Catálise Enzimática [Bioquímica I]._

1

CATÁLISE ENZIMÁTICA

Bruno da Silva Thomazini

Gabriel Vendramini

Raquel Massaro

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA – UFSCar

São Carlos, 13 de Junho de 2011

Profa. Dra. Ignez Caracelli Prof. Dr. Julio Zukerman Schpector

2

SUMÁRIO

1. MECANISMOS CATALÍTICOS

A. Catálise Ácido-Básica

B. Catálise Covalente

C. Catálise por Íons Metálicos Catálise Eletrostática

D. Catálise por meio de Efeitos de Proximidade e Orientação

E. Catálise por Ligação Preferencial do Estado de Transição

2. ANIDRASE CARBONICA

A. Estrutura Enzimática

B. Mecanismo Catalítico

3. SERINO-PROTEASES e CISTEÍNO-PROTEASES

A. O Sítio Ativo

B. Estruturas por Difração de Raio X

C. Mecanismo Catalítico

D. Zimogênios

4. ENZIMAS E NOVAS APLICAÇÕES E TECNOLOGIAS

ENZIMAS

3

4

ENZIMAS – VISÃO GERAL

• Mediadoras de reações químicas;

• Função específica;

• Proteínas catalisadoras:

condições termodinâmicas;

sem alterações no processo global;

não consumidas;

específicas para substrato e reação química.

5

ENZIMAS – VISÃO GERAL

• Atividade catalítica:

Enzimas (proteínas);

Enzimas (RNAs – ribozimas).

• União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB):

Seis classes.

6

ENZIMAS – CLASSES

1. Oxidorreductases:

CH3 – CH – COO- + NAD+ CH3 – C – COO- + NADH + H+

OH O

CH2 - CH – COO- + THF CH2 – COO- + THF

Fonte: CHAMPE, C. P. et al. Bioquímica Ilustrada.

2e- 2H+

Lactato

Lactato- desidrogenase

Piruvato

OH NH3+

H2O

CH2 NH3

+

Glicina

Serina hidroximetil- transferase

Serina

2. Transferases:

7

3. Hidrilases:

NH2 – C – NH2 + H2O CO2 + 2NH3

4. Liases:

CH3 – C – COO- CH3 – CH + CO2

O O


ENZIMAS – CLASSES

Uréia

Urease

Piruvato- descarboxilase

Piruvato Acetaldeído

8

5. Isomerases:

-OOC – CH – C –CoA -OOC – CH2 – CH2 – C - CoA

CH3 – C – COO- + CO2

-OOC – CH2 – C – COO-


ENZIMAS – CLASSES

CH3

O O

Metilmalonil - CoA Succinil - CoA

Metilmalonil – CoA - mutase

6. Ligases:

Piruvato Oxalacetato

Piruvato- carboxilase O O ATP ADP + Pi

9

PROPRIEDADES • Eficiência catalítica;

Fonte:CHAMPE, C. P. et al. Bioquímica Ilustrada.

• Eficiência catalítica;

10

ENZIMAS – PROPRIEDADES

• Sítios ativos:


11

• Especificidade:

Complementaridade

Fonte:VOET, D.; VOET, J. G. Bioquímica.

ENZIMAS – PROPRIEDADES

12

ESPECIFICIDADE

• Hipótese chave-fechadura:

• Hipótese ajuste induzido:

13

MECANISMO CATALÍTICOS

14

MECANISMOS CATALÍTICOS

• Fatores essenciais:

especificidade; organização otimizada.

• Natureza química:

catálise ácido-básica; catálise covalente; catálise por íons metálicos.

15

MECANISMOS CATALÍTICOS

• Natureza física:

catálise eletrostática;

efeitos de proximidade e orientação;

ligação preferencial ao complexo do estado de transição.

16

CATÁLISE ÁCIDO-BÁSICA

• Transferência de prótons entre substrato e enzima.

• Catálise ácida:

Grupo ácido doa um próton;

• Catálise básica:

Grupo básico recebe um próton;

17


• Ex: tautomerização ceto-enólica

Fonte: VOET, D.; VOET, J. G. Bioquímica.

18


• Ex: tautomerização ceto-enólica

• Aminoácidos ionizáveis: Lys, His, Arg, Asp, Glu, Cys e Tyr.


19

CATÁLISE COVALENTE

• Ligação covalente transitória entre enzima-substrato;

• “Ataques” nucleofílico/eletrofílico de um radical do sítio catalítico sobre o substrato.

• Etapas:

reação nucleofílica; retirada de elétrons pelo catalisador

eletrofílico; eliminação do catalisador.

20

CATÁLISE COVALENTE

Catálise predominantemente eletrofílica


21

CATÁLISE POR ÍONS METÁLICOS

• Íons metálicos – cofatores metálicos;

• Metais: ligados à enzima ou na solução aquosa;

• Freqüentemente envolve metais de transição:

cargas positivas;

aceptores de pares eletrônicos.

• Interações iônicas:

orientação do substrato;

estabilizar cargas.

22


• Três formas de participação:

ligação com o substrato;

mediando reações de oxirredução;

estabilizando eletrostaticamente.

23


• Metaloenzimas:

contém íons metálicos fortemente ligados;

Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ ou Co3+.

• Enzimas ativadas por metais:

ligam íons metálicos da solução;

Na+, K+, Mg2+ ou Ca2+.

24


• Enzimas/cofatores metálicos:

Fonte: MOTTA, V.T. Bioquímica Básica.

25

CATÁLISE ELETROSTÁTICA

• Moléculas vizinhas - solventes:

redução dos efeitos de atração entre grupos químicos.

• Constante dielétrica muito baixa: reatividade química do substrato;

reduz a energia de ativação.

26

CATÁLISE ELETROSTÁTICA

• Distribuição de cargas no sitio ativo:

estabilização dos estados de transição;

guiar substratos polares para seus sitios de ligação.

27

CATÁLISE POR EFEITO DE PROXIMIDADE E ORIENTAÇÃO

• Enzimas têm maior eficiência catalítica com:

condição física do sítio catalítico;

relação espacial adequada complexo enzima-substrato orientado estado de transição.

28

CATÁLISE POR EFEITO DE PROXIMIDADE E ORIENTAÇÃO


29

CATÁLISE POR LIGAÇÃO PREFERENCIAL AO ESTADO DE TRANSIÇÃO

• Estado de transição liga-se com a enzima;

• Torção mecânica nos seus substratos:

“Mecanismo do balcão de estiramento”;

Facilita as reações.

30

• Reação 315 vezes mais rápida quando R é o grupo CH3 e não H.


CATÁLISE POR LIGAÇÃO PREFERENCIAL AO ESTADO DE TRANSIÇÃO

31

ANIDRASE CARBÔNICA

32

ANIDRASE CARBÔNICA

• Metaloenzima

• Enzima da classe liase

• Monômero

• Sítio ativo Zn+

- Histidina 94 - Histidina 96 - Histidina 119

- Molécula de água

33

ANIDRASE CARBÔNICA

Estrutura Enzimática

1hcb

34

ANIDRASE CARBÔNICA 1hcb


35

ANIDRASE CARBÔNICA

Estrutura Enzimática com ligantes

1hcb

Bicarnobato

Zinco

36

ANIDRASE CARBÔNICA 1hcb


Zn

His119

His94

His96

37

ANIDRASE CARBÔNICA


1hcb

Zn

BCT

His

His

His

Água

38

ANIDRASE CARBÔNICA

• Enzima que catalisa a conversão rápida de dióxido de carbono em um próton (H+) e um íon bicarbonato (HCO3-)

Anidrase Carbônica Dissociação

↓ ↓

CO2 + H2O ↔ H2CO3 ↔ H+ + HCO3-

Ácido Carbônico

39

MECANISMO DE CATÁLISE ANIDRASE CARBÔNICA

Fonte: http://deqb.ist.utl.pt/bbio/72/pdf/cataliseenz.pdf

PROTEASES

40

41

PROTEASES

• Catalizam a clivagem de ligações peptídicas (hidrolização)

• Responsáveis por:

– Renovação de Proteínas

– Reciclagem de aminoácidos

– Obtenção de novas proteínas

– Etc.

Fonte: http://graduacao.iqsc.usp.br/files/Aula12BioqIMecCatEnzExemplos201104072.pdf 41

42

PROTEASES

• Subdivisões

– Exopeptidase: atuam grupamento amino ou carboxi terminal

– Endopeptidase: atuam regiões internas

• Divisão com base no grupo funcional: (Barret, 1994)

– *Serino Proteases – resíduo de serina no sítio ativo

– *Cisteíno Proteases – resíduo de cisteína no sítio ativo

– Aspartil – 2 unidades de ácido aspártico

– Metalo – utiliza íon metal no mecanismo de catálise

SERINO PROTEASES

43

44

(EC 3.4.21) – 3 representa a Classe = Hidrolase (catalisa reações de hidrólise de ligações

covalentes) – 4 é a Sub-Classe = Peptidase (hidrolisa ligações peptídicas) – 21 é a Sub sub-classe das serino-endopeptidases (enzimas contendo serina no

sítio ativo)

SERINO PROTEASES

Serina

44

45

SERINO PROTEASES Sítio Ativo

• Tríade Catalítica: resíduos (Ser, Asp e His)

Tripsina Fonte: PDB (2D8W)

Serina

Aspartato

Histidina

Quimotripsina Fonte: PDB (2Y6T)

46

SERINO PROTEASES Identificação do Sítio Ativo

• Marcação covalente com DIPF (diisopropylphosphofluoridate) • Apenas a Ser reativa ligou ao DIPF - 1 de 20 Ser na Quimotripsina

Figura pg4 Arq Aula12Bioq.....

Fonte: http://graduacao.iqsc.usp.br/files/Aula12BioqIMecCatEnzExemplos201104072.pdf

47

SERINO PROTEASES Estruturas de Raio X

• 1957 – Estrutura da quimotripsina bovina (David Blow) • Estrutura primária - ~40% idênticos • Ser reativa / His cataliticamente essencial / Asp próxima ao sítio • 2 domínios • Folhas anti paralelas • Estruturas Raio X sugerem uma base para diferentes especificidades

Tripsina Elastase

Fonte :http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/proteases2.htm Fonte: http://chemistry.umeche.maine.edu/MAT500/Peptidase2.html

48

MECANISMO CATALÍTICO • Aplicável à todas serino-proteases

Fonte: DONALD VOET & JUDITH G. VOET Bioquímica Ed. Artmed, 2007

Ataque nucleofílico ao grupo carbonila

A)

Complexo

Enzima - Substrato

48

49

Catálise ácida geral formação do intermediário acil-enzima

B)

Intermediário

Tetraédrico

MECANISMO CATALÍTICO

49

50

Nova extremidade N-terminal

C)

Intermediário

acil-enzima


51

Substituição do grupo amina por uma molécula de água

D)


52


Reverso da Etapa B

E)

Intermediário

acil-enzima


53

Novo extremo C-terminal da cadeia polipeptídica

F)


53

54

- Catálise por tencionamento forma estrutura tetraédrica

- Intermediário tetraédrico estabilizado pelo buraco oxiânion


CISTEÍNO PROTEASES

55

56

(EC 3.4.22) – 3 representa a Classe = Hidrolase (catalisa reações de hidrólise de ligações

covalentes) – 4 é a Sub-Classe = Peptidase (hidrolisa ligações peptídicas) – 21 é a Sub sub-classe das cisteíno-endopeptidases (enzimas contendo cisteína

no sítio ativo)

CISTEÍNO PROTEASES

Cisteína

56

57

CISTEÍNO PROTEASES

• Divididas de acordo com semelhanças estruturais e funcionais

58

CISTEÍNO PROTEASES Estruturas de Raio X

• 1 única cadeia • 2 domínios formando a fenda catalítica

Papaina – 8pap

Domínio 1

Fenda Catalítica

Domínio 2

59

CISTEÍNO PROTEASES Identificação do Sítio Ativo

• Tríade Catalítica

Cys25, His159 e Asn75 (Papaína)

• Cys e His estão em fendas opostas

par iônico estável em pH neutro, responsável pela atividade catalítica.

(Lewis, Johnson et al., 1981)

Fonte: http://ha1000tonc22.br.tripod.com/ 59

60

His159

Asn175

Cys25

Papaína

Papaina – 8pap

61

MECANISMO CATALÍTICO • cisteíno-proteases

61

ZIMOGÊNIOS

62

63

ZIMOGÊNIOS

• Precursores inativos de enzimas proteolíticas

• Possuem todos os resíduos catalíticos

• Sítio ativo distorcido

“A ativação seqüencial permite

rápida produção de grandes

quantidades de enzimas ativas

em resposta a diversos sinais

fisiológicos”.

Tripsina

Tripsinogênio

Elastase

Enteropeptidase

Quimotripsogênio

Quimotripsina

Pró-elastase

64

Tripsinogênio clivagem da ligação entre Lys15 – Ile16.

Quimotripsinogênio clivagem da ligação peptídica Arg15-Ile16 catalisada pela

tripsina.

Pró-elastase é ativada pela clivagem de um pequeno peptídeo N-terminal.

ATIVAÇÃO DE ZIMOGÊNIOS


N-terminal

Tripsinogênio

N-terminal

Tripsina

APLICAÇÕES TECNOLÓGICAS

65


• Ano de 2009

• Enzimas utilizadas para obtenção de ésteres utilizados como produtos alimentícios, farmacêuticos e cosméticos.

66


• Os processos catalíticos tradicionais envolvem ácidos (como ácido sulfúrico) e bases (como hidróxido de sódio) como aceleradores da reação.

• Porém, esses catalisadores têm sido, aos poucos estão sendo substituídos por enzimas, visto que essas apresentam como benefícios condições suaves de operação (temperatura, pressão e pH), especificidade e poucas perdas na reação.

67


68

• Ano de 2009

• Utilização de enzimas na polimerização para produção de materiais derivados de fontes renováveis e com características como biocompatibilidade e biodegradabilidade.

• Evita a utilização de catalizadores tóxicos.


• Ano de 2010

• Desenvolvimento de um biossensor enzimático para determinação de fenóis

69


70 Fonte: http://www.embrapa.br/imprensa/artigos/2011/catalise-enzimatica-produz-biodiesel-mais-verde/

Prós:

Propriedades físicas e químicas

similares ao biodiesel convencional

Substitui catalisador alcalino

Biodegradáveis

Contra:

Custo elevado dos Biocatalisadores

71

ALBERT L. LEHNINGER DAVID L. NELSON MICHAEL M. COX Lehninger Princípios de

Bioquímica Ed. Sarvier, 2007

DONALD VOET & JUDITH G. VOET Bioquímica Ed. Artmed, 2007

Gomes, D. E. B. Estudo da Falcipaína-2 em Complexo com Ligantes por Modelagem e

Dinâmica Molecular como Suporte ao Desenvolvimento Racional de novos Fármacos

Antimaláricos Rio de Janeiro, UFRJ, IBCCF, 2006.

BIBLIOGRAFIA

http://graduacao.iqsc.usp.br/files/Aula12BioqIMecCatEnzExemplos201104072.pdf.

Acesso em Maio, 2011.

http://analgesi.co.cc/html/t13662.html. Acesso em Maio, 2011.

http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/en

zimas.html. Acesso em Maio, 2011.

http://www.gilvan.pro.br/bioquimica.pdf. Acesso em Maio, 2011.

http://deqb.ist.utl.pt/bbio/72/pdf/cataliseenz.pdf. Acesso em Maio, 2011

OBRIGADO!

72

Catálise Enzimática [Bioquímica I]._

Documents

Transcript of Catálise Enzimática [Bioquímica I]._