, para facilitar a exposio, que uma dada esterilizao apresente probabilidade de falha igual a 0,03 (ou 3%). Isso significa que, de 100 partidas de meio tratadas termicamente nas mesmas condies, sero obtidas, em mdia, 97 partidas esterilizadas e 3 partidas no esterilizadas. Se indicarmos por N0 o nmero de microrganismos vivos em cada partida de meio a esterilizar, o nmero de microrganismos nas 100 partidas de meio a esterilizar ser 100 N0 Acontece, nesse caso, que 3 par