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COMUNICAÇÃO TÉCNICA ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Nº 175799
Anticorpos monoclonais: uso terapêutico e diagnóstico Patricia Léo
Palestra apresentada WORKSHOP DE BIOTECNOLOGIA, WORKBIOTECH, 4., 2018, Botucatu
A série “Comunicação Técnica” compreende trabalhos elaborados por técnicos do IPT, apresentados em eventos, publicados em revistas especializadas ou quando seu conteúdo apresentar relevância pública. ___________________________________________________________________________________________________
Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S/A - IPT
Av. Prof. Almeida Prado, 532 | Cidade Universitária ou Caixa Postal 0141 | CEP 01064-970
São Paulo | SP | Brasil | CEP 05508-901 Tel 11 3767 4374/4000 | Fax 11 3767-4099
www.ipt.br
ANTICORPOS MONOCLONAISUSO TERAPÊUTICO E DIAGNÓSTICO
PATRICIA LÉOLABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA
NÚCLEO DE BIONANOMANUFATURA
INSTITUTO DE PESQUISAS TECNOLÓGICAS - IPT
Nanotecnologia
NÚCLEO DE BIONANOMANUFATURA
BiotecnologiaProcessos químicos
Micro manufatura
LABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
ANTICORPOS MONOCLONAIS
2015: 27% FDA – produtos biológicos – maioria anticorpos monoclonais2015: 61 anticorpos aprovadosAté 2017: EMA – aprovados 21 biossimilares: primeiro AcMo : infliximab (Doença de Crohn e artrite reumatóide)
Anticorpos Monoclonais
Classe de biofármacos mais estudada e com maior crescimento
Aplicações:• Diagnóstico in vitro e in vivo;• Tratamento :
1. Tumores - câncer;2. Doenças cardiovasculares;3. Asma;4. Doenças infecciosas;5. Doença de Crohn6. Psoaríse7. Rejeição de transplantes8. Doenças auto-imunes (Artrite
reumatóide, Esclerose múltipla, Lúpus eritematoso sistêmico;
Tratamento de tumores:
- Reconhecimento específico e ligação a receptores de superfície de células tumorais
-Monoclonais conjugados a drogas – direcionados a célula alvo
- 2004: aprovação *Avastin (Bevacizumab) para tratamento de câncer coloretal metastásico – inibidor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)
* Genentech/Roche
- 1997: Anticorpos anti-fibrina - no inicio do processo de Coagulação (Abciximabe- ReoPro)* inbição da agregação plaquetária)* Centocor- Evita a formação de coágulos no sistema vascular
- Evita a interrupção do fluxo sanguíneo e embolia
Doenças cardiovasculares:
- Anticorpos contra antígenos de superfície de vírus- Exemplos: vírus Hepatite B e o HIV
- Anticorpos contra sub-unidades peptidícas de Streptococcus mutansCárie dentária
Doenças infecciosas virais:
Doenças infecciosas bacterianas:
ANTICORPOS MONOCLONAIS APLICADOS NAS PRÁTICAS MÉDICAS
O que são anticorpos?
Moléculas produzidas pelos linfócitos B após a exposição a um antígeno
Köhler Milstein Jerne
Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1984
Por explicar a formação e diversidade de anticorpos
http://www.whatisbiotechnology.org/exhibitions/milstein/antibodies
https://www.nature.com/milestones/mileantibodies/full/mileantibodies09.html
Células de mieloma (não secretora de anticorpos)
Células baço animais
imunizadosLinfócitos B
Polietileno Glicol
Meio seletivo HATHipoxantina
AminopterinaTimina
Anticorpos MonoclonaisO que são hibridomas?
Kohler & Milstein,
1975 Feeder-layerCamada de macrófagos
Como ocorre a seleção ?
RNA
DNA
Via Principal
ViaAlternativa
HPGRT -
TimidinaQuinase -
Hipoxantina
Timidina
MEIO HAT
Fusão celular
X
1,5 x 106 células/mL
Ascite 1-40mg/mL
Camundongos mesma espécie dos animais imunizados
Como ocorre a expansão ?
Diluição limitante
20-100 µg/mL 1 g/L batelada1–10 g/L batelada alimentada
Biorreator
1975: Köhler &Milstein – Nature – A tecnologia de hibridomasContinuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificityG. KÖHLER & C. MILSTEINNature volume 256, pages495–497 (07 August 1975)
• Tecnologia livre de direitos de propriedade intelectual
• Cada anticorpo = produto único = patenteado = exclusividade de mercado
MOTIVAÇÃO a OBTENÇÃO DOS MONOCLONAIS
1986: aprovado primeiro AcMo terapêutico - Orthoclone OKT3, (prevenção a rejeição de transplantes)HAMA: anticorpos humanos anti-camundongos
1990s aprovação do primeiro anticorpo quimêrico
2013 venda global de ACMo ~ $75 bilhões
2020: »70 AcMo - $125 bilhões
2024: $138,6 bilhões
EVOLUÇÃO DO MERCADO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS
Murino
QuimêricosFC - humano
HumanizadosAC humano com domínios
hipervariáveis murino
Monoclonais recombinantesPlataformas de células animais e
humanas
Nú
mer
o d
e P
rod
uto
s
Mabs e correlatos Produtos aprovados mas removidos do mercado
Número de produtos (Mabs e correlatos) aprovados por ano
2014 = 62015 = 92016 = 62017 = 10
HAMAQuimêricos
CHO
insulina
Mercado de proteínas recombinantes
2013 venda global de ACMo ~ $75
2020: »70 AcMo - $125 bilhões
2024: $138,6 bilhões
MABS2018, VOL. 10, NO. 2, 183–203https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1415671
PERSPECTIVE Antibodies to watch in 2018
Helene Kaplona and Janice M. ReichertbaLaboratory UMRS 1138 “Cancer, Immune Control and Escape”, Cordeliers Research Centre, Paris, France; bThe Antibody Society, Framingham, MA, USA
MABS2018, VOL. 10, NO. 2, 183–203https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1415671
PERSPECTIVE Antibodies to watch in 2018
Helene Kaplona and Janice M. ReichertbaLaboratory UMRS 1138 “Cancer, Immune Control and Escape”, Cordeliers Research Centre, Paris, France; bThe Antibody Society, Framingham, MA, USA
MABS2018, VOL. 10, NO. 2, 183–203https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1415671
PERSPECTIVE Antibodies to watch in 2018
Produção de Anticorpos MonoclonaisTecnologias de Células Animais
Bioterapêuticos – cultura de células Uso Comercial e Estudos Clínicos
Otimização de inúmeras variáveis•Linhagem celular capaz de produzir a molécula requerida com altaprodutividade e baixo custo de operação;
•Meios de cultura e biorreatores que permitam produtividade e qualidade do produto;
•Sensores on-line e off-line informações para melhorar o controle de processo
•Bom entendimento do bioprocesso para um escalonamento adequado
Tecnologias de Células Animais
• Confiável •Robusta •Madura
Obtenção de Anticorpos Monoclonais
Desenvolvimento e engenharia de linhagens
celulares
Meios de culturas e estratégias de processo
Otimização em biorreatores e ampliação
de escala
Caracterização e validação do processo
Transferência de tecnologia
Fabricação em GMP
Testes pré-clínicos
Busca de novos alvos
Obtenção das sequênciasgênicas de interesse
Sistema de expressão em mamíferos
Seleção de clones
produtores
1 2
3
CONSTRUÇÃO DE LINHAGEM CELULAR RECOMBINANTE
Gene de Interesse
Vetor de Expresssão
Linhagem Hospedeira
Linhagem Celular Recombinante
Seleção do vetor de expressãoEstratégias de clonagem
Método de entrega do DNA
Seleção, clonagem e screening
Condições de cultivo, meio utilizadoEngenharia metabólica
Otimização do crescimento, metabolismo e produtividade
Historicamente•Baixo rendimento•Complexidade do meio de cultura•Necessidade de soro fetal bovino•Sensíveis a agitação - cisalhamento
Tecnologias de Células Animais
LINHAGENS CELULARES MAIS UTILIZADAS NA INDÚSTRIA BIOFARMACÊUTICA
LINHAGEM CELULAR ESPÉCIE APLICAÇÕES
CHO.k1/CHO dhfr Hamster Expressão transiente e estável
BHK-21 Hamster Expressão transiente e estável, produção de
vacinas
HEK-293 Human Expressão transiente e estável, produção de
vírus
Perc.C6 Human Expressão estável, produção de vacinas e
vírus
Vero Monkey Produção de vacinas
COS Monkey Expressão transiente, produção de vírus
LINHAGENS CELULARES MAIS UTILIZADAS NA INDÚSTRIA BIOFARMACÊUTICA
LINHAGEM CELULAR ESPÉCIE APLICAÇÕES
Hibridoma, NSO, SP2/O Mouse Expressão estável, produção de anticorpo
monoclonal
MDCK Dog Expressão estável, produção de vacinas
Sf-9/Sf-21 Insect Produção de proteína recombinante e de
baculovírus
Tn-368/High-FiveTM BTI-TN-5B1-4
Insect Produção de proteínas
Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-016-7388-9
Advances in recombinant antibody manufacturingRenate Kunert & David Reinhart
LINHAGENS CELULARES
1 g/L batelada1–10 g/L batelada alimentada
Publicações PubMed linhagens celulares utilizadas para produção de proteínas
Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-016-7388-9
Advances in recombinant antibody manufacturingRenate Kunert & David Reinhart
CHO: célula hospedeira predominante para produção de proteínas terapêuticas (70%). DUXB1, DG44 e CHOK1 (DHFR +)
Tecnologias de Células Animais
1. Desenvolvimento da Linhagem Celular
• Construção do vetor de expressão e transfecção
Plasmídeo contendo genes da cadeia leve e pesada, genes marcador de seleção* num mesmo casseteCassete para replicação do plasmídeo em bactériaPromotores fortes: CMV (citomegalovírus)Sequência sinal de poliadenilação SV40
* Marcador de Seleção:
Marcadores de seleção metabólicosAntibióticos
Marcador de Seleção Reagente seletivo
Metabólico
Dihidrofolato redutase(DHFR)
Metionina sulfóximine (MSX)
Glutamina sintetase (GS) Metrotrexato (MTX)
Antibiótico
Puromicina acetiltransferase Puromicina
Blasticidina diaminase Blasticidina
Histidinol dehidrogenase Histidinol
Higromicinaq fosfotransferase Higromicina
Gene de resistência a zeomicina
Zeocina
Gene de resistência a bleomicina
Bleomicina
Amiloglicosidefosfotransferase
Neomicina (G418)
CHO
MARCADORES DE SELEÇÃO RECESSIVOS
• DIHIDROFOLATO REDUTASE (DHFR)
CHO deficiente em DHFR (Urlaub & Chasin, 1980): DUKX-B11 E DG44Requer glicina, hipoxantina e timidina para o crescimentoCHO-DHFR deficiente são transfectadas com um gene heterólogode DHFRMeio seletivo com ausência de nucleósídeos: Ham’s F12 sem T e Halfa- meio sem nucleosídeos
AMPLIFICAÇÃO GÊNICA
MTX MTX
Folato Dihidrofolato (FH2)
DHFR DHFRTetrahidrofolato (FH4)
•Amplificação é obtida depois da seleção por aumento da resistência• O DNA amplificado apresenta estabilidade variável• O tamanho e estrutura da unidade amplificada são variáveis e pode mudar com o tempo
• MTX (metotrexato): análogo ao folato, o qual liga ao sítio catalítico de DHFR
AMPLIFICAÇÃO GÊNICA: DHFR/MTX
• Células altamente resistentes a MTX:
Cópias de gene DHFR + cópias do gene heterólogo
Monocamada de células DHFR positiva
Monocamada de células resistentes a 50 nm MTX
Monocamada de células resistentes a 150 nm MTX
Seleção Seleção Seleção
50 nm MTX 150 nm MTX 450 nm MTX
Análise dalinhagemcelular clonal
•Processo no qual o genede interesse é introduzidodentro das célulaseucarióticas por métodosbioquímicos ou físicos;
•Método rápido, simples,requer poucos reagentes,eficiência variada emdiferentes linhagenscelulares;
•Método mais utilizadopara a entrega do DNA.
ENTREGA DE DNA NAS CÉLULAS DE MAMÍFEROS
TRANSFECÇÃO
•Processo mediado por vírus noqual as células alvos sãoinfectadas com vírus carregandoa sequência de interesse clonadaem seu genoma;
•Método mais complicado, requermais etapas e mais tempo;
•Alta eficiência em linhagenspermissíveis, mas baixa emcélulas deficientes em receptorespara o vírus.
INFECÇÃO
Transfecção
Co-precipitação com fosfato de cálcio
Lipofecção com lipídeo catiônico*
Métodos baseados em polimêros PEI/DEAE-Dextran ou dendrímeros
Eletroporação
Microinjeção
Microprojétil mediando a transferência do gene
COPRECIPITAÇÃO COM FOSFATO DE CÁLCIO
DNA + tampão fosfato + CaCl2 precipitado fino
• Baixo custo
•Amplo espectro de células
•Toxicidade variada
•Reprodutibilidade pode ser problemática
•Requer cuidadosa preparação de reagentes (sensível ao pH)
LIPÍDEOS CATIÔNICOS
•Rápido e fácil de executar, resultados reprodutíveis
•Amplo espectro de linhagens celulares
•Alta eficiência e performance de expressão
•Necessidade de otimização para cada linhagem celular
ELETROPORAÇÃO
•Pulsos elétricos curtos de alta voltagem alterando a permeabilidade celular•Possível controlar o número de cópias
• Necessidade de eletroporador
•Pulso e campo elétrico podem ser otimizados
•Alta mortalidade celular
Transfecção
Expressão Transiente
Expressão Transiente
Meio Seletivo
Expressão Estável
Episomal
Dias: 0 1 – 3 3 -14 7 - 14
Seleção Clones Estáveis
EXPRESSÃO DO GENE
PARÂMETROS A CONSIDERAR ANTES DA TRANSFECÇÃO
•Linhagem hospedeira (características de crescimento, transfectabilidade, viabilidade)
•Tipo de expressão: transiente ou estável
•Eficiência do método de transfecção utilizado
•Presença de soro ou antibióticos
•Tamanho da unidade de expressão e qualidade do DNA
•Presença de elementos de controle apropriados no vetor de expressão
•Método de detecção utilizado para medir a expressão do gene
Gene de Interesse
Vetor de Expresssão
Linhagem Hospedeira
Linhagem Celular Recombinante
Otimização do crescimento, metabolismo e produtividade
Seleção do vetor de expressãoEstratégias de clonagem
Método de entrega do DNA
Seleção, clonagem e screening
Condições de cultivo, meio utilizadoEngenharia metabólica
CONSTRUÇÃO DE LINHAGEM CELULAR RECOMBINANTE
Colônias resistentes a drogas
Tripsinização
Placa Mestre
Célula Progenitora
Linhagem celular (um clone)
MÉTODOS DE CLONAGEM
800
600
400
200
0
con
cen
tra
ção
(n
g/m
L)
VARIAÇÃO CLONAL DEVIDO A INTEGRAÇÃO ALEATÓRIA
• Variação no nível de expressão das células transfectadas
•Algumas células não expressam ou expressam proteína recombinante abaixo do nível de detecção
• Poucas células expressam a proteína recombinante acima do nível médio
MÉTODOS DE SCREENING
Permitir a detecção e/ou quantificação de proteína recombinante
Simples, rápido, sensível e confiável
Exemplos:
Western blotELISARIAAtividade biológicaImunoensaioFACS
Screening e seleção de clones com alta produtividade
ELISA: elimina clones com baixa ou nenhuma produção
12-24 clones com alta produção: ampliados
Crescimento celularProdutividade específica por célulaProdutividade volumêtrica (título)
4-6 clones: avaliação em biorreator
Sítio de recombinação FRT ou loxP
Transfecção na linhagem celular produtora
Integração randômica no genoma(recombinação não homóloga ou ilegítima
Screening e seleção de clones exibindo:alta expressão gênica de uma única cópia integrada
Loci com alta atividade transcripcional
Marcador
Marcador
GERAÇÃO DE CLONES COM EXPRESSÃO ISOGÊNICA
1. Geração de linhagens celulares estáveis altamente produtoras
GFPX
Recombinação dirigida
pRec+
pX-RS
Clones Isogênicos
700
600
400
200
0X c
on
c. (
ng
/mL
)
RMCE (Recombinase mediando a troca de cassete)
Parâmetros afetando a qualidade do bioprocesso e do produto
Bioprocesso
Fig. 2 Typical cell and product concentrations achieved due to process improvements in the past three decades
MELHORAMENTO DE PROCESSO
BIORREATORES – CISALHAMENTO
BIORREATORES – VALIDAÇÃOSINGLE USE BIOREACTOR - SUB
LIBBS
2012: 5% prescrições Sistema Único de Saúde (SUS) 43% dos custos de medicamentos (Guia 2013).
anticorpos utilizados para o tratamento de artrite reumatoidecusto :US$ 10.000 e US$ 30.000 por ano
NO BRASIL
Biossimilares – Uma alternativa viável
PATENTES EXPIRANDO
• 2008 o governo formulou uma política industrial denominada Política para o Desenvolvimento Produtivo (PDP),
• Parcerias para o Desenvolvimento Produtivo – que são Parcerias Público Privadas (PPP) (Sundfeld & Souza 2013).
• PDP criar a indústria de biotecnologia médica no Brasil por meio dos biossimilares
Parcerias Público Privadas _ Política Desenvolvimento Produtivo
MOTIVAÇÃO
As Parcerias para o Desenvolvimento Produtivo envolvem basicamente três atores:
a) laboratório público;b) laboratório farmacêutico privado (nacional ou
estrangeiro instalado no país) ec) produtor de insumos biotecnológico ou de rota
química nacional (transferência de tecnologia de uma empresa estrangeira)
PDPs
ABBVIE INC.ALEXION PHARMACEUTICALS INC
AMGEN INC.ASTRAZENECA PLC.BIOGEN INC.BRISTOL-MYERS SQUIBB COELI LILLY AND CO.FRESENIUS KABI USAGENMAB A/SGILEAD INC.GLAXOSMITHKLINEF. HOFFMANN-LA ROCHE LTD.JOHNSON & JOHNSON INC.MERCK & CO. INC.MERCK KGAANOVARTIS AGPFIZER INC.SANOFI INC.SEATTLE GENETICS INC.SPECTRUM PHARMACEUTICALS INC.TAKEDA PHARMACEUTICAL U.S.A., INC.UCB
Indústrias Internacionais de Biotecnologia e Farmacêuticaem P&D anticorpos monoclonais
•2009 – 2013 = 104 termos de compromisso, dos quais 28 em biossimilares.
• Bionovis tem como sócios: Aché, EMS, Hypermarcas e União Química.
• Orygen: Eurofarma, Cristália, Libbs e Biolab.
•Cristália e a Libbs, que continuaram a desenvolver projetos próprios de biossimilares, porém ainda vinculadas às PDPs
PDPs
PDPs - Biossimilares
Portfólio de biossimilares da Libbs farmacêutica:
– trastuzumabe: tratamento de câncer de mama metastático, câncer de mama inicial e câncer gástrico avançado.
– rituximabe: indicado no tratamento de linfoma não Hodgkin, Linfoma Folicular, artrite reumatoide, leucemia linfoide crônica e outras doenças autoimunes.
– bevacizumabe: tratamento de câncer colorretal metastático, câncer de pulmão de células não pequenas localmente avançado, metastático ou recorrente, câncer de mama metastático ou localmente recorrente, câncer de células renais metastático e/ou avançado.
– etanercepte: indicado para tratar artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, espondilite anquilosante, artrite psoriática e psoríase crônica.
– adalimumabe: tratamento de artrite reumatoides, artrite psoriática, espondiliteanquilosante, doença de Crohn, psoríase em placas e artrite psioriática juvenil poliarticular.
APLICAÇÃO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS
MICROFLUÍDICA
DIAGNÓSTICO PRECOCES
BIÓPSIA LÍQUIDA
Cell Physiol Biochem 2017;41:755-768
TENDÊNCIA
SUSBSTITUIÇÃO TESTES EM ANIMAIS
Human-on-a-chip
OBRIGADA
PATRICIA LÉ[email protected]