Cuestionario N° 031. Componentes del HPLC

La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con RMe2SiCl. La fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas, determinan la separación de los contenidos en la muestra. La utilización de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza de los compuestos a determinar.

Los componentes básicos de un cromatógrafo líquido son:

Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de eluyentes)

Dispositivo de inyección Conducciones y conexiones Detector y registrador Columna

Además de los dispositivos anteriormente mencionados se pueden incorporar en el sistema otros que pueden simplificar el trabajo o bien mejorar algún aspecto concreto de la técnica cromatográfica, como pueden ser:

Inyectores automáticos. Colectores de fracciones. Hornos termostatizados para las columnas. Sistemas de tratamiento de datos.

1. Sistema de suministro de fase móvil

La bomba: La misión de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de la fase móvil a través de la columna, sin que el flujo sea influido por la presión en cabeza de columna, ya que ésta puede variar por obstrucción de las líneas de conducción, del filtro de la cabeza de la columna, etc.

Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes características:

- Estar construido con materiales químicamente inertes frente a la fase móvil.

- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.

- Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociado un amortiguador de éstas, ya que las pulsaciones, aunque no afectan a la separación en sí, pueden contribuir al ruido de fondo del detector y por lo tanto disminuir la sensibilidad.

- Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas. El rango de caudales para las columnas que se utilizan habitualmente varía desde los 10µl/min hasta los 10 ml/min (columnas microbore, analíticas y semipreparativas).

- El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del tiempo, ya que de él depende la reproducibilidad de los tiempos de retención.

Tipos de bomba

Bombas neumáticas (Figura 2)

Bombas de motor eléctrico (Figura 3)

Sistemas de mezcla de fase móvil

En cromatografía de líquidos, es posible trabajar en dos modalidades; isocrático, cuando la fase móvil mantiene la misma composición durante la elución, y en gradiente, cuando la composición de la fase móvil cambia según una función dependiente del tiempo.

Para trabajar en la modalidad de gradiente, es necesario que el equipo cromatográfico tenga un dispositivo capaz de realizar mezclas de disolventes con un control preciso y reproducible.

Los dos principales métodos de mezclado de los componentes de la fase móvil se conocen como mezclado a alta presión y mezclado a baja presión.

Sistemas de inyección

El método de introducción de la muestra en CLAE, es de importancia capital, pues un mal sistema de inyección puede dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatográfica que deterioren la eficacia del sistema cromatográfico. Un inyector ideal debe tener las siguientes características:

- Introducir la muestra en la columna como una banda lo más estrecha posible. - Ser de fácil manejo.

- Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra inyectada como en el ensanchamiento que origina en la banda cromatográfica.

- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas. Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los de válvula.

La fase estacionaria

Como en el caso de la cromatografía líquido-sólido, la naturaleza de la fase estacionaria influye en la selectividad del sistema cromatográfico. En la cromatografía de fases ligadas, la polaridad de la fase estacionaria puede ser seleccionada entre una mayor variedad, atendiendo al grupo funcional que se liga químicamente al soporte (Tabla V), cadenas cortas (C-8), cadenas largas (C-18) u otros grupos funcionales.

Si bien es cierto que con las fases ligadas se dispone de más versatilidad en la elección de fases estacionarias, las más habitualmente utilizadas son:

- Cadenas hidrocarbonadas de 18 carbonos para fase inversa.

- Cadenas con extremos amino para fase normal

2. Preparación y purificación de la muestra.

La mayoría de las muestras de alimentos que se analizan por métodos instrumentales de separación son demasiado complejas, están demasiado diluidas o son incompatibles con el sistema cromatográfico, lo que impide su introducción directa. Se necesita preparar la muestra antes de su introducción en el sistema, mediante fraccionamiento, extracción o pre-separación.

Técnicas instrumentales de preparación de muestras de alimentos.

Posibilidades clásicas:

Cristalización Destilación Precipitación Extracción con disolventes (LLE, Soxhlet, etc.)

Otras:

Diálisis y microdiálisis Filtración Ultrafiltración Separaciones con membranas

3. Estructura de la sacarosa y fructuosa.

D-Fructosa

C6H12O6

SacarosaC12H22O11

Referencias bibliográficas

1. Cromatografía líquida de alta eficacia. Disponible en: http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/cromatografia_liquida_de_alta_eficacia.pdf

2. Cromatograf+ia líquida. Disponible en: http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02-gases%20l%C3%ADquidos.pdf

3. Aplicaciones de la Cromatografía Líquida con Detector de Diodos y Fluorescencia al Análisis de Contaminantes Medioambientales. Disponible en: http://www.iaea.org/inis/collection/NCLCollectionStore/_Public/43/028/43028576.pdf