DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA DE SUBUNIDADE … · rÚbens prince dos santos alves desenvolvimento...
69
RÚBENS PRINCE DOS SANTOS ALVES DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA DE SUBUNIDADE CONTRA O SOROTIPO 2 DO VÍRUS DENGUE BASEADA NA PROTEÍNA NÃO ESTRUTURAL 5 (NS5). Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências. São Paulo 2015
Transcript of DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA DE SUBUNIDADE … · rÚbens prince dos santos alves desenvolvimento...
RÚBENS PRINCE DOS SANTOS ALVES
DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA DE SUBUNIDADE CONTRA
O SOROTIPO 2 DO VÍRUS DENGUE BASEADA NA PROTEÍNA NÃO
ESTRUTURAL 5 (NS5).
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Microbiologia do
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para obtenção
do título de Mestre em Ciências.
São Paulo
2015
RÚBENS PRINCE DOS SANTOS ALVES
DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA DE SUBUNIDADE CONTRA
O SOROTIPO 2 DO VÍRUS DENGUE BASEADA NA PROTEÍNA NÃO
ESTRUTURAL 5 (NS5).
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Microbiologia do
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para obtenção
do título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Microbiologia
Orientador: Prof. Dr. Luís Carlos de Souza
Ferreira
Versão original
São Paulo
2015
PROTOCOLO CEUA
AGRADECIMENTOS
As primícias dos meus agradecimentos são dados a Deus, por me instruir, guiar e iluminar meu
trajeto. Obrigado pela sabedoria, pela vida, pela força de vontade de continuar caminhando, e
pela fé eu te agradeço por todas as coisas que o Senhor ainda me capacitará a desempenhar.
Ao Prof. Dr. Luís Carlos, pelo apoio dado em todo o desenvolvimento deste trabalho, pela
confiança, pelo exemplo de dedicação e o incentivo constante a busca da excelência.
Ao Dr. Jaime Amorim, meu amigo, conselheiro e parceiro, por todo empenho em me instruir,
desde quando cheguei ao grupo dengue. Obrigado por ser um exemplo de dedicação e liderança.
À Profa. Rita Ferreira, pelo carinho, apoio, concelhos, conversas e pelo bom humor em todas
as situações.
Á Profa. Beth Sbrógio e ao Prof. Sérgio Olávo, pelo exemplo, pela experiência compartilhada
e pelos concelhos sábios.
Ao grupo dengue, pela união, força de vontade e competência. Todos vocês foram de grande
importância no desenvolvimento desse trabalho, o considero fruto do nosso esforço coletivo,
obrigado por tudo.
A todos os atuais membros do LDV, em especial à minha “turma de mestrado”: Ewerton
Ferreira, Natiely Silva, Mari Cintra e Raíza Bizerra, parece que foi ontem quando tudo
começou. Obrigado pela amizade e carinho, amo todos vocês.
Aos antigos membros do LDV, Renata Damásio, Naína Garcia, Camila Santos, Wilson Barros,
Debora Costa, Roberto Neponuceno, Aislane, Giuliana, que de diferentes formas ajudaram,
compartilhando experiências e questionamentos.
Ao Eduardo Gimenes, por todo suporte em todos os tramites complicados e burocráticos que a
pesquisa envolveu, pelo seu empenho, dedicação exemplar e pelos cafés na copa.
À Loren, Lilian e Carol, por todo o apoio técnico prestado, o que facilitou muito o
desenvolvimento do presente trabalho.
Aos funcionários dos Biotérios da Parasitologia e Microbiologia, fundamentais para realização
de grande parte desse trabalho.
Aos meus pais, Florisvaldo Vianna e Norma Alves, pelo incentivo constante à evolução e ao
crescimento desde que era pequenino. Pelo apoio, zelo, confiança e amor, que me fazem o filho
mais orgulhoso do pai e da mãe que têm. Pelos muitos esforços feitos para apoiar meus sonhos,
mesmo que as vezes isso custassem os seus próprios, obrigado por sempre serem o melhor
exemplo para mim, amo vocês.
Aos meus irmãos Normando e Brenda, pelo carinho, compreensão, apoio orações e o aconchego
de poder ir pra casa e encontrar vocês, obrigado por nunca me deixarem esquecer ao lugar a
onde eu pertenço, amo os dois.
À toda minha família, em especial a tia Vanuza e o tio Cézar e seus filhos que são meus irmãos
de coração. Não tenho palavras para agradecer o apoio que vocês me deram logo que cheguei
aqui, o que vocês fizeram para mim não tem preço, obrigado por todo apoio e carinho.
À Carol Nogueira, por ser a melhor namorada do mundo, pela compreensão, amor,
companheirismo, por sempre me apoiar, e me ajudar a ser melhor sempre. Obrigado por tudo,
te amo.
Aos meus amigos Leandro Brito, Daielle Bernardino, Monara Guimarães, Murilo Damasceno,
Laís Carolina, Kaio Teixeira, Paula Frontier, Renata Cruz, Hélic Passos, Dalva Adelina, Lennon
Pereira e todos os outros, pelo apoio e companheirismos, amo a todos.
Ao grupo SulFiato do coral USP, que me acolheram e me deram um escape da vida corrida e
complicada de cientista, me possibilitando momentos inesquecíveis de cantoria e alegria.
À minha regente, professora de piano e amiga Paula Crhistina Monteiro, pela paciência em me
ensinar, e por às vezes, ouvir meus desabafos nas aulas.
Aos meus amigos e amigas do Los Bullangueros de azul, vocês fizeram meus dias mais legais
e divertidos, esse ano tem mais.
Aos meus amigos e irmãos da Igreja Adventista do Sétimo dia do Jaguaré, aos amigos do GEA
e da Comunidade Adventista de Jovens Universitários (CAJU), pelas orações, amizades e pela
parceria.
Ao apoio financeiro da FAPESP que permitiu a realização e divulgação deste trabalho.
“Follow the path of the unsafe, independent thinker.
Expose your ideas to the dangers of controversy.
Speak your mind and fear less the label of 'crackpot'
than the stigma of conformity. And on issues that
seem important to you, stand up and be counted at
any cost. ”
Thomas J. Watson Jr.
RESUMO
ALVES, R. P. S. Desenvolvimento de uma vacina de subunidade contra o sorotipo 2 do
vírus dengue baseada na proteína não estrutural 5 (NS5). 2015. 69 f. Dissertação de
(Mestrado em Microbiologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo,
São Paulo, 2015.
A dengue é uma doença causada por quatro sorotipos do vírus da dengue (DENV 1-4), com
milhões de pessoas afetadas em todo o mundo e um número significativo de mortes. Não há
nenhum tratamento eficaz ou abordagens vacinais capazes de prevenir a infecção. As estratégias
vacinais contra a dengue baseadas em proteínas não estruturais como antígenos têm
demonstrado serem mais seguras do que as baseadas em proteínas estruturais. Além disso,
respostas imunes celulares direcionadas a proteínas não estruturais desempenham um papel
importante no controle da replicação viral. A proteína não estrutural 5 (NS5) do vírus dengue é
a proteína mais conservada entre os quatro sorotipos e desempenha um papel crucial na
replicação viral. Neste estudo, foi gerada uma forma recombinante da NS5 expressa em E. coli
em quantidades elevadas e com propriedades antigênicas preservados em relação à proteína
nativa. As condições de cultura foram optimizadas, a fim de permitir a expressão dessa proteína
na forma solúvel. A imunização de camundongos Balb/c com a NS5 sozinha ou em combinação
com um adjuvante (poli (I:C)) promoveu o aumento da sobrevida de camundongos imunizados
após desafio intracraniano com a linhagem JHA1 de DENV2. A combinação da NS5 com poli
(I:C) emulsionado em Montanide 720 induziu a expansão de linfócitos T CD8+ específicos. Em
conjunto, os resultados indicam que a proteína recombinante NS5 preserva determinantes
antigênicos da proteína nativa e pode ser uma ferramenta útil para estudos sobre a biologia do
DENV, busca de drogas anti-viriais e desenvolvimento de vacinas.
.
Palavras-chave: Dengue. Vírus dengue. NS5. Vacinas. Adjuvantes imunológicos.
ABSTRACT
ALVES, R. P. S. Development of a subunit vaccine against dengue virus serotype 2 based
on the non-structural protein 5 (NS5). 2015. 69 p. Master thesis (Microbiology) – Instituto
de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.
Dengue fever is a disease caused by four dengue virus serotypes (DENV 1-4), affecting millions
of people worldwide and causing a significant number of deaths. There are no effective
treatments or vaccine approaches capable of preventing such infection. Anti-DENV vaccine
strategies based on nonstructural proteins as antigens have been shown to be safer than those
based on structural proteins. In addition, anti-DENV cellular immune responses against
nonstructural proteins have shown to play a major role in controlling viral replication. The
DENV nonstructural protein 5 (NS5), the most conserved protein among the four serotypes,
plays a crucial role in viral replication. In this study, we generated a recombinant form of
DENV2 NS5 expressed in E. coli in high amounts and with preserved antigenic properties with
regard to the native protein. Culture conditions were optimized in order to allow expression of
NS5 as a soluble protein. The immunization of Balb/c mice using this protein alone or in
combination with poly (I:C) led to increased survival after intracranial challenge with the
DENV2 JHA1 strain. The combination of the protein with poly (I:C) emulsified in Montanide
720 led to the activation of NS5-specific CD8+ T lymphocytes. Altogether, the results indicate
that the recombinant NS5 protein preserves antigenic determinants of the native protein and
may be a useful tool for studies dealing with the DENV's biology, search for anti-viral drugs
and vaccine development.
Keywords: Dengue fever. Dengue virus. NS5. Vaccines. Immunologic adjuvants.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Representação esquemática do genoma do vírus dengue. ....................................... 19
Figura 2 - Etapas do processo de replicação do DENV. .......................................................... 20
Figura 3 - Modelo do aumento da infecção do vírus dengue mediada por anticorpo. ............. 22
Figura 4 - Amplificação da sequência codificadora da NS5. ................................................... 35
Figura 5 - Construção do plasmídeo pGEM_NS5. ................................................................... 36
Figura 6 - Construção do plasmídeo pETNS5. ......................................................................... 37
Figura 7 - Teste de expressão da NS5 recombinante pela linhagem de E. coli BL21-DE3-RIL.
.................................................................................................................................................. 37
Figura 8 - Construção do pETNS5 a partir de um gene sintético. ............................................ 38
Figura 9 - Teste de expressão da NS5 recombinante em E.coli BL21-DE3-RIL em diferentes
condições de indução. ............................................................................................................... 39
Figura 10 - Purificação da NS5 recombinante por cromatografia de afinidade seguida de gel
filtração. .................................................................................................................................... 41
Figura 11 - Análise de antigenicidade da NS5 recombinante. ................................................. 42
Figura 12 - Avaliação da resposta humoral gerada em camundongos imunizados com NS5
recombinante. ........................................................................................................................... 43
Figura 13 - Análise da produção de INF-γ e TNF-α em células de baço de animais imunizados
com a NS5. ............................................................................................................................... 44
Figura 14 - Avaliação do efeito protetor gerado pela imunização com a proteína NS5 frente ao
modelo de encefalite induzida por DENV-2. ........................................................................... 44
Figura 15 - Representação esquemática do regime vacinal empregado. .................................. 45
Figura 16 - Avaliação da resposta humoral gerada pelas formulações vacinais. ..................... 46
Figura 17 - Indução de ativação de linfócitos T CD8+ NS5-específicos. ................................ 47
Figura 18 - Proteção conferida aos camundongos imunizados com as vacinas baseadas em
NS5 contra encefalite induzida pelo DENV-2. ........................................................................ 48
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Diferentes tipos de candidatos vacinais contra a dengue e seus desenvolvedores. . 23
Tabela 2 - Peptídeos da NS5 restritos ao MHC classe I e II sintetizados e seus respectivos
alótipos...................................................................................................................................... 33
Tabela 3 - Rendimento de purificação da NS5 recombinante. ................................................. 42
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% - porcentagem
(-) ssRNA - RNA de simples fita com orientação negativa
(+) ssRNA - RNA de fita simples com orientação positiva
°C - graus celcius
AcK - Acetato de potássio
ADE - do inglês Antibody Dependent Enhancement
ANOVA - análise de variância
APC’s - células apresentadoras de antígenos
ATP - trifosfato de adenosina
BCA - Ensaio ácido bicinconínico
C - proteína do capsídeo
CTL - linfócito T citotóxico
DENV - virus Dengue
DENV-1 - sorotipo 1 do vírus dengue
DENV-2 - sorotipo 2 do vírus dengue
DENV-3 - sorottipo 3 do vírus denfue
DENV-4 - sorotipo 4 do vírus dengue
DL50 - dose letal para 50%
DNA - ácido desoxiribonucléico
DO600nm - densidade ótica linda a 600 nanômetros
dsRNA - RNA com dupla fita
E - proteína do envelope
EIII - domínio 3 da glipoproteína do envelope
ELISA - Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima)
EU - unidades de endotoxina
FcyR - receptor da porção gama da imunoglobulina
FHD - febre hemorrágica da dengue
FSC-A - foward scatter-area (área de disperção frontal)
FSC-H - foward scatter-height (altura de dispersão frontal)
g - força centrífuga relativa
h - hora
HCV - virus da hepatite C
ICS - intracellular cytokine staining (marcação intracelular de citocina)
IFN-γ - interferon do tipo gama
IgG - imunoglobulina G
IgG1 - subclasse 1 da imunoglobulina G
IgG2a - subclasse 2a da imunoglobulina G
IPTG - isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Kam - canamicina
kb - kilobase
kDa - kilodaltons
LB - Luria Bertani Broth
LPS - lipopolisacarídeo
M - molar, 26;
M - proteína da membrana
m/v - relação massa/volume
M720 - 10μg de NS5 e 50μg de poli (i; c) emulcionado em montanide 720
MHC - complexo principal de histocompatibilidade
min - minuto
ml - mililitro
mM - milimolar
MWCO - massa molecular de corte
ng - nanograma
NLS - do inglês Nuclear Localization Sequence (sequencia de localização nuclear)
nm - nanômetros
NS1 - proteína não estrutural 1
NS2a - proteína não estrutural 2a
NS2b - proteína não estrutural 2b
NS3 - proteína não estrutural 3
NS3H - domínio helicase da NS3
NS4a - proteína não estrutural 4a
NS4b - proteína não estrutural 4b
NS5 - proteína não estrutural 5
O.N - over night
o/w - óleo-em-água
OPD - o-Phenylenediamine
p/v - relação peso/volume
PAGE - polyacrylamide gel electrophoresis (eletroforese em gel de poliacrilamida)
pb - pares de bases
PBS - tampão salina fosfato
PBST - tampão salina fosfato tween
pH - potencial hidrogeniônico
PMSF - phenylmethylsulfonyl fluoride
Poli (i: c) - formulação vacinal contendo 10μg de NS5 e 50μg de poli (i; c)
poli(I:C) - o adjuvante ácido polinosinico-policitidilico
prM - proteína prercusora da membrana
psi - libra por polegada quadrada
RER - retículo endoplasmático rugoso
RNA - ácido ribonucléico
rpm - rotações por minuto
SCD - síndrome de choque da dengue
SDS - sodium dodecyl sulfate (dodecil sulfato de sódio)
SNC - sistema nervos central
SSC-A - side scatter-area (área de disperção lateral)
TCR - T Cell Receptor (receptor de célula T)
Th - T helper
TLR - receptor do tipo toll
TNF-α - fator de necrose tumoral do tipo alfa
UTR - do inglês Untranslated Region
VLP - do inglês virus-like particles (particulas tipo vírus)
w/o - água-em-óleo
μg - micrograma
μl - microlitro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 19
1.1 O vírus e a doença .................................................................................................................... 19
1.2 O desenvolvimento de vacinas contra a dengue ..................................................................... 21
1.3 Os adjuvantes vacinais ............................................................................................................. 25
2 OBJETIVO ............................................................................................................................... 27
2.1 Objetivo geral ........................................................................................................................... 27
2.2 Objetivos específicos ................................................................................................................ 27
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................... 28
3.1 Construção do plasmídeo pGEM_NS5 ................................................................................... 28
3.2 Transformação de E. coli DH5α quimiocompetente .............................................................. 28
3.3 Subclonagem da sequência da NS5 em pET28a a partir de gene sintético .......................... 29
3.4 Análise da expressão da proteína recombinante NS5 ............................................................ 29
3.5 Procedimentos para a purificação da NS5 recombinante ..................................................... 30
3.6 Ensaios de imunodetecção ....................................................................................................... 31
3.6.1 Teste de antigenicidade .............................................................................................................. 31
3.6.2 Titulação de anticorpos anti-NS5............................................................................................... 31
3.6.3 Ensaio de detecção por Western blot ......................................................................................... 31
3.7 Ensaio de imunização ............................................................................................................... 32
3.8 Detecção de células produtoras de IFN-γ e TNF-α por ELISPOT ....................................... 32
3.9 Ensaio de marcação Intracelular de IFN-γ em linfócitos T CD8+ ........................................ 33
3.10 Ética no uso de animais............................................................................................................ 33
3.11 Análises estatísticas .................................................................................................................. 34
4 RESULTADOS ........................................................................................................................ 35
4.1 Clonagem da sequência codificadora da NS5 em pGEM®-T Easy ..................................... 35
4.2 Subclonagem da sequência do pGEM_NS5 em pET28a ....................................................... 35
4.3 Teste de expressão do da NS5 .................................................................................................. 36
4.4 Subclonagem da sequência da NS5 para o vetor pET28a ..................................................... 37
4.5 Teste de expressão na Linhagem de E. coli BL21-DE3-RIL ................................................. 38
4.6 Purificação da NS5 recombinante ........................................................................................... 40
4.7 Avaliação da antigenicidade da NS5 obtida ........................................................................... 40
4.8 Avaliação da imunogenicidade e capacidade protetora da NS5 ........................................... 43
4.9 Avaliação da imunogenicidade de formulações vacinais baseadas em NS5 ......................... 44
4.10 Avaliação da capacidade protetora gerada pelas formulações ............................................. 48
5 DISCUSSÃO............................................................................................................................. 49
6 CONCLUSÕES ........................................................................................................................ 55
REFERÊNCIAS ................................................................................................................................. 56
19
1 INTRODUÇÃO
1.1 O vírus e a doença
A febre da dengue é uma doença de caráter agudo, causada pelo virus Dengue (DENV),
um arbovírus componente do gênero Flavivirus pertencente à família Flaviviridae transmitido
por mosquitos do gênero Aedes (BHATT et al., 2013; GUZMAN et al., 2010). No ciclo urbano,
o DENV circula na forma de quatro tipos imunologicamente distinguíveis (sorotipos): DENV-
1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4, que apresentam aproximadamente 30% de divergência na
sequência de nucleotídeos dos seus genomas (BLOK, 1985; CHAN et al., 1965; DIERCKS,
1959; MYERS et al., 1964; SMITH, 1956). A infecção por um deles confere resposta
imunológica protetora permanente contra o mesmo sorotipo e de curta duração contra os outros
sorotipos (GUZMAN et al., 2010; GUZMAN; HARRIS, 2014; SABIN, 1952; WHITEHEAD
et al., 2007).
Figura 1. Representação esquemática do genoma do vírus dengue. O genoma do vírus dengue é
composto por um RNA de fita simples com orientação positiva e possui aproximadamente 11 kB que
codifica 10 proteínas maduras, três estruturais: Capsídeo (C), Membrana (M) e Envelope (E) e sete
proteínas não estruturais (NS): NS1, NS2 A e B, NS3, NS4 A e B e NS5. Há duas regiões não traduzíveis
em ambas as extremidades da fita de RNA chamadas de UTR (do inglês Untranslated Region). Fonte:
Guzman, et al., 2010.
O DENV possui RNA genômico com aproximadamente 11 kb de fita simples com
orientação positiva flanqueada por duas UTR’s (do inglês Untranslated Region). Na
extremidade 5’ há uma estrutura de CAP tipo I (N7meGpppA2’Ome), responsável pela
iniciação da replicação em células eucarióticas e proteção contra RNA exonucleases
(HENDERSON et al., 2011; ZHOU et al., 2007). Outras estruturas conservadas na UTR da
extremidade 5’ é o large e short stem loop (SLA e SLB, respectivamente), sendo que a SLA
age como promotor da replicação sendo crucial na síntese do RNA viral, e a SLB medeia a
interação das extremidades 5’ com a 3’, induzindo a ciclização do RNA, situação fundamental
para replicação viral (YAP et al., 2007). Eletromicrografias demonstram que o vírion é esférico,
possuindo diâmetro de aproximadamente 500 Å, apresentando um núcleo eletrondenso
circundado por uma bicamada lipídica (KUHN et al., 2002). O genoma viral (figura 1) codifica
20
três proteínas estruturais: do capsídeo (C), do envelope (E), e a proteína precursora de
membrana (prM), a qual sofre clivagem e origina a proteína de membrana (M); e sete proteínas
não-estruturais que são: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5 (RODENHUIS-ZYBERT
et al., 2010). Quando o mosquito transfere o vírus para o homem, ocorrem as etapas do processo
infeccioso e replicação viral (figura 2). Durante a infecção natural, as principais células-alvo de
infecção pelo vírus dengue são monócitos, macrófagos e células dendríticas (HALSTEAD et
al., 1980).
Figura 2. Etapas do processo de replicação do DENV. A primeira etapa no processo de infecção do
DENV é a ligação (1) ao receptor viral, seguido de endocitose mediada por receptor (2). O pH no interior
do endossomo é reduzido à medida que se aproxima do centro celular, o que induz a fusão da membrana
do vírus com a do endossomo (3), permitindo a liberação do RNA no citoplasma da célula (4). Em
seguida, a poli proteína viral é traduzida e maturada, e o RNA replicado pelo complexo de replicação
(5), resultando finalmente na morfogênese de novas partículas virais e liberação dessas partículas no
meio extracelular. RER: retículo endoplasmático rugoso; (+) ssRNA: RNA de fita simples com
orientação positiva; (-) ssRNA: RNA de fita simples com orientação negativa. Fonte: Amorim; Alves;
Ferreira, 2009.
O início do ciclo infeccioso do DENV depende, principalmente, da interação entre a
glicoproteína de envelope (E) e o receptor de membrana da célula alvo (BIELEFELDT-
OHMANN et al., 2001; CHEN, Y. et al., 1997; CRILL; ROEHRIG, 2001). Após a ligação, o
vírion é endocitado e dentro do endossomo tardio, com a redução do pH, há indução de
mudanças conformacionais da proteína E (ZHANG et al., 2015), o que consequentemente
proporciona a fusão do envelope viral com a membrana do endossomo e liberação do capsídeo
para o citoplasma celular (RODENHUIS-ZYBERT et al., 2010). Posteriormente, há
dissociação do capsídeo, liberação do RNA no citoplasma celular, tradução da poliproteína
viral, que é processada por um conjunto de proteases virais e celulares, dando origem ás
proteínas supracitadas na forma madura. A replicação do material genético é realizada pelo
domínio RNA-polimerase-RNA-dependente (RpRd) da NS5, porém, o processo como um todo
21
depende do domínio MTAse da NS5, que juntamente com a NS3, participam da síntese do CAP
tipo I na porção 5’ da fita de RNA e desenovelamento do dsRNA (ACKERMANN; LUO et al.,
2008b; PADMANABHAN, 2001). Por fim, há morfogênese viral e liberação de novas
partículas infectantes (KUHN et al., 2002).
A infecção pelo DENV, após 4-8 dias de incubação, pode ser assintomática ou com
sintomatologia de caráter subclínico. No entanto, a doença se manifesta abruptamente em três
fase: febril, crítica e de recuperação. A fase crítica se inicia após a febre e o quadro patológico
que pode se manifestar por sinais como: dores de cabeça, mialgia, artralgia, vômitos e dor
abdominal aguda, bem como, o aumento da permeabilidade vascular, que podem gerar desde
raches cutâneos a choque hipovolêmico, coagulação intravascular disseminada e hemorragia
grave (GUZMAN; HARRIS, 2014; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009). Devido ao
amplo espectro de sinais e sintomas que podem ser desenvolvidos na dengue, a organização
mundial de saúde (WHO, 2009), substituiu os termos febre hemorrágica da dengue (FHD) e
síndrome de Choque da dengue (SCD), pela classificação de dengue com sinais de alerta e
dengue com sinais de gravidades (WHO, 2009). Essa nova recomendação de classificação
possibilitou que a triagem em áreas endêmicas fosse melhorada, visto que, instituiu o uso de
outros sinais clínicos como indicativo de suspeita de dengue. Além disso, a decisão clínica para
o tratamento da dengue com sinais de gravidade se tornou mais rápida, visto que o
extravasamento de plasma deixou de ser uma característica sine qua non de dengue grave, de
modo que o início precoce de tratamento em dengue com sinais de gravidade reduz o risco de
morte de 20% para 1% (HORSTICK et al., 2012; SRIKIATKHACHORN et al., 2011).
Estudos recentes mostram que 96 milhões de casos anuais podem ter sintomas com
severidade suficiente para alterar a rotina do indivíduo infectado (BHATT et al., 2013) e
segundo estudos anteriores, cerca de 500 mil casos evoluem para forma grave. A taxa de
mortalidade nestes grupos chega a 10% (50 mil) em indivíduos hospitalizados e 30% (150 mil)
em indivíduos não hospitalizados (BARRETO; TEIXEIRA, 2008; GUZMAN et al., 2010
PONGSUMPUN et al., 2008; WHITEHEAD et al., 2007). Estas informações deixam clara a
urgente necessidade de desenvolvimento de uma vacina para controle desta doença.
1.2 O desenvolvimento de vacinas contra a dengue
Diversas estratégias têm sido exploradas para produzir uma vacina efetiva na prevenção
da dengue. No entanto, o desenvolvimento de uma vacina eficaz tem como principais limitações
a necessidade e a dificuldade de se produzir uma vacina tetravalente eficiente e segura. Essa
característica é um fator crucial no desenvolvimento dessa vacina, visto o grande número de
22
evidencias experimentais e epidemiológicas que indicam que numa infecção secundária por um
sorotipo diferente da primeira infecção, a replicação viral seria exacerbada pela facilitação de
infecção de células imunológicas por uma via dependente de anticorpos sub-neutralizantes
gerados durante a primeira infecção (figura 3). Este processo denominado ADE (do inglês
Antibody Dependent Enhancement) proporciona o aumento da carga viral e intensifica a
resposta inflamatória, sendo associado também ao desenvolvimento das formas de dengue com
sinais de gravidade (HALSTEAD et al., 1977, 1980; HALSTEAD; O’ROURKE, 1977;
HALSTEAD, 1979). Logo, vacinas monovalentes oferecem riscos quanto à segurança frente a
infecções por DENV diferente do sorotipos vacinal.
Figura 3. Modelo do aumento da infecção do vírus dengue mediada por anticorpo. Esse fenômeno ocorre
quando anticorpos heterotípicos, formados durante uma infecção primaria com o DENV, ligam-se à
partícula viral de outro sorotipo de DENV numa infecção subsequente. Os anticorpos da infecção
primária não podem neutralizar o vírus eficazmente. Em vez disso, o complexo anticorpo-vírus se liga
aos receptores chamados receptores Fcγ (FcγR) em monócitos circulantes. Os anticorpos ajudam o vírus
infectar estas células de forma mais eficiente resultando num aumento global da carga viral. Adaptado
de Whitehead, et al., 2007.
Estratégias vacinais variadas foram desenvolvidas para o controle da dengue (tabela 1).
A utilização de partículas virais atenuadas fez parte dos primeiros esforços no desenvolvimento
da vacina, entretanto, a possibilidade de indução de uma resposta imunológica desequilibrada
contra os quatro sorotipos virais e o risco de reversão das cepas vacinais atenuadas de DENV
para as formas virulentas e o risco claro de ADE são preocupações significativas
(WHITEHEAD et al., 2007). As abordagens utilizando vírus quimérico vivo são as estratégias
vacinais mais aprimoradas atualmente. Entretanto, os resultados de um teste clínico recente
demonstraram a geração de proteção parcial não equilibrada entre os sorotipos e a compreensão
de que a soroconverção não é isoladamente um correlato de proteção (DURBIN et al., 2013;
GUZMAN; HARRIS, 2014; MLADINICH et al., 2012; WEISKOPF et al., 2014).
23
Tabela 1. Diferentes tipos de candidatos vacinais contra a dengue e seus desenvolvedores.
Diversos grupos empenham-se no desenvolvimento de abordagens baseadas nas vacinas
de DNA (COSTA; FREIRE; ALVES, 2006; COSTA et al., 2007, 2011; WU et al., 2003a),
porém, os riscos de geração de autoimunidade bem como a geração de tolerância ao antígeno
continuam sendo os principais riscos associados a esse tipo de abordagem (KLINMAN et al.,
2000). Já as vacinas de subunidade, embora, por definição, necessitem de adjuvantes para
desencadear efeito protetor, induzem respostas imunológicas consideráveis e fornecem
flexibilidade quanto às vias de administração (AMORIM et al., 2012; PANG, 2003). Portanto,
as vacinas de subunidade, como as usadas neste trabalho, são mais seguras e de mais fácil
aprovação quando comparadas às vacinas de DNA e com o vírus.
Tipo de Candidato Vacinal Referências
1.Virus vivo atenuado
1.1 Vírus atenuado por cultura de células (BHAMARAPRAVATI; YOKSAN,
1989; VAUGHN et al., 1996;
KANESA-THASAN et al., 2003;
SANCHEZ et al., 2006)
1.2 Vírus atenuado por mutagênese (MEN et al., 1996; DURBIN et al.,
2001; TROYER et al., 2001;
WHITEHEAD; FALGOUT; et al.,
2003)
2. Vírus quimérico
2.1 Vírus quimérico com Vírus da febre amarela (CAPEDING et al., 2011; GUY;
SAVILLE; LANG, 2010; GUY et
al., 2011; MORRISON et al., 2010)
2.2 Vírus dengue inter-sorotipo (BLANEY et al., 2004, 2008;BRAY;
LAI, 1991; OSORIO et al., 2011;
WHITEHEAD et al., 2003b)
3. Vírus inteiro inativado e purificado (PUTNAK et al., 1996; SIMMONS
et al., 2010)
4. Vacinas de subunidade (CHIANG et al., 2011 CLEMENTS
et al., 2010; GUZMÁN et al., 2003;
KELLY et al., 2000)
5. Vacinas de DNA (APT et al., 2006; BECKETT et al.,
2011; DANKO; BECKETT;
PORTER, 2011; RAVIPRAKASH et
al., 2006)
6. Vetores virais expressando antígenos da dengue (BRANDLER et al., 2007;
HOLMAN et al., 2007; RAJA et al.,
2007; RAVIPRAKASH et al., 2008;
WHITE et al., 2007;)
7. VLP (ARORA et al., 2013; MANI et al.,
2013; TANG et al., 2012;)
24
As proteínas não estruturais são interessantes como antígenos alvos para uma vacina,
visto o alto grau de conservação entre os sorotipos, a grande imunogenicidade das mesmas, e o
risco nulo de indução de ADE, visto que essas proteínas não compões o vírion. As principais
proteínas não estruturais do DENV são: NS1, NS3 e NS5. A NS1 é uma glicoproteína de 46-
55 kDa, que pode ser associada à membrana citoplasmática, ou ainda, ser secretada para o meio
extracelular e apesar de sua função biológica não ter sido totalmente elucidada, sabe-se que é
altamente imunogênica (AVIRUTNAN et al., 2007a, 2011b; GAO et al., 2008). Dentro dos 26
anos desde o primeiro relato da NS1 em uma formulação vacinal, diversos trabalhos
demonstram a capacidade dessa proteína em gerar proteção em modelo murino (AMORIM et
al., 2012a; FALGOUT et al., 1990; HENRIQUES et al., 2013; WU et al., 2003b; ZHANG et
al., 1988). É válido ressaltar que há algumas evidencias in vitro e in vivo que em condições
altamente inflamatórias, a NS1 pode estar envolvida em fenômenos de autoimunidade, o que
torna questionável o uso dessa proteína em formulações vacinais (AMORIM et al., 2014;
AVIRUTNAN et al., 2007b, 2011a; MLADINICH et al., 2012).
A NS3 tem massa molecular de aproximadamente 70 kDa apresentando um domínio
serino-protease (~18kDa) na região N-terminal e helicase (~ 52 kDa) na região C-terminal
(LESCAR et al., 2008). A sua função biológica é vital para o ciclo viral, visto que há atuação
tanto na clivagem da poli proteína resultante da tradução do RNA viral, bem como na função
helicase que em conjunto com a NS5 promovem a replicação viral, sendo portanto, primordiais
na biologia do patógeno (LUO; XU; HUNKE; et al., 2008). A NS3H se estende entre os
aminoácidos 169-618, apresenta um sítio ATPase e por ser solúvel (diferente do domínio
protease da NS3 e da proteína inteira) pode ser mais facilmente obtida (COSTA et al., 2011).
Um fato relevante é que a NS3H conserva epítopos capazes de gerar uma resposta celular
citotóxica (SPAULDING et al., 1999a) como foi visto no uso de linhagens vacinais de
Salmonella Typhimurium como vetor para plasmídeos que continham um epítopo CTL
específico presente na NS3H que se estendia entre os aminoácidos 298 e 306.
A NS5 do DENV é uma proteína de aproximadamente 109 kDa que apresenta no
mínimo dois domínios: os resíduos de 1 a 368 da região N-terminal que compõem a 2’-O-
metiltransferase, e os resíduos de 405 a 900 que compõem uma RNA polimerase dependente
de RNA (BHATTACHARYA et al., 2009). A região inter-domínios possui duas NLS (do inglês
Nuclear Localization Sequence) bem caracterizadas que direcionam a proteína para o núcleo
(TAY et al., 2013; FRASER et al., 2014a). Ela é processada pela via de proteassoma, quando
então são produzidos e apresentados os epítopos específicos para linfócitos T, os quais são bem
conservados entre os quatro sorotipos virais. De fato, foi visto que formulações vacinais
25
tetravalentes com vírus dengue atenuado levam à resposta citotóxica direcionada
principalmente a essa proteína (WEISKOPF et al., 2014). A referida proteína não está associada
a partículas virais livres e, provavelmente, não induz a formação de anticorpos anti-DENV
facilitadores de infecção. Há ainda evidências relacionadas ao reconhecimento da NS5 como
importante alvo na geração resposta imune celular em macacos Rhesus infectados com o
DENV-2. Linfócitos capazes de reconhecer especificamente epítopos da NS5 exibiam perfil
polifuncional (MLADINICH et al., 2012). Esse estudo foi pioneiro no uso da NS5 na forma
recombinante como antígeno alvo em formulações vacinais contra a dengue.
1.3 Os adjuvantes vacinais
No geral, um adjuvante pode ser definido como um aditivo ou veículo que melhora a
resposta imune adaptativa ou estimula o sistema imunológico inato de forma a induzir
eficientemente os efeitos imunológicos desejados (SCHIJNS; LAVELLE, 2011). Os adjuvantes
podem ser classificados em 3 tipos baseados no seu modo de ação (BRUNNER et al., 2010):
Os adjuvantes do tipo A são, em sua maioria, derivados de patógenos e atuam por uma via
imunoestimulatória específica nas células apresentadoras de antígenos (APC’s) pela indução de
sinais de perigo. Idealmente, pela escolha do sinal correto de perigo, as APC’s podem ser
programadas a induzirem uma resposta imunológica ajustada ao patógeno ao qual pertence o
antígeno vacinal. Em contraste, os adjuvantes do tipo B promovem aumento da apresentação
de antígenos (TEMMERMAN et al., 2011). Um clássico adjuvante desse tipo é o hidróxido de
alumínio. Esse sal mineral é amplamente empregado em pesquisas e o único adjuvante viável
para vacinas administradas em seres humanos no continente americano (AGUILAR;
RODRÍGUEZ, 2007). Ainda dentro dessa classificação se têm: emulsões de óleo-em-água
(o/w) e água-em-óleo (w/o), lipossomos, nanopartículas e micropartículas. Como é sabido,
esses adjuvantes promovem o prolongamento da apresentação do antígeno via formação de
depósito, proteção contra degradação, facilitação de entrega antigência direta nos linfonodos,
aumento da captação por APCs e indução de apresentação cruzada. É importante ressaltar que
a ausência de um agente imunoestimulatório pode resultar no favorecimento da tolerância
imunológica ao antígeno (BRUNNER et al., 2010). Em contraste, os adjuvantes do tipo C
promovem um sinal de perigo, porém sem a necessidade ativação das APCs, como exemplo se
pode citar o Interferon do tipo 1 e o fator de necrose tumoral na sua forma solúvel em
combinação a antígenos (BON, LE et al., 2001; KAYAMURO et al., 2009).
O RNA dupla-fita (dsRNA) é um sinal de perigo associado à infecção viral. Diversos
dsRNAs sintéticos, como poli (I:C12U), ou ácido polinosinico-policitidilico, comumente
denominado como poli (I:C), eficientemente mimetiza o dsRNA viral. Isso faz desse composto
26
um potencial candidato a adjuvante do tipo 2 para vacinação contra infecções virais. Como
sabido, dsRNA são ligantes do receptor do tipo Toll (TLR) 3 que, por sua vez, se localiza na
membrana do compartimento endossomal da maioria das APCs (DESMET; ISHII, 2012;
TAKEUCHI; AKIRA, 2010).
A combinação de adjuvantes do tipo A (imunoestimulador) com B (sistema de entrega)
se mostra como uma estratégia promissora na proteção de ambos, antígeno e do
imunoestimulador, contra degradação. Inclusive, já foi sugerido que a apresentação de um
antígeno fagocitado é mais eficiente quando co-formulado com um imunoestimulador
(BLANDER; MEDZHITOV, 2006; SCHLOSSER et al., 2008). Algumas formulações já foram
desenvolvidas para a entrega do antígeno e poli (I:C). Como demonstrado em modelo murinho,
o Montanide ISA 720, cria uma emulsão w/o, com o poli (I:C) capaz de desencadear uma
resposta Th1 potente e persistente, com a proliferação de linfócitos T CD8+ antígenos-
específicos (JIN et al., 2007). O que contrasta com formulações contendo apenas o M720 como
adjuvante, onde houve uma notável polarização Th2 (JIN et al., 2007). O poli (I:C) formulado
em emulsão com o Montanide ISA 720 promoveu a indução da polarização Th1 mais
eficientemente que o poli (I:C) apenas, fenômeno atribuído à rápida degradação do poli (I:C)
livre por ribonucleases (HAFNER et al., 2013).
27
2 OBJETIVO
2.1 Objetivo geral
Desenvolver uma vacina de sub-unidade baseada na versão recombinante da NS5
do DENV-2 contra o vírus dengue.
2.2 Objetivos específicos
Produzir a forma recombinante da NS5 em modelo de expressão em E. coli;
Avaliar as propriedades antigênicas e imunogênicas da NS5 obtida;
Avaliar o potencial da NS5 recombinante como antígeno vacinal pela indução
de resposta adaptativa protetora frente a um desafio letal com DENV-2 em
camundongos imunocompetentes.
28
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Construção do plasmídeo pGEM_NS5
A sequência da NS5 foi inicialmente amplificada por reação de PCR, a partir de um
amplicon de dsDNA que contém a sequência codificadora da NS5 do DENV-2 cepa JHA1
utilizando os primers: FwNS5BamHI (AAGCGAGGATCCGGAACTGGCAACATAGG) e
RvNS5XhoI (AATGTTCTCGAGCCACAGGACTCCTGCCT). O produto da reação foi
então purificado com o kit Ilustra™ GFX™ (GE Healthcare Life Sciences) e, em seguida, foi
realizado a reação de ligação ao vetor pGEM®-T Easy utilizada a razão molar inserto/vetor de
3:1 e as condições da reação seguiram as instruções do fabricante (Promega). O produto de
ligação foi usado para transformar E. coli DH5α quimiocompetente, e após a extração do DNA
plasmidial, foi feito a confirmação da clonagem por restrição com as endonucleases PvuI,
BamHI e XhoI (Fermentas). A banda correspondente a 2706pb de um dos clones foi excisada
do gel, purificada com o kit Ilustra™ GFX™ e ligada ao vetor de expressão pET28a(+)
previamente digerido com as enzimas de restrição BamHI e XhoI . Para a reação de ligação foi
utilizada a razão molar inserto/vetor de 3:1 e as condições da reação seguiram as instruções do
fabricante para o uso da T4 DNA ligase (Fermentas).
3.2 Transformação de E. coli DH5α quimiocompetente
Para a reação de transformação por choque térmico, alíquotas de 100 μl de células E.
coli DH5α quimiocompetentes foram preparadas, conforme protocolo descrito por Sambrook
& Russell (2001), misturadas a 10 μl de reação de ligação e colocadas em banho de gelo por 15
min. Após esse período as alíquotas foram incubadas em banho-maria a 42 °C por 45 seg e
novamente em banho de gelo por 5 min. Imediatamente após o choque térmico foram
acrescentados 800 μl de meio LB (Luria Bertani Broth- 1% triptona, 0.5% extrato de levedura,
171 mM NaCl, pH 7.0) à alíquota e as células transformadas foram incubadas por 1h a 37 ºC
sob baixa agitação (80 rpm) em agitador orbital. Um volume de 100 μl da transformação foi
inoculado em placa de Petri contendo meio LB sólido (triptona 1%, NaCl 1%, extrato de
levedura 0,5%, ágar 2%) adicionado de canamicina (50 μg/ml). As placas foram incubadas em
estufa a 37 ºC durante aproximadamente 18 h até o aparecimento de colônias. O transformante
recombinante foi confirmado por análise de restrição do plasmídeo, segundo métodos descritos
por Sambrook e Russell (2001). O plasmídeo foi extraído pelo método de lise alcalina e
submetido a tratamento com as endonucleases de restrição BamHI e XhoI (Fermentas) de
29
acordo com as orientações do fabricante. Os perfis de restrição foram visualizados em gel de
agarose 0,8% (m/v).
3.3 Subclonagem da sequência da NS5 em pET28a a partir de gene sintético
Foi feito o desenho e síntese de um gene sintético cuja sequência codifica a proteína
NS5 da cepa JHA1 de DENV2, flanqueada pelos sítios de restrição BamHI a montante do início
da sequência e XhoI a jusante de seu final. O serviço de síntese, clonagem e sequenciamento
foi realizado pela empresa GenScript USA Inc., resultando no plasmídeo pUC57-NS5-Kam. O
gene da NS5 contido no vetor pUC57-Kan-NS5 foi retirado deste plasmídeo com as
endonucleases de restrição BamHI e XhoI (Fermentas) de acordo com as orientações dos
fabricantes. O vetor de expressão pET28a(+) foi previamente digerido com as mesmas enzimas.
Os produtos das digestões foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,8% (m/v) e
corados com brometo de etídeo. A banda contendo o fragmento correspondente ao gene da NS5
digerido foi excisada do gel e posteriormente purificada utilizando-se o kit ilustraTM GFXTM,
conforme instruções do fabricante. Para a reação de ligação foi utilizada a razão molar
inserto/vetor de 3:1 e as condições da reação seguiram as instruções do fabricante para o uso da
T4 DNA ligase (Fermentas). E. coli DH5α quimiocompetentes foram transformadas com o
produto da ligação. A subclonagem foi confirmada por reação de PCR usando os iniciadores
específicos da NS5, e o plasmídio construído denominado pETNS5.
3.4 Análise da expressão da proteína recombinante NS5
Para a expressão da proteína NS5 recombinante utilizou-se a linhagem de E. coli Bl21
(DE3) RIL (BHATTACHARYA et al., 2009; YAP et al., 2007). A linhagem transformada com
o plasmídeo pETNS5 foi cultivada por aproximadamente 18 h em meio LB com canamicina
(50 µg/ml). Após esse período foi feito um inoculo com diluição inicial de 1:100, feitos em 50
ml de meio LB, e mantido a 37 °C sob agitação (200 rpm) até a fase de crescimento exponencial
(DO600nm 0,5 para indução à 37 °C ou 2,0 para indução à 18 °C), feita então a indução com
IPTG na concentração final de 0,5 mM, sendo a indução realizada a 18 °C sob agitação de 200
rpm por 16 h ou a 37 ºC sob agitação de 200 rpm por 4 h. Foram retiradas amostras para análise
antes da adição de IPTG (cultura não induzida) e após a indução. Após esse período a cultura
foi centrifugada a 8000 x g por 5 min, o sobrenadante descartado e as células suspensas em
tampão de lise (20 mM Na2PO4, 0,5 M NaCl, 50 mM L-arginina, 50 mM L-ácido glutâmico,
10 mM MgSO4, 5 mM Imidazol, 5 mM β-mercaptoetanol, 1 mM de PMSF 10% glicerol, pH
7,0). As bactérias foram lisadas por sonicação e o extrato resultante foi centrifugado a 16000 x
g por 30 min, separando-se a fração solúvel (sobrenadante) da fração insolúvel, a qual foi
30
tratada com tampão fosfato contendo ureia a 8 M. As amostras recolhidas foram centrifugadas
a 8000 x g por 1 min, o sobrenadante descartado, o material foi dissolvido em tampão de
amostra para eletroforese em gel de poliacrilamida e incubado a 100 °C por 10 min.
Quantidades semelhantes de amostra foram aplicadas nos poços e submetidas à eletroforese em
gel de poliacrilamida. Após o término da corrida o gel foi corado com Comassie Blue conforme
descrito por Sambrook e Russell (2001).
3.5 Procedimentos para a purificação da NS5 recombinante
A linhagem BL21 (DE3) RIL albergando o plasmídeo pETNS5 foi cultivada em 1 litro
de meio LB contendo 50 µg/ml de canamicina a 37 ºC até uma densidade ótica de 2,0 a 600
nm. O IPTG foi adicionado para uma concentração final de 0,5 mM, a temperatura ajustada
para 18 °C e as células foram colhidas 16 h mais tarde após centrifugação (12857 x g por 10
min). As células sedimentadas foram suspensas em tampão de lise e submetidas à lise mecânica
(600 psi por 15 min) em um homogeneizador modelo APLAB-10 (ARTEPEÇAS, Brasil). Após
a centrifugação (20670 x g por 60 min), a fração solúvel foi recuperada e filtrada em um aparato
Stedim Sartorius com um filtro de acetato de celulose com poros de até 0,22 µM (Biotech). Em
seguida, a fração foi submetida à cromatografia de afinidade ao níquel usando uma coluna
HistrapTM HP (GE Healthcare Life Sciences), previamente equilibrada com tampão A (20 mM
Na2PO4, 0,5 M NaCl, 10% glicerol e pH 7,0), num fluxo de 1,0 ml/min no cromatógrafo AKTA
AVANT (Amershan Pharmacia Biotech). A coluna foi lavada novamente com tampão A e, em
seguida, foi usado um sistema de steps definidos de tampão B (20 mM Na2PO4, 0,5 M NaCl,
10% glicerol, 1 M de Imidazol, pH 7,0) usando-se 150, 300, 500 e 1000 mM de Imidazol para
eluição da proteína e coleta da mesma em alíquotas de 2 ml cada. As frações coletadas foram
submetidas à eletroforese em SDS-PAGE, a proteína purificada foi dialisada para o tampão
Tris-NaCl pH 8.0 (Tris 50 mM, NaCl 500 mM, glicerol 10% e pH 8.0) utilizando-se membrana
de diálise com ponto de corte de 3 kDa (SnakeSkin™ Dialysis Tubing 3.000 MWCO, Pierce)
e em seguida, submetida a gel filtração em coluna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare)
previamente equilibrada com o tampão Tris-NaCl pH 8.0. As amostras de cada etapa de
purificação foram quantificadas pelo método de BCA (BCA Protein Assay Kit, Pierce) segundo
instruções do fabricante. Os níveis de endotoxina presente na proteína recombinante
proveniente desse sistema de expressão em de Escherichia coli, foi realizado empregando o
kit Limulus Amebócyte Lysate LAL QCL-1000 (Lonza). As amostras apresentaram quantidades
<0,02 EU/ug de proteína, abaixo dos valores permitidos para formulações vacinais utilizando
proteínas recombinantes < 3.6 EU/100 µL da formulação vacinal (MALYALA; SINGH, 2008)
31
3.6 Ensaios de imunodetecção
3.6.1 Teste de antigenicidade
A antigenicidade da proteína recombinante foi testada por ensaio de ELISA (Enzyme
Linked Immuno Sorbent Assay). Microplacas de poliestireno Maxisorp (Nunc®) foram
sensibilizadas por 16 h a 4 °C com a proteína NS5 (100 ng/poço) tratada termicamente por 20
min a 100 °C ou sem o tratamento térmico. As placas foram lavadas três vezes com tampão
fosfato-salina (PBS) contendo 0,05% de Tween-20 (PBST) e bloqueadas com 1X PBST
contendo 3% de leite desnatado, durante 1 h a 37 ºC. Após novo ciclo de lavagem (3x), as
amostras de soros de humanos positivos para DENV-2 foram adicionadas aos poços, diluídas
em série (1:2) iniciando em 1:50, e incubadas a temperatura ambiente por 1 h e 30 min. Depois
de um novo ciclo de lavagem (3x), o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado
à peroxidase (Sigma Aldrich®, St. Louis, Missouri, USA) na diluição (1:10000) foi adicionado
aos poços e novamente incubado. Após a lavagem final, as placas foram reveladas com tampão
citrato de sódio (pH 5.8) contendo OPD, 12% H2O2 e a reação foi parada após a adição de 50
µl de H2SO4 2 M. A leitura da densidade óptica foi realizada a 492 nm em leitor de placa
(Multiscan MS- Labsystems).
3.6.2 Titulação de anticorpos anti-NS5
No ensaio de ELISA para titulação dos anticorpos NS5-específicos microplacas de
poliestireno Maxisorp (Nunc®) foram sensibilizadas por 16 h a 4 ºC com a proteína NS5
(100ng/poço). Os procedimentos do ensaio foram os mesmos que os descritos no tópico acima,
porém utilizando-se os soros dos camundongos imunizados. Para calcular os títulos de
anticorpos NS5-específicos foi realizada análise de regressão linear (R2 >0,96).
3.6.3 Ensaio de detecção por Western blot
Ensaios de Western blot foram realizados usando anticorpo monoclonal (GT361)
comercial (Genetex) que reconhecem especificamente a NS5 de dengue 2, usando-se a diluição
1:5000. Como tampão de bloqueio foi utilizado PBSµµT 1x com 5% de leite desnatado.
Anticorpos anti-IgG de camundongos produzidos em cabra conjugados com a peroxidase
(Southern Biotechnology) na diluição 1:3000 em tampão de bloqueio, foram usados como
anticorpos secundários, e os procedimentos feitos de acordo a protocolos previamente descritos
(SAMBROOK; RUSSELL, 2001).
32
3.7 Ensaio de imunização
Camundongos machos da linhagem Balb/c com 6 a 8 semanas de idade foram utilizados
para os ensaios de imunização e foram obtidos junto ao Biotério de Isogênicos da Parasitologia-
ICBII/USP. O protocolo de imunização consistiu da administração subcutânea em 3 doses da
formulação vacinal com intervalo de 15 dias entre as doses. Para os primeiros experimentos
realizados foi administrado 100 μl/dose contendo 10 µg de NS5 ou apenas o veículo PBS estéril
como controle. Em ensaios posteriores foram incluídos adjuvantes à formulação, logo, além do
grupo NS5, a proteína foi combinada a 50 μg de poli (I:C) (grupo Poli (I:C) ), ou 50 μg de poli
(I:C) + M720 (30:70 água em óleo) (grupo M720), ou 22 μg Alúmen (gel adsorvente de
hidróxido de alumínio comercializado pela empresa Reheis) (grupo Alum), usando como tempo
de adsorção 20 min. Amostras de sangue foram coletadas um dia antes de cada dose e duas
semanas após a última dose. Os soros dos animais foram recolhidos após a coagulação do
sangue a 37 ºC por 30 min e retração do coágulo a 4 ºC por 30 min, seguida de centrifugação
refrigerada a 3.000 x g por 15 min. As amostras de soros foram estocadas a -20 ºC até realização
de ensaio de ELISA.
3.8 Detecção de células produtoras de IFN-γ e TNF-α por ELISPOT
Os ensaios de ELISPOT (do inglês Enzyme-Linked ImmunoSpot) foram feitos com a
intenção de observar a produção de IFN-γ e TNF-α a partir de estímulo com peptídeos da NS5
restritos ao MHC de classe I ou II nos animais imunizados apenas com a proteína. Os peptídeos
usados foram desenhados in silico usando o algoritmo descrito em (LUNDEGAARD et al.,
2008; MOUTAFTSI et al., 2006; WANG et al., 2008, 2010) para o halotipo H2-Kd e H2-Dd e
sintetizados pela BioMatik© (tabela 2). Duas semanas após a última dose vacinal, os animais
foram eutanasiados e seus baços removidos, processados e suas células utilizadas no ensaio. As
células totais do baço (2x105 células/poço), foram cultivadas em placa de 96 poços (Millipore)
previamente sensibilizadas com anticorpo de captura para INF-γ ou TNF-α (BD Biosciences)
na concentração de 10 µg/ml. As células foram incubadas por 48 h na presença ou ausência do
pool de peptídeos restritos ao MHC de classe I ou II (100 ng/poço). Após a estimulação, as
células foram descartadas e a placa lavada 3 vezes com PBS e 5 vezes com PBST seguido da
incubação com anticorpo monoclonal biotinilado de camundongo contra INF-γ ou TNF-α (BD
Biosciences) na concentração final de 2 µg/ml. Após 16 h, a placa foi novamente lavada e feita
a conjugação à estreptavidina marcada com peroxidase (BD Biosciences) (200 ng/poço) por 2
h a 25 °C. Após a lavagem, foi feita a revelação com solução de diaminobenzidina por 30 min.
33
Os spots foram contados com o auxílio de uma lupa. O teste t-Student foi usado para comparar
as medias de spots entre o grupo controle e o imunizado com NS5.
Tabela 2. Peptídeos da NS5 restritos ao MHC classe I e II sintetizados e seus respectivos
alótipos.
Sequência de aminoácidos Alótipo
MHC classe I
CSHHFHEL H2-Dd
YAQMWSLM H2-Dd
LGARFLEF H2-Kd
MYFHRRDL H2-Kd
MHC classe II
AQMWSLMYFHRRDLR H2-Iad
KKVRSNAALGAIFTD H2-Ied
3.9 Ensaio de marcação Intracelular de IFN-γ em linfócitos T CD8+
A marcação foi realizada com células do sangue periférico ou baço de camundongos
imunizados 14 dias após a administração da última dose vacinal, ou 30 dias após o desafio. As
células foram tratadas por 5 min com AcK e então centrifugadas a 500 x g por 5 min. As células
foram incubadas a uma concentração de 1x106 células/poço por 6 h a 37 °C com suplemento
de 5% de CO2 na presença de Brefeudina A e Monoensina (GolgiPlus; BD Biosciences) e
ausência ou presença do pool de peptídeo de NS5 MHC classe I. As células foram então
incubadas por 30 min a 4 °C com anticorpo anti-CD3 (clone 17A2) conjugado a Pe-Cy5, anti-
CD4 (clone RM4-5) conjugado a BV605 e anti-CD8 (clone 53-6.7) conjugado a BB515. Após
fixação com paraformaldeído 4% a 4 °C por 10 min e permeabilização com solução de saponina
0,5% por 20 min a 4 °C, as células foram tratadas com anticorpo anti-IFN-γ (clone XMG1.2)
conjugado a PE por 30 min a 4 °C. As células foram resuspendidas em PBS + 2% de soro fetal
bovino, e examinadas por citometria de fluxo utilizando o aparelho LSR Fortessa (BD
Biosciences). Os dados foram analisados com o uso do programa FlowJo.
3.10 Ética no uso de animais
Todos os experimentos que envolveram o uso de camundongos estavam de acordo com
os Princípios Éticos de Experimentação Animal adotado pela Sociedade Brasileira de Ciências
de Animais de Laboratório (SBCAL) e foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de
Animais (CEUA).
34
3.11 Análises estatísticas
Foi realizada a análise de variância (ANOVA) com posterior uso do teste de comparação
múltipla de Bonferroni. As análises estatísticas entre dois grupos foram realizados por test t-
Student. A análise entre as curvas de sobrevivência pelo teste estatístico de Mantel-Cox A
significância estatística foi considerada sempre que p < 0,05.
35
4 RESULTADOS
4.1 Clonagem da sequência codificadora da NS5 em pGEM®-T Easy
Inicialmente, a sequência codificadora da NS5 foi amplificada em reação de PCR, a
partir de um fragmento de DNA que continha a sequência da NS5. A reação de amplificação
resultou em um amplicom com tamanho molecular aproximado de 2706 pb compatível com o
tamanho esperado para sequência da NS5 (figura 4). O fragmento de DNA amplificado foi
purificado e clonado no vetor pGEM T-easy, conforme instruções do fabricante, e o produto da
ligação foi introduzido na linhagem DH5α de E. coli. A inserção da sequência foi confirmada
por meio de análise de restrição do DNA plasmidial extraído após lise alcalina. A reação de
restrição, empregando as enzimas BamHI, XhoI e PvuI, gerou três bandas: uma maior de 2706
pb relativa ao inserto e duas bandas menores com 1727 e 1096 pb, respectivamente,
correspondentes ao vetor pGEM T-easy (figura 5). A construção foi então denominada de
pGEM_NS5.
Figura 4. Amplificação da sequência codificadora da NS5. A sequência da NS5 foi amplificada por
reação de PCR a partir de um fragmento de DNA gerado para sequenciamento da cepa de DENV-2
JHA1. A reação produziu um amplicom com 2.706 pb, correspondente à sequência da NS5 acrescida
dos sítios de restrição para as endonucleases BamHI XhoI. M, 1 kb DNA ladder (O’Gene RulerTM
–
Fermentas
); C-, controle negativo da reação.
4.2 Subclonagem da sequência do pGEM_NS5 em pET28a
Para a subclonagem no vetor de expressão pET28a (Novagen®) o fragmento
correspondente ao gene NS5 foi liberado do vetor pGEM_NS5 por digestão com as
endonucleases BamHI, XhoI e PvuI. A banda correspondente à sequência de NS5 foi excisada
36
e extraída do gel, e após a purificação, foi ligada no vetor pET28a previamente digerido com
BamHI e XhoI. A digestão do DNA plasmidial do clone recombinante com essas enzimas
permitiu confirmar a subclonagem. A análise de restrição apresenta o fragmento correspondente
à sequência da NS5 liberada do vetor resultante pETNS5 após tratamento com BamHI e XhoI
(figura 6).
Figura 5. Construção do plasmídeo pGEM_NS5. (a) Representação esquemática do plasmídeo
pGEM_NS5, representando a origem de replicação, os genes relevantes bem como os sítios de restrição
usados para a análise estão representados. (b) Screening dos plasmídeos extraídos das bactérias
transformadas com o produto de ligação (clones de #1-#6) digeridos com BamHI, XhoI e PvuI e análise
eletroforética em gel de agarose (0,8%), gerando 3 bandas quando a clonagem foi positiva: a maior com
2.706 pb correspondente a sequência da NS5, e duas menores (1.727 e 1.096 pb) correspondente ao
vetor. M, 1kb DNA ladder (O’Gene RulerTM
–Fermentas
).
4.3 Teste de expressão do da NS5
Após a confirmação da presença íntegra do inserto codificador da NS5 no vetor de
expressão pET28a, foi realizado o teste de expressão da NS5 recombinante (107kDa) usando a
linhagem de E. coli BL21-DE3-RIL. Foi feito o cultivo da linhagem e a indução da expressão
com IPTG por 4 h a 37 ºC com rotação de 200 rpm. Amostras da cultura foram retiradas antes
e após a indução, bem como preparadas amostras das frações proteicas solúvel e insolúvel da
cultura induzida. A análise eletroforética dessas frações em SDS-PAGE (figura 7), revelou a
expressão de uma proteína com aproximadamente 50 kDa, massa molecular menor do que o
valor esperado (107 kDa). Análises por sequenciamento demonstraram que havia erros na
sequencia obtida, de modo, que um códon de parada foi inserido na sequência clonada, o que
inviabilizou o seguimento da purificação, visto que não foi possível expressar a proteína integra.
Desse modo, optou-se pela síntese sintética da sequência codificadora da NS5.
37
Figura 6. Construção do plasmídeo pETNS5. (a) Representação esquemática do plasmídeo pETNS5,
representando a origem de replicação, o promotor, os genes relevantes bem como os sítios de restrição
usados para ligação do inserto. (b) Screening dos plasmídeos extraídos das bactérias transformadas com
o produto de ligação (clones de #1-#3) por restrição com BamHI e XhoI, com subsequente análise
eletroforética em gel de agarose (0,8%), gerando duas bandas quando a clonagem foi positiva: a maior
com 5 kb, correspondente ao vetor digerido e a menor 2,7kb, correspondente a sequência da NS5. M, 1
kb DNA ladder (O’Gene RulerTM
–Fermentas
).
Figura 7. Teste de expressão da NS5 recombinante pela linhagem de E. coli BL21-DE3-RIL. SDS-
PAGE de amostra com extrato total da cultura da linhagem de E. coli antes e após a indução com IPTG,
bem como a fração solúvel e insolúvel da cultura induzida a 37 °C, 200 rpm por 4 h. Amostras: M,
marcador molecular (PageRuler); 1, extrato celular total antes da indução; 2, extrato celular total após 4
horas de indução; 3, fração proteica solúvel após indução; 4, fração proteica insolúvel após indução.
4.4 Subclonagem da sequência da NS5 para o vetor pET28a
O plasmídeo pETNS5 foi construído a partir da ligação do inserto codificador da NS5
do vírus dengue cepa JHA1 ao vetor de expressão induzível por IPTG pET28a(+) (figura 8). O
inserto foi obtido pela digestão do plasmídeo PUC57-Kan-NS5 usando as endonucleases
BamHI e XhoI, liberando um fragmento de 2706 pares de bases (pb). O inserto foi ligado ao
vetor de expressão pET28a(+) previamente digerido com as endonucleases supracitadas, de
38
modo que o produto obtido dessa reação foi usado na transformação de E. coli DH5α
quimiocompetentes. Após o cultivo em meio seletivo, os transformantes foram submetidos à
extração plasmidial, seguido de análise por reação de PCR usando primer específicos,
demonstrando a amplificação da sequência da NS5 em todos os clones testados. O
sequenciamento do inserto confirmou a sequência correta do gene clonado no vetor plasmidial.
Figura 8. Construção do pETNS5 a partir de um gene sintético. Em (a) é mostrado esquematicamente a
construção do vetor pUC57-Kan-NS5 que alberga a sequência gênica da NS5 flanqueada com os sítios
de restrição para as endonucleases BamHI e XhoI. A digestão com ambas as enzimas liberou o incerto
com 2.706 pb, posteriormente ligado ao vetor pET28a, também digerido da mesma forma, resultando
no plasmídeo pETNS5. Em (b) Screening dos transformantes (#1-#8) por amplificação por PCR usando
primers específicos, seguida de análise eletroforética em gel de agarose (0,8%). M, 1 kb DNA ladder
(O’Gene RulerTM –Fermentas); C-, controle negativo da reação.
4.5 Teste de expressão na linhagem de E. coli BL21-DE3-RIL
Após a confirmação da presença íntegra do inserto codificador da NS5 no vetor de
expressão pET28a(+), foram realizados os testes de expressão da NS5 recombinante (107 kDa)
usando a linhagem de E. coli BL21-DE3-RIL em duas condições de cultivo diferentes, de modo
a ser determinada a melhor condição de expressão da proteína de interesse (figura 9). De fato,
tanto na condição de 4 h de indução a 37 °C, como O.N. a 18 °C, a proteína recombinante foi
expressa, sendo encontrada tanto na fração solúvel quanto insolúvel em ambas as condições,
39
porém, havia uma quantidade considerável na fração solúvel na segunda condição. Esse
resultado é coerente com os dados encontrados na literatura no que diz respeito à expressão
dessa proteína em E. coli (BHATTACHARYA et al., 2009; HANLEY et al., 2002; YAP et al.,
2007).
Optou-se em utilizar a segunda condição de indução, pois a recuperação da proteína a
partir do extrato solúvel não exige etapas adicionais de solubilização, e por isso, facilitando as
etapas seguintes de purificação. Para confirmação da expressão da proteína recombinante na
condição escolhida, os extratos bacterianos foram submetidos à análise por Western blot
utilizando o anticorpo monoclonal GT361 (Genetex, USA, Inc.) que reconhece especificamente
a NS5. Conforme indicado na figura 5, uma proteína com massa molecular de aproximadamente
107 kDa correspondente à NS5 foi detectada. Também foram detectadas proteínas referentes a
prováveis produtos de degradação da proteína de interesse.
Figura 9. Teste de expressão da NS5 recombinante em E.coli BL21-DE3-RIL em diferentes condições
de indução. Amostra da cultura foram submetidas à eletroforese (SDS-PAGE) antes e após a indução
com IPTG bem como a fração solúvel e insolúvel da cultura induzida. a) condição de indução: 18 °C,
200 rpm, 16 h. b) condição de indução: 37 °C, 200 rpm, 4 h. Nas partes c) e d) western blot usando
como primeiro anticorpo um monoclonal anti-NS5 em amostras obtidas de acordo com as condições de
indução a e b, respectivamente. M, marcador molecular; 1, extrato celular total antes da indução; 2,
extrato celular total após o período de indução; 3, fração proteica solúvel após indução; 4, fração proteica
insolúvel após indução.
40
4.6 Purificação da NS5 recombinante
Com a utilização do segundo método de indução, foi possível aumentar o rendimento
da purificação do antígeno (figura 10). Resumidamente, a fração solúvel de 1 litro de cultura
da linhagem que expressa a NS5, cultivada com IPTG por 16 h, foi submetida à cromatografia
de afinidade ao níquel. Após ligação da proteína à coluna, a mesma foi eluída com
concentrações crescentes de Imidazol, a saber, 150, 300, 500 e 1000 mM (figura 10 a),
observando-se um pico de eluição de 669 mAU entre 300 e 500 mM de Imidazol. As frações
eluídas foram submetidas à SDS-PAGE e aquelas que continham a NS5 foram reunidas e
dialisadas contra o tampão Tris-NaCl pH 8.0 (Tris 50mM, NaCl 500 mM, glicerol 10% e pH
8.0).
Em seguida o produto da diálise foi submetido à cromatografia de exclusão de tamanho
em coluna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada com o tampão Tris-NaCl pH
8.0. Na figura 6 b, observa-se o resultado da cromatografia onde se observa três picos de
eluição: o primeiro é referente a contaminantes com massas moleculares diversas (97 min),
seguido do pico referente à NS5 (107 kDa) com tempo de retenção de 113 min e um último
pico com tempo de retenção de 143,74 min referente a um produto de degradação de 35 kDa
(figura 10 b). Para cada processo de purificação foi feita a quantificação das proteínas totais, de
modo que ao final de todo o processo foi possível calcular o rendimento da obtenção da NS5
recombinante nessas condições (tabela 2). Foram obtidos 7,64 mg de proteína purificada para
cada litro de cultura, resultado superior aos valores descritos anteriormente
(BHATTACHARYA et al., 2009; TAN et al., 1996), e os níveis de endotoxina dosados estavam
sempre entre 0,5 e 2,0 EU/mL, que são valores inferiores ao limite máximo permitido em
formulações vacinais para humanos (MALYALA; SINGH, 2008).
4.7 Avaliação da antigenicidade da NS5 obtida
A antigenicidade da proteína recombinante foi testada por ELISA usando como
anticorpo primário o soro de humano infectado para a detecção da NS5 recombinante (figura
11). Como pode ser observado, o soro foi capaz de reconhecer a proteína que não sofreu
tratamento térmico, enquanto que a reatividade é estatisticamente menor quando se usa a
proteína que foi tratada termicamente (100 °C por 10 min), demonstrando que a proteína
recombinante preserva antígenos conformacionais da proteína nativa. A proteína recombinante
obtida também foi passível de detecção pelo ensaio de western blot utilizando-se como
anticorpo primário um monoclonal anti-NS5 comercial, previamente caracterizado (figura 9
c,d).
41
Figura 10. Purificação da NS5 recombinante por cromatografia de afinidade seguida de gel filtração. A
fração solúvel referente a 1 litro de cultura de BLNS5 induzida foi submetida a dois processos seguidos
de purificação. a) após a ligação da amostra à coluna de níquel foi feita a eluição com concentrações
crescentes de Imidazol: 150 mM, 300 mM, 500 mM e 1 M. As frações eluídas foram misturas e
dialisadas com o tampão Tris-NaCl (Tris 50 mM, NaCl 500 mM, glicerol 10% e pH 8,0). b) O produto
dialisado foi submetido à gel filtração, resultando em três picos de eluição em 97 min, correspondente
a contaminantes; em 113 min, correspondente à proteína NS5 integra e 143 min, correspondente a um
produto de degradação. Foi feito o SDS-PAGE das frações eluídas seguido de coloração por coomassie
blue em ambas as cromatografias.
42
Tabela 3. Rendimento de purificação da NS5 recombinantea.
a- Rendimento para cada etapa de purificação da NS5 recombinante, referente a 1 litro de cultura de BL21-
DE3-RIL-NS5 induzida;
b- Concentração da NS5 em nanograma por microlitro em cada amostra, obtida pelo método de BCA
(Pierce® BCA protein assay kit, Thermo scientific);
c- Amostra obtida do pool de frações da cromatografia de afinidade que continham a NS5;
d- Amostra referente ao pós-diálise do pool de frações obtidas da cromatografia de afinidade;
e- Amostra referente ao produto da gel filtração
f- GST-NS5 do DENV-1
g- Domínio polimerase da NS5 do DENV-3
Figura 11. Análise de antigenicidade da NS5 recombinante. Comparação do reconhecimento por soro
de paciente infectado com DENV-2 em fase convalescente por ELISA, usando proteína recombinante
NS5 tratada a 100 °C por 20 minutos (linha vermelha) ou não tratada (linha azul). Em cada poço foram
adsorvidos 200 ng de NS5 em sua respectiva condição. Foi utilizado o teste estatístico de análise de
variância de duas vias, seguido do teste de Bonferroni, onde *** corresponde a p<0,001.
Momento da análise [ng/µl]b mg/L Rendimento
Pós cromatografia de afinidadec 2380,12 20,23 -
Pós diálised 1643,28 19,68 97,28%
Pós gelfiltraçãoe 294,28 7,64 37,80%
NS5 (mg/L) obtida previamente (TAN
et al., 1996)f - 0,5 -
NS5 (mg/L) obtida previamente (YAP et
al., 2007)g - 3,0 -
43
4.8 Avaliação da imunogenicidade e capacidade protetora da NS5
Uma vez obtida à proteína purificada, iniciou-se o protocolo de imunização em 3 doses,
com intervalos de duas semanas entre as doses, em camundongos Balb/c machos, de 6 a 8
semanas, utilizando-se a via subcutânea. Os animais foram divididos em dois grupos de
imunização (n=10): o grupo controle, onde foi administrado o veículo vacinal (PBS) e o grupo
onde foi administrado 10 µg de NS5. A coleta de sangue para avaliação dos títulos de IgG
específicos foi feito 14 dias após cada dose vacinal administrada. Duas semanas após a última
dose, os animais foram submetidos a eutanásia para coleta do baço para detecção de células
produtoras de IFN-γ e TNF-α, ou desafiados com uma dose letal de DENV-2 JHA1.
Quando se compara os títulos de IgG obtidos entre o grupo vacinado e o controle,
observa-se que os títulos de IgG total especifico contra NS5 é significativamente diferente após
a terceira administração (p<0,001) (figura 12). Ao fim do protocolo vacinal, foi possível
observar a produção significativamente maior de IFN-γ pelas células do baço dos animais
imunizados com NS5 após estímulo com os peptídeos restritos ao MHC de classe II e TNF-α
quando após estímulo com o pool de peptídeos restritos a ambas as classes de MHC (figura 13).
A análise da sobrevivência dos animais frente a um desafio letal com DENV-2, num modelo de
encefalite, demonstrou que a NS5 sozinha é capaz de gerar aumento de sobrevida nesse modelo,
visto que as curvas de sobrevivência do grupo imunizado e grupo controle são diferentes
(p<0.0018) (figura 14).
Figura 12. Avaliação da resposta humoral gerada em camundongos imunizados com NS5
recombinante. Camundongos Balb/c foram imunizados por via subcutânea com 10 µg de NS5 (n=10)
em três doses com intervalos de 15 dias entre as doses. Antes de cada dose, os soros dos camundongos
foram titulados em ELISA para o reconhecimento de NS5 e os títulos foram expressos como média ±
DP. Como tratamento estatístico foi feito a análise de variância de duas vias, seguido do teste de
Bonferroni, onde *** corresponde a p<0,001.
1° d
ose
2° d
ose
3° d
ose
0
100
200
300
1000
1250
1500
1750
2000NS5
PBS
***
Tit
ulo
de
Ig
G N
S5-e
sp
ecíf
ico
44
Figura 13. Análise da produção de INF-γ e TNF-α em células de baço de animais imunizados com a
NS5. Após 14 dias da última dose do regime vacinal foi feita a análise da produção de INF-γ e TNF-α
em células do baço dos camundongos imunizados pelo ensaio de ELISPOT, usando como estímulo um
pool peptídeos NS5 específicos restritos ao MHC de classe I (a) ou classe II (b). Foi usado o teste T para
comparação das médias de unidades formadoras de spots (UFSs) de cada citocina, seguido do teste de
Mann-Whitney, onde * corresponde a p<0,05.
Figura 14. Avaliação do efeito protetor gerado pela imunização com a proteína NS5 frente ao modelo
de encefalite induzida por DENV-2. Os camundongos (n=8-10) foram desafiados pela via intracraniana
usando-se 2 vezes a DL50 do DENV-2 cepa JHA1, duas semanas após a terceira dose vacinal. A
sobrevivência foi monitorada diariamente durante 15 dias após o desafio. Dados representativos de 3
experimentos feitos de forma independentes, mas com resultados semelhantes. Foi usado o teste
estatístico de Mantel-Cox para comparação das curvas de sobrevivência, onde p=0,0018.
4.9 Avaliação da imunogenicidade de formulações vacinais baseadas em NS5
Os resultados demonstraram que a NS5, apesar de imunogênica, não foi capaz de
conferir proteção contra encefalite induzida por DENV-2, de modo que novas formulações com
diferentes adjuvantes foram testadas. Os animais foram divididos em 6 grupos de imunização
2 4 6 8 10 12 14
20
40
60
80
100PBS
NS5
p=0,0018
Dias após o desafio
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
45
(n=10): o grupo controle (grupo PBS), a proteína sem adjuvante (grupo NS5), a NS5 adsorvida
ao hidróxido de alumínio (grupo Alum), a proteína com o poli (I:C) (grupo Poli (I:C)), as
últimas duas formulações usam além do poli (I:C) e a proteína o adjuvante Montanide 720®
(30:70 água-em-oléo) (grupo M720). O protocolo vacinal consistiu na administração
subcutânea de três doses de cada formulação com intervalos de duas semanas entre as doses. A
coleta de sangue para avaliação de títulos de anticorpos específicos e sub classe de IgG foi feita
14 dias após cada dose. Após 14 dias da última dose, os animais foram submetidos a um desafio
letal com DENV-2 ou eutanasiados e as células do baço cultivadas e submetidas ao ensaio de
ICS (figura 15).
Figura 15. Representação esquemática do regime vacinal empregado. As formulações foram
administradas em três doses com intervalos de 15 dias entre as doses. Amostras de soro foram coletadas
um dia antes de cada dose de imunógeno. O desafio letal e cultivo das células do baço para marcação
de citocinas intracelulares foram feitos 15 dias após a administração da última dose.
Os títulos de IgG que reconhecem especificamente a NS5 após a terceira dose foram
estatisticamente maiores que o título obtido após a primeira dose em todas as formulações
vacinais testadas. Ao se observar os títulos referentes à terceira dose vacinal, o grupo M720
gerou maiores títulos de IgG NS5 específicos (figura 16 a e b). Quanto as concentrações médias
das sub-classes IgG1 e IgG2a, foi possível observar diferentes perfis para cada formulação
(figura 16 c). As formulações que continham apenas a NS5 e que combinavam a proteína ao
hidróxido de alumínio (NS5 e Alum, respectivamente) tiveram a relação IgG1/IgG2a maiores
que 1. A formulação contendo Alum induziu uma produção significativamente maior da sub-
classe IgG1 antígeno-específico (p<0,05). De modo contrário, as formulações que continham
além da proteína o poli (I:C) sozinho ou emulsificado em montanide 720 (as formulações Poli
(I:C) e M720, respectivamente), geraram uma relação menor que 1 entre as sub-classes, sendo
que a formulação M720 induziu uma produção significativamente maior da sub-classe IgG2a
antígeno-específico (p<0,05).
46
Figura 16. Avaliação da resposta humoral gerada pelas formulações vacinais. O soro dos animais foi
individualmente submetido ao teste de ELISA para o reconhecimento da NS5. Os resultados expressos
com a média ± desvio-padrão. (a) Títulos de IgG NS5-específicos gerados após a administração das
diferentes formulações vacinais nas 3 doses de imunização (b) Títulos de IgG NS5-específicos gerados
após terceira dose. (c) Concentrações das subclasses de IgG NS5-específicas geradas pelas formulações
após a terceira dose vacinal. A relação entre as subclasses de IgG1 e IgG2a NS5 específicas estão
representadas acima no gráfico. O valor do título ou concentração obtidos no grupo PBS foi subtraído
dos valores obtidos nos grupos de imunização. Dados representativos de no mínimo dois experimentos
independentes, com resultados semelhantes. Nos gráficos A e B, foi feita a análise de variância seguido
do teste de Bonferroni, e na figura C foi feito o teste T comparando as medias das concentrações das
subclasses de IgG dentro de cada grupo vacinal (***p<0,01; **p<0,1; *p<0,5).
47
As evidências de geração de resposta imunológica do tipo celular especifica foi avaliada
pela estimativa percentual da população de linfócitos T CD8+ capazes de produzir IFN-γ
quando estimulados com peptídeos derivados da proteína NS5 restritos ao MHC do tipo I. Para
o isolamento da população de linfócitos CD3+ CD8+ (figura 17 a), foi usado uma estratégia
clássica de análise (TUNG et al., 2007). A formulação contendo M720 foi capaz de promover
a ativação de linfócitos T CD8+ específicos (figura 17 b), cujo o valor percentual é
estatisticamente maior que os valores gerados pela formulação Alum e o grupo controle (p <
0,05).
Figura 17. Indução de ativação de linfócitos T CD8+ NS5-específicos. A estratégia de análise para
identificação da população de linfócitos T CD8+ produtores de interferon-γ após estímulo específico
com NS5 foi feita como mostrada em (a), onde, após a se fazer a janela de aquisição de linfócitos (SSC-
A/FSC-A) a partir de células únicas (singlets: FSC-H/FSC-A), separou-se a população que expressa
CD3, seguido da separação da população de marcada com CD8 e dessa população, as células que
expressaram interferon-γ. A frequência de linfócitos T CD8+ IFN-γ+, dentro da população de linfócitos
T CD3+ CD8+ foi estimada após duas semanas após a última dose vacinal. Foi usado para a análise o
teste de Bonferroni para comparações múltiplas, onde * se refere a p < 0,05.
48
4.10 Avaliação da capacidade protetora gerada pelas formulações
Após a realização do protocolo de imunização, os camundongos foram desafiados com
2 vezes a DL50 do DENV-2 cepa JHA1, pela via intracraniana, como descrevemos
anteriormente (Amorim, et al. 2012). A observação de mortalidade nesses animais foi feita por
22 dias após o desafio em mais de dois experimentos independentes (figura 18). Os grupos
Alum e M720 tiveram a curva de sobrevivência semelhante ao grupo controle (PBS), não sendo,
portanto, capaz de induzir uma resposta protetora ou aumento de sobrevida aos animais. Os
grupos NS5 e Poli (I:C) tiveram a sobrevida aumentada em relação ao grupo controle (p<0,01),
sendo que o último grupo promoveu a sobrevivência de 10% dos camundongos submetidos ao
desafio.
Figura 18. Proteção conferida aos camundongos imunizados com as vacinas baseadas em NS5 contra
encefalite induzida pelo DENV-2. Os camundongos Balb/c (n=10) foram desafiados pela via
intracraniana usando-se 2 vezes a DL50 do DENV-2 cepa JHA1, duas semanas após a terceira dose
vacinal. A sobrevivência foi monitorada diariamente durante 22 dias após o desafio. Dados
representativos de três experimentos feitos de forma independente, mas com resultados semelhantes.
Foi usado o teste estatístico de Mantel-Cox, onde p=0,0021 quando se compara a curva de sobrevivência
do grupo Poli (I:C) em relação ao grupo PBS e p=0,0031 quando se compara o grupo NS5 ao grupo
PBS.
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
40
60
80
100 PBS
NS5
Alum
Poli (i:c)
M720
p<0,01
Dias após o desafio
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
49
5 DISCUSSÃO
A febre da dengue é a principal arbovirose que atualmente atinge seres humanos e
embora a doença seja conhecida por mais de 70 anos, não há ainda tratamentos efetivos contra
a doença, bem como, formulações vacinais disponíveis e capazes de conferir proteção frente à
infecção. Nesse contexto, o uso da NS5 em sua forma recombinante como antígeno alvo numa
formulação vacinal contra a dengue, se mostra como uma alternativa promissora, visto que a
proteína não é estrutural, o que anula as chances de aumento da infecção por anticorpos de
reatividade cruzada sub-neutralizantes. Além disso, essa proteína é a mais conservada proteína
entre os quatro sorotipos, implicando em altas chances de uma vacina tetravalente. De fato,
resultados recentes de um teste em seres humanos, demonstrou que formulações tetravalentes
usando o vírus atenuados direciona à resposta imune celular majoritariamente contra epitopos
conservados da NS5 (WEISKOPF et al., 2014). Nesse trabalho, foram testadas formulações
vacinais baseadas na NS5 do DENV-2 cepa JHA1, na sua forma recombinante, administrada
sozinha ou juntamente com diferentes adjuvantes, com o objetivo de controlar a encefalite
induzida pelo DENV-2 em modelo murino. A produção da proteína foi feita em E. coli e
purificada a partir da fração solúvel da cultura induzida, o que representa uma vantagem no
caso de um escalonamento de produção, visto que não há necessidade de procedimentos
adicionais de redobramento proteico, como nos casos onde a proteína se encontra na fração
insolúvel.
O uso de dois etapas de purificação resultou na obtenção da proteína com alto grau de
pureza. Além disso, o uso de utensílios e soluções com baixos níveis de endotoxina resultou na
obtenção de um antígeno recombinante produzido em uma bactéria gram-negativa que possuía
níveis aceitáveis de LPS (0,5 e 2,0 EU/mL), fator muitas vezes limitante no uso de proteínas
recombinantes produzidas em bactérias gram negativas (SCHWARZ et al., 2014; WAKELIN
et al., 2006). Outro fator relevante quanto à obtenção da NS5 foi o rendimento. O valor obtido
foi de 2-14 vezes maior do que aqueles relatados em outros trabalhos de purificação de formas
recombinantes da NS5 de DENV-2 em modelo procarioto (TAN et al., 1996; YAP et al., 2007).
Esse fato está relacionado à temperatura, momento e duração da indução. Trabalhos anteriores
demonstraram que a NS5 é toxica à E. coli, resultando na parada de crescimento da cultura
quando a proteína é expressa em grandes quantidades (ACKERMANN; PADMANABHAN,
2001). Com base nessa informação, optou-se em modificar o protocolo descrito por
Bhattacharya e colaboradores (2009), de modo que a indução com o IPTG foi feita quando a
cultura atingiu a densidade ótica (600 nm) de 2. Em combinação ao cultivo em baixa
50
temperatura por um período de 16 h que favorece o aumento do rendimento por: (i) diminuir as
interações hidrofóbicas, indutoras de formação de corpúsculos de inclusão; (ii) reduz a taxa de
síntese e cinética de dobramento proteico, favorecendo na qualidade estrutural; (iii) induz
menor expressão de proteases específicas (VOULGARIDOU et al., 2013).
Apesar de ter sido usado um modelo bacteriano de expressão, a proteína purificada a
partir da fração solúvel preservou características antigênicas, como demonstrado pelo
reconhecimento da proteína não tratada termicamente por soro de paciente. O reconhecimento
é perdido quando a proteína é tratada por calor, evidenciando a conservação de epitopos
conformacionais na proteína recombinante obtida nesse trabalho. Além disso, a proteína foi
reconhecida por um monoclonal NS5-especifico comercial e previamente caracterizado como
ligante da região final da NS5 de DENV-2 (posição de ligação entre os resíduos de aminoácidos
829-900 da NS5 de DENV-2) no ensaio de western blot.
A análise da imunogenicidade da proteína obtida foi feita pela administração subcutânea
de três doses de 10µg da NS5 purificada, comparando-se, a princípio, os títulos de anticorpos
geradas após cada dose em comparação com o grupo controle, onde foi administrado apenas o
veículo vacinal (PBS). Foi possível observar que a proteína obtida é imunogênica, visto que
após 3 administrações, os títulos de IgG antígeno-específicos são estatisticamente diferentes do
grupo controle. A NS5 recombinante obtida atende aos 4 parâmetros tidos como preditivo de
imunogenicidade: (i) grande peso molecular, (ii) complexidade química, (iii) solubilidade
(relativo a ser hidro degradável) e (iv) ser não-próprio (DINTZIS et al., 1976; ELGERT, 2009).
Foi observado também a produção in vitro de TNF-α e INF-γ por células do baço dos
camundongos imunizados, mediante estímulos específicos com peptídeos derivados da NS5,
restritos ao MHC de classe I e II (SCHWARZ et al., 2014; WAKELIN et al., 2006; WRIGHT
et al., 1990) . Ao término do protocolo vacinal os animais foram desafiados com uma dose letal
do DENV cepa JHA1 pela via intracraniana. A análise das curvas de sobrevivência dos dois
grupos, mostrou que a NS5 foi capaz de induzir um aumento significativo na sobrevida dos
animais. Esses resultados mostraram que a NS5 recombinante tem potencial como antígeno
vacinal contra a dengue, de modo que os esforços subsequentes seriam em desenvolver
formulações baseadas na NS5 que induzissem um maior efeito protetor dentro desse modelo de
desafio.
Diferentes adjuvantes foram associados à NS5 e administrados pela via subcutânea em
camundongos Balb/c. Cada uma das formulações testadas foi capaz de gerar títulos de IgG
específicos anti-NS5 com diferentes magnitudes, sendo que o uso combinado de poli (I:C) e
proteína emulsionados em Montanide 720 (formulação M720), induziu maiores títulos de IgG
51
anti-NS5. Para a formulação NS5 e Alum, a relação entre IgG1 e IgG2, foi superior a 1,
sugerindo uma ativação de resposta Th2, resultado que está de acordo ao esperado para
antígenos proteicos exógenos (AMORIM et al., 2012a; SIMMONS et al., 2010; WOODLAND,
2004) e sobre a modulação induzida por esse adjuvante em formulações vacinais (BRUNNER;
JENSEN-JAROLIM; PALI-SCHÖLL, 2010; GUPTA; SIBER, 1995; SCHIJNS; LAVELLE,
2011). Para as formulações Poli (I:C) e M720, a relação entre IgG1 e IgG2a foi menor que 1,
indicando a indução de IgG anti-NS5 específicos com predominância da subclasse IgG2a, o
que sugere um perfil Th1 de resposta, o que está em concordância com resultados já descritos
sobre as características desses adjuvantes (BRUNNER; JENSEN-JAROLIM; PALI-SCHÖLL,
2010; FIELD et al., 2010; GUPTA; SIBER, 1995; JIN et al., 2007; SCHIJNS; LAVELLE,
2011; WADA; KOHARA; YASUTOMI, 2013). Esses resultados em conjunto, demonstram
que as formulações foram imunogênicas e que os adjuvantes funcionaram em promover a
potencialização da resposta, demonstrado pelos valores de títulos de IgG, e promoveram a
modulação esperada, demonstrada pelas diferentes relações entre subclasses de IgG
(MOSMANN; COFFMAN, 1989).
Como demonstrado anteriormente, o perfil Th1 de resposta está relacionado a indução
de linfócitos T citotóxicos específicos (KEDZIERSKA et al., 2006; MLADINICH et al., 2012;
NORDLY et al., 2011; SALEM et al., 2009; SPAULDING et al., 1999b). As indicações da
ativação no braço de resposta celulares induzidas por algumas das formulações levou à
investigação da indução de linfócitos T CD8+ específicos produtores de IFN-γ. As células de
baço dos animais imunizados duas semanas após o protocolo de imunização foram
imunofenotipadas com os marcadores CD3 e CD8, que são respectivamente o TCR (do inglês
T Cell Receptor) que é o marcador de linfócitos T e o co-receptor que, juntamente com o TCR,
estão intimamente associados ao MHC do tipo I. Portanto, esses marcadores caracterizam a
população de linfócitos do tipo T efetores ou citotóxicos. Juntamente com a imunofenotipagem
foi realizada a marcação intracelular de IFN-γ após estimulo específico com peptídeos
provenientes da NS5, restritos ao MHC de classe I. Os resultados obtidos nesse trabalho
demonstraram que a formulação vacinal M720 foi capaz de induziu a expansão de linfócitos T
efetores específicos contra a NS5 do DENV-2, resultado que está em concordância com o perfil
de subclasses de IgG gerados e o tipo de resposta esperada para essa combinação de adjuvantes
( HAFNER; CORTHÉSY; MERKLE, 2013; JIN et al., 2007).
O uso da NS5 do DENV como antígeno vacinal é inédito. Entretanto, essa e outras
proteínas não estruturais são alvos promissores contra a infecção por vírus estreitamente
relacionados com o DENV, como é o caso do vírus da hepatite C (HCV) (JIN et al., 2007;
52
WADA et al., 2013). Jin e colaboradores (2007) demonstraram que o uso da proteína não
estrutural 3 do HCV em combinação com o poli (I:C) emulsionado em Montanide 720 gerou
uma resposta imunológica com perfil Th1 que foi específica, potente, duradora e capaz de gerar
linfócitos T citotóxicos efetores em camundongos. Assim sendo, os dados aqui demonstrados
estão em consonância com a literatura.
O entendimento exato da interação entre diversos vírus neurotrópicos e o sistema
nervoso central (SNC), ainda representa um desafio importante no entendimento da patogênese
desencadeada por diversos vírus (CHAKRABORTY et al.). Essa complexa relação é marcada
pela necessidade do patógeno ser capaz de replicar com mínimo dano tecidual e exposição ao
sistema imune, bem como o hospedeiro deve ser capaz de interromper a replicação do vírus,
causando danos diminutos às células do SNC, principalmente os neurônios dado a sua vital
importância no contexto sistêmico e a sua capacidade limitada de regeneração (CHEVALIER
et al., 2011). Além disso, o SNC é tido como um sítio imunologicamente “privilegiado”, visto
a presença da barreira hematoencefálica e a ausência de um drenador linfoide associado.
Entretanto, o sistema imunológico pode controlar infecções nesse tecido, porém, à custa de
dano tecidual irremediável pela inflamação desencadeada (GALEA et al., 2007).
Em trabalhos anteriormente publicados, descrevemos o uso de um isolado clínico do
DENV-2 como modelo de estudo da dengue. Essa cepa, denominada JHA1, é letal a
camundongos imunocompetentes quando inoculada por via intracraniana, gerando um quadro
de encefalite acompanhado de distúrbios hematológicos (AMORIM; PEREIRA BIZERRA; et
al., 2012). No presente trabalho foi possível observar um efeito de aumento de sobrevida
significativo induzido pela imunização com a proteína NS5 ou quando combinada ao poli (I:C),
frente a um desafio intracraniano letal com JHA1. Entretanto, não houve correlação entre
capacidade da formulação de induzir a geração linfócitos T citotóxicos (CTL’s) e proteção,
visto não haver diferença entre as curvas de sobrevivência do grupo M720 e o grupo controle
dentro do modelo desafio empregado usado nesse trabalho.
Dentre todos os mecanismos efetores na eliminação viral pelo sistema imune, os
linfócitos T CD8+ recebem destaque, devido às suas funções na proteção primária do hospedeiro
contra doenças de caráter infeccioso (CLAASSEN et al., 2013; MOSEMAN; MCGAVERN,
2013; REMAKUS; SIGAL, 2013; SCHUCH et al., 2014; WORTZMAN et al., 2013). Os
CTL’s, podem desencadear morte celular via reconhecimento específico de peptídeos
apresentados no contexto de MHC de classe I, em vias líticas, pela liberação de perforinas e
granzimas ou pela via Fas/Fas-ligante (KÄGI et al., 1996; LANCKI et al., 1989, 1991;
53
NAGLER-ANDERSON et al., 1989; WILLIAMS; ENGELHARD, 1996). A morte celular
pode ocorrer também pela produção e liberação de citocinas antivirais pelos linfócitos T CD8+,
como o IFN-γ e o TNF-α (BINDER; GRIFFIN, 2003; KNICKELBEIN et al., 2008).
Como o reconhecimento do complexo peptídeo-MHC I é fundamental no estímulo das
funções efetoras dos CTL’s, os neurónios foram considerados por muito tempo como
invulneráveis à ação dessas células do sistema imune, visto que não expressam moléculas de
MHC I (JOLY et al., 1991). Entretanto, já se é sabido que essas moléculas são expressas nessas
células durante um quadro inflamatório local (SHATZ, 2009), o que torna neurônios potenciais
alvos de linfócitos T citotóxicos no contexto de encefalite causada por vírus, por exemplo. Além
disso, evidencias ex vivo e in vitro, demonstraram que neurônios podem ser atacados pelas vias
citolíticas desses linfócitos em diferentes modelos murino de encefalite (BIEN et al., 2002;
MEDANA et al., 2001). Assim sendo, a resposta celular contra a dengue baseada apenas em
linfócitos T CD8+ efetores pode não ser passível de correlação com a proteção quando o modelo
utilizado para desafio se baseia na indução de encefalite, o que pode levar à subestimação dos
resultados obtidos, como por exemplo, a formulação M720 desenvolvida nesse trabalho, que
foi capaz de induzir uma potente resposta imunológica, evidenciada tanto pela indução de altos
títulos de IgG antígeno-específica, bem como a expansão linfócitos T CD8+ específicos, porém,
não havendo correlação com a proteção.
O papel desempenhado por linfócitos T CD4+ tem sido descrito para diversas encefalites
virais, como por exemplo, na infecção de cavalos pelo vírus da encefalite equina Venezuelana
(VEEV), onde demonstrou-se que a transferência adotiva de células T CD4+, mas não de células
T CD8+, em camundongos primados com o VEEV promoveu proteção à encefalite induzida em
camundongos susceptíveis à infecção (YUN et al., 2009). A importância da atuação de células
T CD4+ no controle em infecções com Flavivirus é bem descrita na literatura (LIU;
CHAMBERS, 2001; MURALI-KRISHNA et al., 1996; SITATI; DIAMOND, 2006). Há
demonstrações experimentais que células T CD4+ específicas contra o vírus do oeste do Nilo
(WNV) exibem atividades antivirais por meio de secreção de citocinas antivirais, ou por
citotoxicidade direta, sendo suficiente na geração de proteção em modelo murino (BRIEN et
al., 2008; SITATI; DIAMOND, 2006). Assim sendo, a proteção ou o aumento de sobrevida no
modelo desafio utilizado nesse trabalho, pode estar relacionada ao aumento de células T CD4+
específicas, o que torna questionável a utilização de modelos de encefalite na avaliação de
formulações vacinais contra dengue, visto que diversas evidências recentes, apontam para as
54
células T CD8+ especificas como parte importante na proteção contra a infecção pelo DENV
(DURBIN et al., 2013; RIVINO et al., 2013, 2015; WEISKOPF et al., 2014)
Apesar de não termos observado proteção completa dos animais imunizados no modelo
de dengue empregado nesse estudo, a proteína NS5 recombinante aqui obtida é um reagente
com potencial de uso amplo. A proteína tem sido valiosa em plataformas de estudo de antivirais
tetravalentes contra a dengue, visto que essa proteína é central no processo de replicação viral
e é altamente conservada entre os sorotipos (COUTARD et al., 2014; FRASER et al., 2014b;
LESCAR et al., 2008). Além dessas características, a NS5 realiza atividades enzimáticas
complexas que não ocorrem nas células hospedeiras, que são a atividade de metiltrasferase e
RNA polimerase RNA-dependente, assim sendo, drogas contra ela desenvolvidas tendem a ter
maior toxicidade seletiva, o que não ocorre para proteína NS3, cujas funções são dependentes
da capacidade de hidrólise de ATP, função amplamente compartilhada por diversas enzimas da
célula hospedeira. Além disso, como é sabido, a NS5 no estado: hipofosforilado interage
fortemente com a NS3, sendo essa interação fundamental na iniciação da replicação e
alongamento do RNA viral em transcrição. No estado hiperfosforilado, a proteína interage com
diversas proteínas celulares envolvidas em vias de sinalização antivirais, tanto no citoplasma
quanto no núcleo. Desta forma, drogas desenvolvidas no intuito de inibir interações
proteína/proteína devem compor um painel de antivirais contra a infecção pelo vírus dengue
(CHEN, C. et al., 1997; TAKAHASHI et al., 2012; TAY et al., 2015).
55
6 CONCLUSÕES
Os objetivos almejados para desenvolvimento da presente dissertação foram alcançados
e as conclusões obtidas foram:
A forma recombinante da proteína NS5 do DENV-2 foi obtida com alto
rendimento em sistema procarioto a partir da fração solúvel. A proteína preserva
epitopos conformacionais presentes na sua forma nativa.
A proteína NS5 recombinante aqui obtida é imunogênica quando
administrada pela via subcutânea, induzindo a geração de IgG antígeno-especifica,
produção de TNF-α e IFN-γ por células imunológicas e aumento de sobrevida em
modelo de desafio com DENV-2 cepa JHA1.
A imunogenicidade da NS5 foi potencializada pela adição de adjuvantes
em um protocolo vacinal, desencadeando uma resposta humoral sistêmica com perfis
de modulação adequado para cada formulação, entretanto nenhum dos adjuvantes
induziu sobrevida maior que a induzida pela proteína sozinha.
A formulação M720, que continha além da proteína os adjuvantes poli
(I:C) emulsificado em Montanide 720, foi capaz de ativar linfócitos T CD8+
específicos, fato que não foi correlacionado com aumento na proteção ao desafio
intracraniano com a linhagem JHA1 de DENV2.
56
REFERÊNCIAS
ACKERMANN, M.; PADMANABHAN, R. De novo synthesis of RNA by the dengue virus
RNA-dependent RNA polymerase exhibits temperature dependence at the initiation but not
elongation phase. The Journal of biological chemistry, v. 276, n. 43, p. 39926–39937, 2001.
AGUILAR, J. C.; RODRÍGUEZ, E. G. Vaccine adjuvants revisited. Vaccine, v. 25, n. 19, p.
3752–3762, 2007.
AMORIM, J. H.; ALVES, R. P. D. S.; BOSCARDIN, S. B.; FERREIRA, L. C. D. S. The
dengue virus non-structural 1 protein: risks and benefits. Virus research, v. 181, p. 53–60,
2014.
AMORIM, J. H.; DINIZ, M. O.; CARIRI, F. A M. O.; et al. Protective immunity to DENV2
after immunization with a recombinant NS1 protein using a genetically detoxified heat-labile
toxin as an adjuvant. Vaccine, v. 30, n. 5, p. 837–845, 2012.
AMORIM, J. H.; PEREIRA BIZERRA, R. S.; SANTOS ALVES, R. P. DOS; et al. A genetic
and pathologic study of a DENV2 clinical isolate capable of inducing encephalitis and
hematological disturbances in immunocompetent mice. PloS one, v. 7, n. 9, p. e44984, 2012.
APT, D.; RAVIPRAKASH, K.; BRINKMAN, A.; et al. Tetravalent neutralizing antibody
response against four dengue serotypes by a single chimeric dengue envelope antigen.
Vaccine, v. 24, n. 3, p. 335–344, 2006.
ARORA, U.; TYAGI, P.; SWAMINATHAN, S.; KHANNA, N. Virus-like particles
displaying envelope domain III of dengue virus type 2 induce virus-specific antibody
response in mice. Vaccine, v. 31, n. 6, p. 873–878, 2013.
AVIRUTNAN, P.; HAUHART, R. E.; SOMNUKE, P.; et al. Binding of flavivirus
nonstructural protein NS1 to C4b binding protein modulates complement activation. Journal
of immunology, v. 187, n. 1, p. 424–433, 2011a.
AVIRUTNAN, P.; HAUHART, R. E.; SOMNUKE, P.; et al. Binding of flavivirus
nonstructural protein NS1 to C4b binding protein modulates complement activation. Journal
of immunology, v. 187, n. 1, p. 424–433, 2011b.
AVIRUTNAN, P.; ZHANG, L.; PUNYADEE, N.; et al. Secreted NS1 of dengue virus
attaches to the surface of cells via interactions with heparan sulfate and chondroitin sulfate E.
PLoS pathogens, v. 3, n. 11, p. e183, 2007a.
AVIRUTNAN, P.; ZHANG, L.; PUNYADEE, N.; et al. Secreted NS1 of dengue virus
attaches to the surface of cells via interactions with heparan sulfate and chondroitin sulfate E.
PLoS pathogens, v. 3, n. 11, p. e183, 2007b.
De acordo com:
ASSOCIAÇÂO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 6023: informação e documentação: referências: elaboração.
Rio de Janeiro, 2002.
57
BARRETO, M. L.; TEIXEIRA, M. G. Dengue no Brasil: situação epidemiológica e
contribuições para uma agenda de pesquisa. Estudos Avançados, v. 22, n. 64, p. 53–72,
2008.
BECKETT, C. G.; TJADEN, J.; BURGESS, T.; et al. Evaluation of a prototype dengue-1
DNA vaccine in a Phase 1 clinical trial. Vaccine, v. 29, n. 5, p. 960–968, 2011.
BHAMARAPRAVATI, N.; YOKSAN, S. Study of bivalent dengue vaccine in volunteers.
Lancet, v. 1, n. 8646, p. 1077-1081, 1989.
BHATT, S.; GETHING, P. W.; BRADY, O. J.; et al. The global distribution and burden of
dengue. Nature, v. 496, n. 7446, p. 504–507, 2013..
BHATTACHARYA, D.; MAYURI; BEST, S. M.; et al. Protein kinase G phosphorylates
mosquito-borne flavivirus NS5. Journal of virology, v. 83, n. 18, p. 9195–9205, 2009.
BIELEFELDT-OHMANN, H.; MEYER, M.; FITZPATRICK, D. R.; MACKENZIE, J. S.
Dengue virus binding to human leukocyte cell lines: receptor usage differs between cell types
and virus strains. Virus research, v. 73, n. 1, p. 81–89, 2001.
BIEN, C. G.; BAUER, J.; DECKWERTH, T. L.; et al. Destruction of neurons by cytotoxic T
cells: a new pathogenic mechanism in Rasmussen’s encephalitis. Annals of neurology, v. 51,
n. 3, p. 311–318, 2002.
BINDER, G. K.; GRIFFIN, D. E. Immune-mediated clearance of virus from the central
nervous system. Microbes and infection / Institut Pasteur, v. 5, n. 5, p. 439–448, 2003.
BLANDER, J. M.; MEDZHITOV, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for
presentation by dendritic cells. Nature, v. 440, n. 7085, p. 808–812, 2006.
BLANEY, J. E.; HANSON, C. T.; FIRESTONE, C.-Y.; et al. Genetically modified, live
attenuated dengue virus type 3 vaccine candidates. The American journal of tropical
medicine and hygiene, v. 71, n. 6, p. 811–821, 2004.
BLANEY, J. E.; SATHE, N. S.; GODDARD, L.; et al. Dengue virus type 3 vaccine
candidates generated by introduction of deletions in the 3’ untranslated region (3'-UTR) or by
exchange of the DENV-3 3'-UTR with that of DENV-4. Vaccine, v. 26, n. 6, p. 817–828,
2008.
BLOK, J. Genetic relationships of the dengue virus serotypes. The Journal of general
virology, v. 66 ( Pt 6), p. 1323–1325, 1985.
BON, A. LE; SCHIAVONI, G.; D’AGOSTINO, G.; et al. Type i interferons potently enhance
humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.
Immunity, v. 14, n. 4, p. 461–470, 2001.
BRANDLER, S.; LUCAS-HOURANI, M.; MORIS, A.; et al. Pediatric measles vaccine
expressing a dengue antigen induces durable serotype-specific neutralizing antibodies to
dengue virus. PLoS neglected tropical diseases, v. 1, n. 3, p. e96, 2007.
58
BRAY, M.; LAI, C. J. Construction of intertypic chimeric dengue viruses by substitution of
structural protein genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, v. 88, n. 22, p. 10342–10346, 1991.
BRIEN, J. D.; UHRLAUB, J. L.; NIKOLICH-ZUGICH, J. West Nile virus-specific CD4 T
cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral
protection. Journal of immunology, v. 181, n. 12, p. 8568–8575, 2008.
BRUNNER, R.; JENSEN-JAROLIM, E.; PALI-SCHÖLL, I. The ABC of clinical and
experimental adjuvants--a brief overview. Immunology letters, v. 128, n. 1, p. 29–35, 2010.
CAPEDING, R. Z.; LUNA, I. A.; BOMASANG, E.; et al. Live-attenuated, tetravalent dengue
vaccine in children, adolescents and adults in a dengue endemic country: randomized
controlled phase I trial in the Philippines. Vaccine, v. 29, n. 22, p. 3863–3872, 2011.
CHAKRABORTY, S.; NAZMI, A.; DUTTA, K.; BASU, A. Neurons under viral attack:
victims or warriors? Neurochemistry international, v. 56, n. 6-7, p. 727–735, 2010.
CHAN, Y. C.; KANAPATHIPILLAI, K.; CHEW, K. S. Isolation of two strains of dengue
virus type 3 in Singapore. Singapore medical journal, v. 5, n. 3, p. 127–132, 1965.
CHEN, C.; KUO, M.; CHIEN, L.; et al. RNA-protein interactions: involvement of NS3, NS5,
and 3’ noncoding regions of Japanese encephalitis virus genomic RNA. Journal of Virology,
v. 71, n. 5, p. 3466–3473, 1997.
CHEN, Y.; MAGUIRE, T.; HILEMAN, R. E.; et al. Dengue virus infectivity depends on
envelope protein binding to target cell heparan sulfate. Nature medicine, v. 3, n. 8, p. 866–
871, 1997.
CHEVALIER, G.; SUBERBIELLE, E.; MONNET, C.; et al. Neurons are MHC class I-
dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection. PLoS pathogens, v. 7, n.
11, p. e1002393, 2011.
CHIANG, C.-Y.; LIU, S.-J.; TSAI, J.-P.; et al. A novel single-dose dengue subunit vaccine
induces memory immune responses. PloS one, v. 6, n. 8, p. e23319, 2011.
CLAASSEN, M. A. A.; JANSSEN, H. L. A.; BOONSTRA, A. Role of T cell immunity in
hepatitis C virus infections. Current opinion in virology, v. 3, n. 4, p. 461–467, 2013.
CLEMENTS, D. E.; COLLER, B.-A. G.; LIEBERMAN, M. M.; et al. Development of a
recombinant tetravalent dengue virus vaccine: immunogenicity and efficacy studies in mice
and monkeys. Vaccine, v. 28, n. 15, p. 2705–2715, 2010.
COSTA, S. M.; AZEVEDO, A. S.; PAES, M. V; et al. DNA vaccines against dengue virus
based on the ns1 gene: the influence of different signal sequences on the protein expression
and its correlation to the immune response elicited in mice. Virology, v. 358, n. 2, p. 413–
423, 2007.
COSTA, S. M.; FREIRE, M. S.; ALVES, A. M. B. DNA vaccine against the non-structural 1
protein (NS1) of dengue 2 virus. Vaccine, v. 24, n. 21, p. 4562–4564, 2006.
59
COSTA, S. M.; YORIO, A. P.; GONÇALVES, A. J. S.; et al. Induction of a protective
response in mice by the dengue virus NS3 protein using DNA vaccines. PloS one, v. 6, n. 10,
p. e25685, 2011.
COUTARD, B.; DECROLY, E.; LI, C.; et al. Assessment of Dengue virus helicase and
methyltransferase as targets for fragment-based drug discovery. Antiviral research, v. 106, p.
61–70, 2014.
CRILL, W. D.; ROEHRIG, J. T. Monoclonal antibodies that bind to domain III of dengue
virus E glycoprotein are the most efficient blockers of virus adsorption to Vero cells. Journal
of virology, v. 75, n. 16, p. 7769–7773, 2001.
DANKO, J. R.; BECKETT, C. G.; PORTER, K. R. Development of dengue DNA vaccines.
Vaccine, v. 29, n. 42, p. 7261–7266, 2011.
DESMET, C. J.; ISHII, K. J. Nucleic acid sensing at the interface between innate and adaptive
immunity in vaccination. Nature reviews. Immunology, v. 12, n. 7, p. 479–491, 2012.
DIERCKS, F. H. Isolation of a type 2 dengue virus by use of hamster kidney cell cultures.
The American journal of tropical medicine and hygiene, v. 8, n. 4, p. 488–491, 1959.
DINTZIS, H. M.; DINTZIS, R. Z.; VOGELSTEIN, B. Molecular determinants of
immunogenicity: the immunon model of immune response. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, v. 73, n. 10, p. 3671–3675, 1976.
DURBIN, A. P.; KARRON, R. A.; SUN, W.; et al. Attenuation and immunogenicity in
humans of a live dengue virus type-4 vaccine candidate with a 30 nucleotide deletion in its 3’-
untranslated region. The American journal of tropical medicine and hygiene, v. 65, n. 5, p.
405–413, 2001.
DURBIN, A. P.; KIRKPATRICK, B. D.; PIERCE, K. K.; et al. A single dose of any of four
different live attenuated tetravalent dengue vaccines is safe and immunogenic in flavivirus-
naive adults: a randomized, double-blind clinical trial. The Journal of infectious diseases, v.
207, n. 6, p. 957–965, 2013.
ELGERT, K. D. Immunology: Understanding The Immune System. Hoboken: Wiley-
Blackwel, 2009, 726 p.
FALGOUT, B.; BRAY, M.; SCHLESINGER, J. J.; LAI, C. J. Immunization of mice with
recombinant vaccinia virus expressing authentic dengue virus nonstructural protein NS1
protects against lethal dengue virus encephalitis. Journal of virology, v. 64, n. 9, p. 4356–
4363, 1990.
FIELD, R.; CAMPION, S.; WARREN, C.; MURRAY, C.; CUNNINGHAM, C. Systemic
challenge with the TLR3 agonist poly I:C induces amplified IFNalpha/beta and IL-1beta
responses in the diseased brain and exacerbates chronic neurodegeneration. Brain, behavior,
and immunity, v. 24, n. 6, p. 996–1007, 2010.
60
FRASER, J. E.; RAWLINSON, S. M.; WANG, C.; JANS, D. A.; WAGSTAFF, K. M.
Investigating dengue virus nonstructural protein 5 (NS5) nuclear import. Methods in
molecular biology, v. 1138, p. 301–328, 2014a.
FRASER, J. E.; RAWLINSON, S. M.; WANG, C.; JANS, D. A.; WAGSTAFF, K. M.
Investigating dengue virus nonstructural protein 5 (NS5) nuclear import. Methods in
molecular biology, v. 1138, p. 301–328, 2014b.
GALEA, I.; BECHMANN, I.; PERRY, V. H. What is immune privilege (not)? Trends in
immunology, v. 28, n. 1, p. 12–18, 2007.
GAO, G.; WANG, Q.; DAI, Z.; et al. Adenovirus-based vaccines generate cytotoxic T
lymphocytes to epitopes of NS1 from dengue virus that are present in all major serotypes.
Human gene therapy, v. 19, n. 9, p. 927–936, 2008.
GUPTA, R. K.; SIBER, G. R. Adjuvants for human vaccines: current status, problems and
future prospects. Vaccine, v. 13, n. 14, p. 1263–1276, 1995.
GUY, B.; BARRERE, B.; MALINOWSKI, C.; et al. From research to phase III: preclinical,
industrial and clinical development of the Sanofi Pasteur tetravalent dengue vaccine. Vaccine,
v. 29, n. 42, p. 7229–7241, 2011.
GUY, B.; SAVILLE, M.; LANG, J. Development of Sanofi Pasteur tetravalent dengue
vaccine. Human vaccines, v. 6, n. 9, p. 325-332, 2010.
GUZMAN, M. G.; HALSTEAD, S. B.; ARTSOB, H.; et al. Dengue: a continuing global
threat. Nature reviews. Microbiology, v. 8, n. 12 Suppl, p. S7–16, 2010.
GUZMAN, M. G.; HARRIS, E. Dengue. Lancet, v. 385, n. 9966, p. 453–465, 2015.
GUZMÁN, M. G.; RODRÍGUEZ, R.; RODRÍGUEZ, R.; et al. Induction of neutralizing
antibodies and partial protection from viral challenge in Macaca fascicularis immunized with
recombinant dengue 4 virus envelope glycoprotein expressed in Pichia pastoris. The
American journal of tropical medicine and hygiene, v. 69, n. 2, p. 129–134, 2003.
HAFNER, A. M.; CORTHÉSY, B.; MERKLE, H. P. Particulate formulations for the delivery
of poly(I:C) as vaccine adjuvant. Advanced drug delivery reviews, v. 65, n. 10, p. 1386–
1399, 2013.
HALSTEAD, S. B. In Vivo Enhancement of Dengue Virus Infection in Rhesus Monkeys by
Passively Transferred Antibody. Journal of Infectious Diseases , v. 140 , n. 4 , p. 527–533,
1979.
HALSTEAD, S. B.; O’ROURKE, E. J. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I.
Infection enhancement by non-neutralizing antibody. The Journal of experimental
medicine, v. 146, n. 1, p. 201–217, 1977.
HALSTEAD, S. B.; O’ROURKE, E. J.; ALLISON, A. C. Dengue viruses and mononuclear
phagocytes. II. Identity of blood and tissue leukocytes supporting in vitro infection. The
Journal of experimental medicine, v. 146, n. 1, p. 218–229, 1977.
61
HALSTEAD, S. B.; PORTERFIELD, J. S.; O’ROURKE, E. J. Enhancement of Dengue Virus
Infection in Monocytes by Flavivirus Antisera. The American Journal of Tropical
Medicine and Hygiene , v. 29 , n. 4 , p. 638–642, 1980.
HANLEY, K. A.; LEE, J. J.; BLANEY, J. E.; MURPHY, B. R.; WHITEHEAD, S. S. Paired
charge-to-alanine mutagenesis of dengue virus type 4 NS5 generates mutants with
temperature-sensitive, host range, and mouse attenuation phenotypes. Journal of virology, v.
76, n. 2, p. 525–531, 2002.
HENDERSON, B. R.; SAEEDI, B. J.; CAMPAGNOLA, G.; GEISS, B. J. Analysis of RNA
binding by the dengue virus NS5 RNA capping enzyme. PloS one, v. 6, n. 10, p. e25795,
2011.
HENRIQUES, H. R.; RAMPAZO, E. V; GONÇALVES, A. J. S.; et al. Targeting the non-
structural protein 1 from dengue virus to a dendritic cell population confers protective
immunity to lethal virus challenge. PLoS neglected tropical diseases, v. 7, n. 7, p. e2330,
2013.
HOLMAN, D. H.; WANG, D.; RAVIPRAKASH, K.; et al. Two complex, adenovirus-based
vaccines that together induce immune responses to all four dengue virus serotypes. Clinical
and vaccine immunology, v. 14, n. 2, p. 182–189, 2007.
HORSTICK, O.; FARRAR, J.; LUM, L.; et al. Reviewing the development, evidence base,
and application of the revised dengue case classification. Pathogens and global health, v.
106, n. 2, p. 94–101, 2012.
JIN, B.; WANG, R. Y.; QIU, Q.; et al. Induction of potent cellular immune response in mice
by hepatitis C virus NS3 protein with double-stranded RNA. Immunology, v. 122, n. 1, p.
15–27, 2007.
JOLY, E.; MUCKE, L.; OLDSTONE, M. B. Viral persistence in neurons explained by lack of
major histocompatibility class I expression. Science, v. 253, n. 5025, p. 1283–1285, 1991.
KÄGI, D.; LEDERMANN, B.; BÜRKI, K.; ZINKERNAGEL, R. M.; HENGARTNER, H.
Molecular mechanisms of lymphocyte-mediated cytotoxicity and their role in immunological
protection and pathogenesis in vivo. Annual review of immunology, v. 14, p. 207–232,
1996.
KANESA-THASAN, N.; EDELMAN, R.; TACKET, C. O.; et al. Phase 1 studies of Walter
Reed Army Institute of Research candidate attenuated dengue vaccines: selection of safe and
immunogenic monovalent vaccines. The American journal of tropical medicine and
hygiene, v. 69, n. 6 Suppl, p. 17–23, 2003.
KAYAMURO, H.; ABE, Y.; YOSHIOKA, Y.; et al. The use of a mutant TNF-alpha as a
vaccine adjuvant for the induction of mucosal immune responses. Biomaterials, v. 30, n. 29,
p. 5869–5876, 2009.
KEDZIERSKA, K.; GRUTA, N. L. LA; TURNER, S. J.; DOHERTY, P. C. Establishment
and recall of CD8+ T-cell memory in a model of localized transient infection. Immunological
reviews, v. 211, p. 133–145, 2006.
62
KELLY, E. P.; GREENE, J. J.; KING, A. D.; INNIS, B. L. Purified dengue 2 virus envelope
glycoprotein aggregates produced by baculovirus are immunogenic in mice. Vaccine, v. 18, n.
23, p. 2549–2559, 2000.
KNICKELBEIN, J. E.; KHANNA, K. M.; YEE, M. B.; et al. Noncytotoxic lytic granule-
mediated CD8+ T cell inhibition of HSV-1 reactivation from neuronal latency. Science, v.
322, n. 5899, p. 268–271, 2008.
KUHN, R. J.; ZHANG, W.; ROSSMANN, M. G.; et al. Structure of dengue virus:
implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell, v. 108, n. 5, p. 717–725,
2002.
LANCKI, D. W.; HSIEH, C. S.; FITCH, F. W. Mechanisms of lysis by cytotoxic T
lymphocyte clones. Lytic activity and gene expression in cloned antigen-specific CD4+ and
CD8+ T lymphocytes. Journal of immunology, v. 146, n. 9, p. 3242–3249, 1991.
LANCKI, D. W.; KAPER, B. P.; FITCH, F. W. The requirements for triggering of lysis by
cytolytic T lymphocyte clones. II. Cyclosporin A inhibits TCR-mediated exocytosis by only
selectively inhibits TCR-mediated lytic activity by cloned CTL. Journal of immunology, v.
142, n. 2, p. 416–424, 1989.
LESCAR, J.; LUO, D.; XU, T.; et al. Towards the design of antiviral inhibitors against
flaviviruses: the case for the multifunctional NS3 protein from Dengue virus as a target.
Antiviral research, v. 80, n. 2, p. 94–101, 2008.
LIU, T.; CHAMBERS, T. J. Yellow fever virus encephalitis: properties of the brain-
associated T-cell response during virus clearance in normal and gamma interferon-deficient
mice and requirement for CD4+ lymphocytes. Journal of virology, v. 75, n. 5, p. 2107–2118,
2001.
LUNDEGAARD, C.; LAMBERTH, K.; HARNDAHL, M.; et al. NetMHC-3.0: accurate web
accessible predictions of human, mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of
length 8-11. Nucleic acids research, v. 36, n. p. 509–12, 2008.
LUO, D.; XU, T.; HUNKE, C.; et al. Crystal structure of the NS3 protease-helicase from
dengue virus. Journal of virology, v. 82, n. 1, p. 173–183, 2008.
LUO, D.; XU, T.; WATSON, R. P.; et al. Insights into RNA unwinding and ATP hydrolysis
by the flavivirus NS3 protein. The EMBO journal, v. 27, n. 23, p. 3209–3219, 2008.
MALYALA, P.; SINGH, M. Endotoxin limits in formulations for preclinical research.
Journal of pharmaceutical sciences, v. 97, n. 6, p. 2041–2044, 2008.
MANI, S.; TRIPATHI, L.; RAUT, R.; et al. Pichia pastoris-expressed dengue 2 envelope
forms virus-like particles without pre-membrane protein and induces high titer neutralizing
antibodies. PloS one, v. 8, n. 5, p. e64595, 2013.
MEDANA, I.; MARTINIC, M. A.; WEKERLE, H.; NEUMANN, H. Transection of major
histocompatibility complex class I-induced neurites by cytotoxic T lymphocytes. The
American journal of pathology, v. 159, n. 3, p. 809–815, 2001.
63
MEN, R.; BRAY, M.; CLARK, D.; CHANOCK, R. M.; LAI, C. J. Dengue type 4 virus
mutants containing deletions in the 3’ noncoding region of the RNA genome: analysis of
growth restriction in cell culture and altered viremia pattern and immunogenicity in rhesus
monkeys. Journal of virology, v. 70, n. 6, p. 3930–3937, 1996.
MLADINICH, K. M.; PIASKOWSKI, S. M.; RUDERSDORF, R.; et al. Dengue virus-
specific CD4+ and CD8+ T lymphocytes target NS1, NS3 and NS5 in infected Indian rhesus
macaques. Immunogenetics, v. 64, n. 2, p. 111–121, 2012.
MORRISON, D.; LEGG, T. J.; BILLINGS, C. W.; et al. A novel tetravalent dengue vaccine
is well tolerated and immunogenic against all 4 serotypes in flavivirus-naive adults. The
Journal of infectious diseases, v. 201, n. 3, p. 370–377, 2010.
MOSEMAN, E. A.; MCGAVERN, D. B. The great balancing act: regulation and fate of
antiviral T-cell interactions. Immunological reviews, v. 255, n. 1, p. 110–124, 2013.
MOSMANN, T. R.; COFFMAN, R. L. TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine
secretion lead to different functional properties. Annual review of immunology, v. 7, p. 145–
173, 1989.
MOUTAFTSI, M.; PETERS, B.; PASQUETTO, V.; et al. A consensus epitope prediction
approach identifies the breadth of murine T(CD8+)-cell responses to vaccinia virus. Nature
biotechnology, v. 24, n. 7, p. 817–819, 2006.
MURALI-KRISHNA, K.; RAVI, V.; MANJUNATH, R. Protection of adult but not newborn
mice against lethal intracerebral challenge with Japanese encephalitis virus by adoptively
transferred virus-specific cytotoxic T lymphocytes: requirement for L3T4+ T cells. The
Journal of general virology, v. 77 ( Pt 4), p. 705–714, 1996.
MYERS, R. M.; CAREY, D. E.; RODRIGUES, F. M.; KLONTZ, C. E. THE ISOLATION
OF DENGUE TYPE 4 VIRUS FROM HUMAN SERA IN SOUTH INDIA. The Indian
journal of medical research, v. 52, p. 559–565, 1964.
NAGLER-ANDERSON, C.; LICHTENHELD, M.; EISEN, H. N.; PODACK, E. R. Perforin
mRNA in primary peritoneal exudate cytotoxic T lymphocytes. Journal of immunology, v.
143, n. 11, p. 3440–3443, 1989.
NORDLY, P.; ROSE, F.; CHRISTENSEN, D.; et al. Immunity by formulation design:
induction of high CD8+ T-cell responses by poly(I:C) incorporated into the CAF01 adjuvant
via a double emulsion method. Journal of controlled release, v. 150, n. 3, p. 307–317, 2011.
OSORIO, J. E.; HUANG, C. Y.-H.; KINNEY, R. M.; STINCHCOMB, D. T. Development of
DENVax: a chimeric dengue-2 PDK-53-based tetravalent vaccine for protection against
dengue fever. Vaccine, v. 29, n. 42, p. 7251–7260, 2011.
PONGSUMPUN, P.; GARCIA LOPEZ, D.; FAVIER, C.; et al. Dynamics of dengue
epidemics in urban contexts. Tropical medicine & international health, v. 13, n. 9, p. 1180–
1187, 2008.
64
PUTNAK, R.; BARVIR, D. A.; BURROUS, J. M.; et al. Development of a purified,
inactivated, dengue-2 virus vaccine prototype in Vero cells: immunogenicity and protection in
mice and rhesus monkeys. The Journal of infectious diseases, v. 174, n. 6, p. 1176–1184,
1996.
RAJA, N. U.; HOLMAN, D. H.; WANG, D.; et al. Induction of bivalent immune responses
by expression of dengue virus type 1 and type 2 antigens from a single complex adenoviral
vector. The American journal of tropical medicine and hygiene, v. 76, n. 4, p. 743–751,
2007.
RAVIPRAKASH, K.; APT, D.; BRINKMAN, A.; et al. A chimeric tetravalent dengue DNA
vaccine elicits neutralizing antibody to all four virus serotypes in rhesus macaques. Virology,
v. 353, n. 1, p. 166–173, 2006.
RAVIPRAKASH, K.; WANG, D.; EWING, D.; et al. A tetravalent dengue vaccine based on
a complex adenovirus vector provides significant protection in rhesus monkeys against all
four serotypes of dengue virus. Journal of virology, v. 82, n. 14, p. 6927–6934, 2008.
REMAKUS, S.; SIGAL, L. J. Memory CD8+ T cell protection. Advances in experimental
medicine and biology, v. 785, p. 77–86, 2013.
RIVINO, L.; KUMARAN, E. A. P.; JOVANOVIC, V.; et al. Differential targeting of viral
components by CD4+ versus CD8+ T lymphocytes in dengue virus infection. Journal of
virology, v. 87, n. 5, p. 2693–2706, 2013.
RIVINO, L.; KUMARAN, E. A.; THEIN, T.-L.; et al. Virus-specific T lymphocytes home to
the skin during natural dengue infection. Science Translational Medicine, v. 7, n. 278, p.
27835–27842, 2015.
RODENHUIS-ZYBERT, I. A; WILSCHUT, J.; SMIT, J. M. Dengue virus life cycle: viral
and host factors modulating infectivity. Cellular and molecular life sciences, v. 67, n. 16, p.
2773–2786, 2010.
SABIN, A. B. Research on dengue during World War II. The American journal of tropical
medicine and hygiene, v. 1, n. 1, p. 30–50, 1952.
SALEM, M. L.; DIAZ-MONTERO, C. M.; EL-NAGGAR, S. A.; et al. The TLR3 agonist
poly(I:C) targets CD8+ T cells and augments their antigen-specific responses upon their
adoptive transfer into naïve recipient mice. Vaccine, v. 27, n. 4, p. 549–557, 2009.
SAMBROOK, J.; RUSSELL, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.. Cold
Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. v.1, 2344 p.
SANCHEZ, V.; GIMENEZ, S.; TOMLINSON, B.; et al. Innate and adaptive cellular
immunity in flavivirus-naïve human recipients of a live-attenuated dengue serotype 3 vaccine
produced in Vero cells (VDV3). Vaccine, v. 24, n. 23, p. 4914–4926, 2006.
SCHIJNS, V. E. J. C.; LAVELLE, E. C. Trends in vaccine adjuvants. Expert review of
vaccines, v. 10, n. 4, p. 539–550, 2011.
65
SCHLOSSER, E.; MUELLER, M.; FISCHER, S.; et al. TLR ligands and antigen need to be
coencapsulated into the same biodegradable microsphere for the generation of potent
cytotoxic T lymphocyte responses. Vaccine, v. 26, n. 13, p. 1626–1637, 2008.
SCHUCH, A.; HOH, A.; THIMME, R. The role of natural killer cells and CD8(+) T cells in
hepatitis B virus infection. Frontiers in immunology, v. 5, p. 258-264, 2014.
SCHWARZ, H.; SCHMITTNER, M.; DUSCHL, A.; HOREJS-HOECK, J. Residual
endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+
dendritic cells. PloS one, v. 9, n. 12, p. e113840, 2014.
SHATZ, C. J. MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity. Neuron, v. 64, n. 1, p.
40–45, 2009.
SIMMONS, M.; BURGESS, T.; LYNCH, J.; PUTNAK, R. Protection against dengue virus
by non-replicating and live attenuated vaccines used together in a prime boost vaccination
strategy. Virology, v. 396, n. 2, p. 280–288, 2010.
SITATI, E. M.; DIAMOND, M. S. CD4+ T-cell responses are required for clearance of West
Nile virus from the central nervous system. Journal of virology, v. 80, n. 24, p. 12060–
12069, 2006.
SMITH, C. E. G. Isolation of three strains of type 1 dengue virus from a local outbreak of the
disease in Malaya. The Journal of hygiene, v. 54, n. 4, p. 569–580, 1956.
SPAULDING, A. C.; KURANE, I.; ENNIS, F. A.; ROTHMAN, A. L. Analysis of murine
CD8(+) T-cell clones specific for the Dengue virus NS3 protein: flavivirus cross-reactivity
and influence of infecting serotype. Journal of virology, v. 73, n. 1, p. 398–403, 1999a.
SPAULDING, A. C.; KURANE, I.; ENNIS, F. A.; ROTHMAN, A. L. Analysis of murine
CD8(+) T-cell clones specific for the Dengue virus NS3 protein: flavivirus cross-reactivity
and influence of infecting serotype. Journal of virology, v. 73, n. 1, p. 398–403, 1999b.
SRIKIATKHACHORN, A.; ROTHMAN, A. L.; GIBBONS, R. V; et al. Dengue--how best to
classify it. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases
Society of America, v. 53, n. 6, p. 563–567, 2011.
TAKAHASHI, H.; TAKAHASHI, C.; MORELAND, N. J.; et al. Establishment of a robust
dengue virus NS3-NS5 binding assay for identification of protein-protein interaction
inhibitors. Antiviral research, v. 96, n. 3, p. 305–314, 2012.
TAKEUCHI, O.; AKIRA, S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell, v. 140, n.
6, p. 805–820, 2010.
TAN, B. H.; FU, J.; SUGRUE, R. J.; et al. Recombinant dengue type 1 virus NS5 protein
expressed in Escherichia coli exhibits RNA-dependent RNA polymerase activity. Virology,
v. 216, n. 2, p. 317–325, 1996.
66
TANG, Y.-X.; JIANG, L.-F.; ZHOU, J.-M.; et al. Induction of virus-neutralizing antibodies
and T cell responses by dengue virus type 1 virus-like particles prepared from Pichia pastoris.
Chinese medical journal, v. 125, n. 11, p. 1986–1992, 2012.
TAY, M. Y. F.; FRASER, J. E.; CHAN, W. K. K.; et al. Nuclear localization of dengue virus
(DENV) 1-4 non-structural protein 5; protection against all 4 DENV serotypes by the
inhibitor Ivermectin. Antiviral research, v. 99, n. 3, p. 301–306, 2013.
TAY, M. Y. F.; SAW, W. G.; ZHAO, Y.; et al. The C-terminal 50 Amino Acid Residues of
Dengue NS3 Protein Are Important for NS3-NS5 Interaction and Viral Replication. The
Journal of biological chemistry, v. 290, n. 4, p. 2379–2394, 2015.
TEMMERMAN, M.-L. DE; REJMAN, J.; DEMEESTER, J.; et al. Particulate vaccines: on
the quest for optimal delivery and immune response. Drug discovery today, v. 16, n. 13-14,
p. 569–582, 2011.
TROYER, J. M.; HANLEY, K. A.; WHITEHEAD, S. S.; et al. A live attenuated recombinant
dengue-4 virus vaccine candidate with restricted capacity for dissemination in mosquitoes and
lack of transmission from vaccinees to mosquitoes. The American journal of tropical
medicine and hygiene, v. 65, n. 5, p. 414–419, 2001.
TUNG, J. W.; HEYDARI, K.; TIROUVANZIAM, R.; et al. Modern flow cytometry: a
practical approach. Clinics in laboratory medicine, v. 27, n. 3, p. 453–468, v, 2007.
VAUGHN, D. W.; HOKE, C. H.; YOKSAN, S.; et al. Testing of a dengue 2 live-attenuated
vaccine (strain 16681 PDK 53) in ten American volunteers. Vaccine, v. 14, n. 4, p. 329–336,
1996.
VOULGARIDOU, G.-P.; MANTSO, T.; CHLICHLIA, K.; PANAYIOTIDIS, M. I.; PAPPA,
A. Efficient E. coli expression strategies for production of soluble human crystallin
ALDH3A1. PloS one, v. 8, n. 2, p. e56582, 2013.
WADA, T.; KOHARA, M.; YASUTOMI, Y. DNA vaccine expressing the non-structural
proteins of hepatitis C virus diminishes the expression of HCV proteins in a mouse model.
Vaccine, v. 31, n. 50, p. 5968–5974, 2013.
WAKELIN, S. J.; SABROE, I.; GREGORY, C. D.; et al. “Dirty little secrets”--endotoxin
contamination of recombinant proteins. Immunology letters, v. 106, n. 1, p. 1–7, 2006.
WANG, P.; SIDNEY, J.; DOW, C.; et al. A systematic assessment of MHC class II peptide
binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS computational biology, v.
4, n. 4, p. e1000048, 2008.
WANG, P.; SIDNEY, J.; KIM, Y.; et al. Peptide binding predictions for HLA DR, DP and
DQ molecules. BMC bioinformatics, v. 11, p. 568-572, 2010.
WEISKOPF, D.; ANGELO, M. A.; BANGS, D. J.; et al. The human CD8+ T cell responses
induced by a live attenuated tetravalent dengue vaccine are directed against highly conserved
epitopes. Journal of virology, v. 89, p. 120-128, 2014.
67
WHITE, L. J.; PARSONS, M. M.; WHITMORE, A. C.; et al. An immunogenic and
protective alphavirus replicon particle-based dengue vaccine overcomes maternal antibody
interference in weanling mice. Journal of virology, v. 81, n. 19, p. 10329–10339, 2007.
WHITEHEAD, S. S.; BLANEY, J. E.; DURBIN, A. P.; MURPHY, B. R. Prospects for a
dengue virus vaccine. Nature reviews. Microbiology, v. 5, n. 7, p. 518–528, 2007.
WHITEHEAD, S. S.; FALGOUT, B.; HANLEY, K. A.; et al. A live, attenuated dengue virus
type 1 vaccine candidate with a 30-nucleotide deletion in the 3’ untranslated region is highly
attenuated and immunogenic in monkeys. Journal of virology, v. 77, n. 2, p. 1653–1657,
2003.
WHITEHEAD, S. S.; HANLEY, K. A.; BLANEY, J. E.; et al. Substitution of the structural
genes of dengue virus type 4 with those of type 2 results in chimeric vaccine candidates which
are attenuated for mosquitoes, mice, and rhesus monkeys. Vaccine, v. 21, n. 27-30, p. 4307–
4316, 2003.
WHO. Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control - New edition.
Disponível em:
<http://whqlibdoc.who.int/publications/2009/9789241547871_eng.pdf?ua=1>. Acesso em:
15/8/2014.
WILLIAMS, N. S.; ENGELHARD, V. H. Identification of a population of CD4+ CTL that
utilizes a perforin- rather than a Fas ligand-dependent cytotoxic mechanism. Journal of
immunology, v. 156, n. 1, p. 153–159, 1996.
WOODLAND, D. L. Jump-starting the immune system: Prime-boosting comes of age.
Trends in Immunology, v. 25, n. 2, p. 98–104, 2004.
WORTZMAN, M. E.; CLOUTHIER, D. L.; MCPHERSON, A. J.; LIN, G. H. Y.; WATTS,
T. H. The contextual role of TNFR family members in CD8(+) T-cell control of viral
infections. Immunological reviews, v. 255, n. 1, p. 125–148, 2013.
WRIGHT, S.; RAMOS, R.; TOBIAS, P.; ULEVITCH, R.; MATHISON, J. CD14, a receptor
for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. Science, v. 249, n. 4975,
p. 1431–1433, 1990.
WU, S.-F.; LIAO, C.-L.; LIN, Y.-L.; et al. Evaluation of protective efficacy and immune
mechanisms of using a non-structural protein NS1 in DNA vaccine against dengue 2 virus in
mice. Vaccine, v. 21, n. 25-26, p. 3919–3929, 2003a.
WU, S.-F.; LIAO, C.-L.; LIN, Y.-L.; et al. Evaluation of protective efficacy and immune
mechanisms of using a non-structural protein NS1 in DNA vaccine against dengue 2 virus in
mice. Vaccine, v. 21, n. 25-26, p. 3919–3929, 2003b.
YAP, T. L.; XU, T.; CHEN, Y.-L.; et al. Crystal structure of the dengue virus RNA-
dependent RNA polymerase catalytic domain at 1.85-angstrom resolution. Journal of
virology, v. 81, n. 9, p. 4753–4765, 2007.
68
YUN, N. E.; PENG, B.-H.; BERTKE, A. S.; et al. CD4+ T cells provide protection against
acute lethal encephalitis caused by Venezuelan equine encephalitis virus. Vaccine, v. 27, n.
30, p. 4064–4073, 2009.
ZHANG, X.; SHENG, J.; AUSTIN, S. K.; et al. Structure of acidic pH dengue virus showing
the fusogenic glycoprotein trimers. Journal of virology, v. 89, n. 1, p. 743–750, 2015.
ZHANG, Y. M.; HAYES, E. P.; MCCARTY, T. C.; et al. Immunization of mice with dengue
structural proteins and nonstructural protein NS1 expressed by baculovirus recombinant
induces resistance to dengue virus encephalitis. Journal of virology, v. 62, n. 8, p. 3027–
3031, 1988.
ZHOU, Y.; RAY, D.; ZHAO, Y.; et al. Structure and function of flavivirus NS5
methyltransferase. Journal of virology, v. 81, n. 8, p. 3891–3903, 2007.
