ESTUDO IN VITRO DE Ageratum fastigiatum EM ELEMENTOS DO ... · 24 a 27 de Agosto de 2016, Foz do...

ESTUDO IN VITRO DE Ageratum fastigiatum EM ELEMENTOS DO

CITOESQUELETO E INTEGRINAS DE MEMBRANA DE LINFÓCITOS

HUMANOS

P. G. M. de Alvarenga¹; M. H. F. Ottoni²; B. E. Souza¹; B. A. Avelar-Freitas²;

J.V.W. Silveira¹; A. B. Meireles²; C. F. F. Grael²; G. E. A. Brito-Melo²; L. A.

Gonzáles-Torres¹

¹Instituto de Ciência e Tecnologia – Universidade Federal dos Vales do

Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM)

²Departamento de Farmácia – Universidade Federal dos Vales do

Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM)

Rodovia MGT 367, Km 583, nº 5000 - Diamantina - MG, 39100-000

E-mail: [email protected]

RESUMO

Extratos de Ageratum fastigiatum são utilizados na medicina popular

para tratar dores e inflamações. Entretanto, o mecanismo envolvido na ação

anti-inflamatória da planta, ainda não foi devidamente elucidado. O objetivo

deste estudo é analisar a influência do óleo essencial de A. fastigiatum sobre

integrinas de membrana, bem como sobre a conformação celular, utilizando

métodos de citometria de fluxo e microscopia óptica. Os resultados indicam que

o óleo essencial de A. fastigiatum reduz a expressão de CD18, marcador de

integrinas da membrana linfocitária. Além disso, pode modificar a estrutura do

citoesqueleto, permitindo dessa forma interferir no mecanismo de migração

celular. A compreensão desse fenômeno pode auxiliar no desenvolvimento de

métodos de tratamento e diagnóstico de doenças do sistema imune.

Palavras chave: leucócitos, imunologia, citometria de fluxo, migração celul

9º Congresso Latino-Americano de Orgãos Artificiais e Biomateriais13º Congresso da Sociedade Latino Americana de Biomateriais, Orgãos Artificiais e Engenharia de Tecidos - SLABO

24 a 27 de Agosto de 2016, Foz do Iguaçu, PR

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INTRODUÇÃO

O Ageratum fastigiatum (Gardner) R. M. King & H. Rob. (Asteraceae),

conhecida popularmente no estado de Minas Gerais - Brasil como “matapasto”

ou "enxota", é utilizada na medicina popular como anti-inflamatório e

analgésico (2) (7). Seu extrato é preparado a partir de folhas e ramos frescos

picados e submetidos a maceração ou decocção. O extrato aquoso, após

filtração, é aplicado topicamente para tratar dor e inflamações. O óleo essencial

pode ser obtido através de processos de hidrodestilação. Foi demonstrado in

vivo, que o óleo essencial dessa planta tem um efeito anti-inflamatório e

analgésico, através da redução de edema e da migração leucocitária induzidos

em modelo animal (7). Contudo, os mecanismos envolvidos na ação anti-

inflamatória da planta ainda não foram bem elucidados.

Alguns estudos demonstraram o efeito do óleo essencial de A. fastigiatum

na redução de linfócitos e neutrófilos que produziram a citocina TNF-α (5), um

mediador importante na resposta imune inflamatória, capaz de induzir a

expressão de moléculas de adesão no endotélio, favorecendo o recrutamento

celular para o sítio da inflamação (3) (9). Contudo, nenhum estudo avaliou o

efeito do óleo essencial da planta sobre integrinas de membrana leucocitárias

envolvidas na migração celular e nos arranjos de elementos do citoesqueleto.

Tendo em vista a ação anti-inflamatória de A. fastigiatum e seu potencial de

atuar sobre leucócitos, o objetivo desse estudo foi investigar o efeito do óleo

essencial de A. fastigiatum sobre a expressão de CD18, marcador de integrinas

de membrana leucocitárias, bem como avaliar mudanças geométricas nas

células de culturas de células mononucleares do sangue periférico humano in

vitro. As dimensões geométricas são avaliadas, devido à possível mudanças

causadas por alterações no citoesqueleto.

MATERIAIS E MÉTODOS

Obtenção e análise química do óleo essencial

O material vegetal fresco foi cominuído e a extração de seu óleo essencial

foi realizada através de aparato de Clevenger, por 2 h(6). O óleo essencial foi



1166

acondicionado em frasco tipo eppendorff e conservado a –20°C até o momento

de análise química. A identificação dos constituintes químicos do óleo

essencial foi realizada com base nos dados de análises através de

cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM). Foram realizadas

duas análises sob as mesmas condições experimentais: uma análise do óleo

essencial sem a adição de nenhuma substância e outra análise do óleo

essencial misturado com uma série homóloga de hidrocarbonetos (C7 a C40 -

padrões de hidrocarbonetos saturados dissolvidos em hexano). A partir da

primeira injeção do óleo essencial foram obtidos os espectros de massas dos

componentes químicos. A segunda injeção foi realizada para se obter tempos

de retenção dos constituintes químicos e dos hidrocarbonetos para se calcular

o índice de retenção relativa, de acordo com a equação (A) (4).

(A)

Onde:

IRR = número do índice de retenção relativa;

n = número de átomos de carbono do hidrocarboneto eluído imediatamente

antes do composto “x” de interesse;

tn e tn+1 = tempos de retenção dos hidrocarbonetos eluídos imediatamente

antes e após o composto “x” de interesse, respectivamente;

tx = tempo de retenção do composto “x”.

Os espectros interpretados e os IRR calculados foram comparados com

dados da literatura (1) e de sites especializados e de acesso livre

(http://www.pherobase.com/ e http://www.flavornet.org/flavornet.html) para se

confirmar a identificação dos componentes químicos do óleo analisado. Os

espectros obtidos experimentalmente foram comparados a espectros contidos

na espectroteca (NIST).

Análise da viabilidade de leucócitos do sangue periférico tratados in vitro

com diferentes concentrações do óleo essencial de Ageratum fastigiatum

Para avaliar o efeito do óleo essencial da A. fastigiatum sobre a

viabilidade dos leucócitos, 5x106 células foram incubadas com meio RPMI



1167

(acrescido de soro humano (10%), L-glutamina (1%) e coquetel antibiótico e

antimicótico (1%)) e tratadas com óleo essencial nas concentrações finais de

25x10-3 μL/mL, 12,5x103 μL/mL e 6,25x10-3 μL/mL por 5 dias, em estufa com

5% de CO2 e 37ºC. Culturas celulares contendo apenas RPMI e culturas

acrescidas de dimetilsulfóxido (DMSO) constituíram a cultura controle e

controle do solvente, respectivamente. O óleo essencial à 25x10-3 μL/mL. Após

o período de incubação as células foram removidas da placa por lavagem com

tampão fosfato salina (PBS) gelado, centrifugadas a 200 G, 10 min, 4ºC. O

precipitado foi suspenso em PBS para avaliação da viabilidade pela técnica de

exclusão de azul de tripan por citometria de fluxo (5). A viabilidade celular foi

determinada pelo percentual de células viáveis no universo de células totais,

coradas (inviáveis) e não coradas (viáveis).

Estimulação das células com óleo essencial

Inicialmente foram testados dois protocolos, sendo o primeiro com

estimulação de sangue total por 4 h e o segundo estimulação de células

mononucleares do sangue periférico (PBMC) por 24 h.

Cultura de sangue total

Para teste do protocolo 500 μL de sangue total foram estimulados ou não

com PMA-ionomicina (25 ng/mL). As culturas permaneceram por 4 h em estufa

úmida a 37ºC e 5 % de CO2. Em seguida, as amostras foram submetidas à lise

das hemácias por adição de uma solução de lise eritrocitária e incubadas à

temperatura ambiente por 15 min. Após a incubação, as amostras foram

centrifugadas, o sobrenadante descartado e as células suspensas em PBS

(PBS 0,015 M pH 7,4). As células foram então marcadas com anticorpos

monoclonais anti-CD18 conjugados com phycoerythrin (PE) por 30 min.

Terminada a incubação, as células foram lavadas com PBS e avaliadas por

citometria de fluxo (FACScanto - Becton Dickinson), procedendo-se a aquisição

de 30.000 eventos por tubo.

Cultura de Células mononucleares do sangue periférico (PBMC)



1168

As PBMCs foram obtidas a partir de sangue periférico venoso após

centrifugação em Histopaque 1077 (Sigma, St. Louis, MO, USA). O anel de

PBMC, formado após a centrifugação, foi recolhido e lavado duas vezes em

PBS. O precipitado de células foi em seguida suspenso em 1 mL de PBS/BSA

1% ou RPMI (Sigma, St. Louis, MO, USA). Após contagem das células em

câmara hemocitométrica de Neubauer, as células foram novamente

centrifugadas e suspensas em PBS/BSA 1% ou RPMI (Sigma, St. Louis, MO,

USA) suplementado com L-glutamina (Sigma, St. Louis, MO, USA) (2 mM), e

coquetel antibiótico/antimicótico (penicilina G 100 UI/mL, estreptomicina

100 µg/mL e anfotericina B 250 ng/mL - Sigma, St. Louis, MO, USA) na

concentração de 1x107 células/mL.

A partir de um volume de 50 μL, 5x105 células foram incubadas em

RPMI da suspensão celular. As culturas tratadas com os produtos naturais

foram estimuladas ou não com o PMA. A cultura estimulada com PMA

constituiu o controle positivo. As células foram incubadas por 24 h em estufa

úmida, a 37ºC contendo 5% de CO2. Após o período de incubação, as células

foram lavadas duas vezes com PBS. Foi realizada a marcação com anticorpos

anti-CD18 e realizada a leitura de 30.000 eventos por citometria.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Análise da composição do óleo essencial de A. fastigiatum

A análise da cromatografia gasosa revelou a presença das substâncias

listadas na Tabela 1. Das substâncias elucidadas, as que se encontram em

maiores concentrações são o germacreno e α-pineno, os quais já foram

encontradas em outras amostras do óleo essencial desta planta (5)(7).



1169

Tabela 1: Substâncias presentes no óleo essencial

Composto identificado Tempo de

retenção (min)

IRR

calculado

IRR

literatura Área do pico*

α-pineno 6,90 934,9 932 143.331.056

β-pineno 8,22 979,1 974 16.696.142

β-mirceno 8,55 990,3 988 4.322.807

d-limoneno 9,96 1029,6 1024 87.911.992

β-ocimeno 10,60 1046,6 1044 11.151.418

α-copaeno 24,45 1379,7 1374 9.273.628

4,8-β-epóxi-cariofileno 26,31 1425,1 1423 64.096.240

Germacreno 28,82 1487,6 1484 151.216.768

Biciclogermacreno 29,43 1502,9 1500 12.008.181

NI 34,17 1627,7 - 81.561.200

NI 34,93 1648,5 - 8.961.346

NI 40,92 1819,0 - 19.160.288

*Área absoluta do pico no cromatograma; corrente de íons total, sem padronização;

NI= não identificado.

Análise da viabilidade de leucócitos do sangue periférico tratados in vitro

com diferentes concentrações do óleo essencial de Ageratum fastigiatum.

A viabilidade celular foi determinada pelo percentual de células viáveis

no universo de células totais, coradas (inviáveis) e não coradas (viáveis). Os

resultados indicaram que o tratamento com até 25x10-3 μL/mL do óleo

essencial de A. fastigiatum em DMSO, em cultura celular não altera a

viabilidade dos linfócitos para culturas com incubação de 5 dias. De tal forma,



1170

todas as concentrações utilizadas em tais testes foram consideradas de baixa

toxicidade (Figura 1).

Controle DMSO 25 12,5 6,25

Óleo Essencial de A. fastigiatum

x10-3 μL/mL

0

1

2

3

% C

élu

las I

nviá

veis

Figura 1: Percentual de células inviáveis após incubação com concentrações

do óleo essencial A. fastigiatum por cinco dias. Anova seguida de Tukey, n=4.

Até o momento o que se pode concluir é que o óleo essencial na

concentração de 25x10-3 μL/mL não foi tóxico e, portanto, é a primeira

concentração a ser utilizada nos ensaios de inibição da expressão de

moléculas de adesão como a CD18.

Resultados da padronização do experimento para escolha do uso de

Sangue Total ou PBMC

Os resultados com sangue total indicaram que após 4 horas e incubação

e análise dos linfócitos o PMA não foi capaz de induzir o aumento na

expressão de citocinas. O percentual de células CD18+, bem como a

intensidade de fluorescência das culturas estimuladas e não estimuladas foram

semelhantes. Portanto o estimulo do PMA (25 ng/mL) por quatro horas não

produziu o efeito desejado (Figura 2).



1171

Figura 2: Resultado da padronização do estimulo do PMA por 4 h em sangue

total para expressão de CD18 na cultura não estimulada (A) e estimulada (B).

Já a análise com PBMC indicou que após 24 h de incubação foi possível

observar o efeito do PMA na indução da expressão de CD18 em linfócitos

(Figura 3). Portanto os testes para verificação do efeito do óleo essencial de A.

fastigiatum foram realizados com o a incubação de 24 h. Tendo em vista que

os neutrófilos e hemácias presentes no sangue total possuem tempo de vida

limitado em culturas, para incubação de 24 h foram utilizadas células PBMC’s.

Figura 3: Resultado da padronização do estimulo do PMA por 24 h em sangue

PBMC na expressão de CD18 na cultura não estimulada (A) e estimulada (B).



1172

Expressão de CD18 em linfócitos estimulados com PMA e tratados com

o óleo essencial de A. fastigiatum

O CD18 representa uma família de integrinas expressas na superfície de

leucócitos que vão auxiliar na adesão dos leucócitos para a diapedese e

migração nos tecidos. Na inflamação ocorre uma alta taxa de migração celular,

a fim de restaurar a homeostase tecidual. No entanto, em algumas doenças

autoimunes é necessária a intervenção farmacológica para cessar os efeitos da

inflamação. Os resultados indicaram que o óleo essencial na 1/160 reduziu a

intensidade de fluorescência das células marcadas com anti-CD18, o que

demonstra que as células tratadas com o óleo essencial da planta reduziram o

efeito provocado pelo PMA de induzir a expressão de CD18 (Figura 4). As

células estimuladas com PMA apresentaram uma intensidade média de

fluorescência (IMF) para a marcação de CD18 no valor de 1008, as células

estimuladas com PMA e tratadas com o óleo essencial apresentaram o valor de

IMF de 619, muito próximo do controle não estimulado IMF 622. É possível

que parte dos mecanismos envolvidos na ação do CD18 sejam medidas pela

diminuição do recrutamento de células inflamatórias para o tecido.

Figura 4: Resultados da Intensidade média de fluorescência (IMF) das culturas

marcadas com anti-CD18 nas culturas: controle não marcado (A), controle

negativo (B), controle positivo estimulado com PMA (C) e cultura teste

estimulada com PMA e tratada com óleo essencial (D).



1173

Análise de alterações no citoesqueleto a partir do diâmetro celular

Utilizando-se o protocolo de obtenção de PBMC, dessa vez, após a

mesma cultura de 24 h, foram feitas análises em microscópio óptico para que

fossem tomadas medidas dos eixos das células. Foi padronizado um número

de dez medidas por amostra (não marcada, não estimulada, controle positivo e

tratada com óleo essencial). A Figura 5 apresenta um comparativo do resultado

médio e do desvio padrão das medições dos diâmetros (em μm).

Figura 5: Diâmetros das células com e sem influência de óleo essencial.

Apesar das análises em citometria de fluxo apresentarem alterações na

intensidade de fluorescência de células marcadas com CD18 quando tratadas

com óleo essencial de A. fastigiatum, não foi possível observar alterações

significativas no tamanho das células. Porém a falta de mudanças morfológicas

perceptíveis se deve ao fato de que essa é uma medida indireta e pouco

sensível para avaliar a deformação do citoesqueleto.

CONCLUSÃO

Sugere-se que o óleo essencial de A. fastigiatum reduz a expressão de

CD18, reduzindo assim a migração linfocitária. Ensaios em microscopia óptica

foram realizados no sentido de avaliar a alteração na conformação celular,

porém em virtude do método pouco sensível, os resultados foram

inconclusivos. Diante dos resultados, é possível inferir, que parte da ação anti-



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inflamatória de A. fastigiatum se dê pela redução da migração celular para o

sítio da inflamação.

AGRADECIMENTOS

Os autores gostariam de agradecer à FAPEMIG e à CNPq pelo suporte

financeiro para a realização desse trabalho e ao laboratório de imunologia da

UFVJM por todo suporte estrutural para o desenvolvimento da pesquisa.

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(9) WAJANT, H. The role of TNF in cancer. Res. Probl Cell Dif.49, 1-15, 2009.

Ageratum fastigiatum IN VITRO STUDY ON CYTOSKELETON ELEMENTS

AND HUMAN INTEGRINS MEMBRANE

ABSTRACT

A. fastigiatum essential extracts are employed to treat pains and inflammations.

Even though, the mechanism, involved in the anti-inflammatory action, is not

elucidated properly. The objective of this study is to analyze the influence of

different essential oils contents over the leucocytes internal structure, by the flux

cytometry and optical microscopy methods. Results showed that the A.

Fastigiatum reduces the CD18 expression, an integrin marker from lymphocyte

membrane. Also, it could modify the cytoskeleton structure, interfering in the cell

migration mechanism. The comprehension of this phenomena can help the

development of diagnosis and treatment methods for immunological system

diseases.

Key words: Leucocytes, immunology, flux cytometry, cell migration.



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