PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE FARMÁCIA

RICARDO VIEIRA REICHELT

ESTUDOS DE DEGRADAÇÃO FORÇADA: CONSIDERAÇÕES ANALÍTICAS DA VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA NA ANÁLISE DE MEDICAMENTOS

Porto Alegre

2014

RICARDO VIEIRA REICHELT

ESTUDOS DE DEGRADAÇÃO FORÇADA: CONSIDERAÇÕES ANALÍTICAS DA VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA NA ANÁLISE DE MEDICAMENTOS

Trabalho de conclusão de curso apresentado como requisito para obtenção do grau de Bacharel em Farmácia, pela Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.

Orientador: Prof. Dr. Pablo Machado

Porto Alegre

2014

“De um certo ponto adiante não há mais retorno. Esse é o ponto que deve ser

alcançado.”

Franz Kafka

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer, primeiramente, aos meus pais Maria Eugênia e

Marco Ântonio por terem me dado o direito à vida. A única forma que eu tenho de

demonstrar minha gratidão é sempre dando meu melhor em tudo que faço. A Analú

Oliveira dos Santos, mãe do meu filho, Théo, os quais amo incondicionalmente. Só

posso agradecer por teres me tirado do fundo de um poço escuro e trazido de volta,

quando nada mais parecia fazer sentido. A minha vó Lourdes por me dar conforto e

acolhimento quando eu saí de casa sem rumo. Ao Sr. André Palácio por me ensinar

o significado de responsabilidade e liberdade.

A todos os meus amigos que hoje, mesmo longe, me incentivaram a

continuar em frente. Aos meus irmãos de sempre, Victória, Guilherme e Gustavo.

Aos professores e funcionários do LAIF que me acolheram de uma forma paternal

dando-me uma oportunidade única de conhecimento.

E a Deus, a quem me refugiei nos momentos mais difíceis.

RESUMO

Estudos de degradação forçada são métodos complementares delineados para

produzir um método indicador de estabilidade. Os insumos farmacêuticos ativos e os

produtos acabados são forçados em condições mais extremas que os testes de

estabilidade de longa duração. Em dezembro de 2013, a ANVISA regulamentou a

RDC 58/2013 que irá tornar obrigatório os estudos de degradação forçada. No

entanto a legislação não especifica as condições a serem empregadas. Os guias

disponíveis para a montagem das estratégias dos estudos são vagos, e não

oferecem um padrão de condições analíticas. Este guia tem como objetivo auxiliar

na escolha das condições de degradação desde os estudos preliminares até a

interpretação dos resultados encontrados.

Palavras-chave: degradação forçada, ANVISA, HPLC

ABSTRACT

Keywords:.forced degradation, ANVISA, HPLC

Forced degradation studies are complementary methods designed to produce a

stability indicator method. The active pharmaceutical ingredients and drug products

are forced into the most extreme conditions than the long term stability test. In

December 2013, with the publication of RDC 58/2013, in two years, ANVISA will

becomes mandatory forced degradation studies. However the legislation does not

specify the conditions to be employed. The guides available for conducting the

strategies of the studies are vague and do not provide a standard of analytical

conditions. This guide aims to assist since choosing the conditions of degradation

studies until the interpretation of results.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Publicações sobre degradação forçada entre 2008 e 2012......................13

Figura 2 – Modelo sugerido para estudos de degradação forçada por

hidróliseácida/básica..................................................................................................15

Figura 3 – Sequência da reação em cadeia mediada por radicais livres..................16

Figura 4 - Mecanismo de formação de radicais peróxidos através do AIBN.............18

Figura 5 – Formação de radicais hidroxila a partir do peróxido de hidrogênio..........18

Figura 6 – Modelo sugerido para degradação forçada por oxidação........................19

Figura 7 – Oxidação de transferência de elétrons mediada por metais....................20

Figura 8 - Degradação do fenoprofeno sob radiação UV..........................................22

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Compostos nitrogenados comumente utilizados para produção de

radicais livres nos testes de degradação forçada......................................................17

Tabela 2 - Critérios de notificação, identificação e qualificação dos produtos de

degradação em medicamentos..................................................................................23

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................12

2. ESTUDOS PRELIMINARES DE DEGRADAÇÃO FORÇADA..............................13

3. ESCOLHA DAS CONDIÇÕES DE DEGRADAÇÃO.............................................14

3.1 Condições de hidrólise ácida/básica................................................................14

3.2 Condições de oxidação.....................................................................................15

3.2.1 Reações induzidas por radicais (oxidação).......................................................16

3.2.2 Reações mediadas por peróxidos.....................................................................18

3.2.3 Reações de transferência de elétrons...............................................................19

4. CONDIÇÕES DE FOTOESTABILIDADE..............................................................20

4.1 Fontes de luz.......................................................................................................21

5. CONSIDERAÇÕES ANALÍTICAS NA VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA..........22

6. CONCLUSÃO........................................................................................................24

REFERÊNCIAS.........................................................................................................25

12

1 INTRODUÇÃO:

O estudo de estabilidade de insumos é um dos itens mais importantes para

garantir a eficácia e a segurança das moléculas. Esta segurança é determinada pelo

perfil farmacológico-toxicológico da substância, assim como os efeitos adversos

causados por impurezas nos produtos acabados (BAERTSCHI, 2005). Guias

internacionais como o ICH foram criados com a intenção de direcionar o trabalho

das empresas que desenvolvem novas drogas e produtos, uma vez que o

conhecimento da estabilidade da molécula é essencial para o desenvolvimento da

formulação a ser usada bem como as condições de estocagem (ALSANTE et al.,

2007)

O estudo de degradação forçada é uma ferramenta complementar utilizada

para prevenir problemas de estabilidade, desenvolver métodos analíticos e

identificar rotas de degradação. Além disso, permite diferenciar produtos de

degradação do ativo daqueles que são gerados na formulação do produto acabado.

As análises desenvolvidas e validadas devem promover degradação em extensão

suficiente a fim de permitir a avaliação da formação de produtos de degradação. É

importante salientar que, os produtos de degradação sob condições de estresse

podem ser classificados como ‘’potencial’’, pois podem ou não ser formados sob

condições de estocagem. (BAERTSCHI, 2011).

Jain et al. publicaram uma revisão que descreve os avanços recentes nos

estudos de impurezas em medicamentos entre 2008 e 2012 sob uma perspectiva

analítica. O estudo mostra o crescente interesse nas análises de degradação

forçada, as quais tendem a aumentar nos próximos anos devido ao maior rigor dos

órgãos reguladores. A figura 1 mostra o número de publicações de estudos de

degradação forçada e perfil de impurezas.

No final de 2013, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)

publicou a RDC 58/2013, que estabelece parâmetros de notificação, identificação e

qualificação de produtos de degradação em medicamentos. (BRASIL , 2013). No

entanto, assim como nos guias internacionais, a política adotada nos testes de

degradação forçada da ANVISA não especifica como conduzir os ensaios em

relação à preparação das amostras bem como as condições necessárias para as

degradações.

Deve ser considerada, também, a análise crítica dos perfis de degradação

das moléculas, as quais incluem a verificação da pureza cromatográfica do pico do

13

insumo, balanço de massas e fatores que podem interferir na estabilidade do

medicamento.

Figura 1 – Publicações sobre degradação forçada entre 2008 e 2012.

FONTE: JAIN et al., 2013

Este artigo tem como objetivo criar um guia científico para auxiliar no

desenvolvimento, execução e interpretação dos estudos de degradação forçada.

2 ESTUDOS PRELIMINARES DE DEGRADAÇÃO FORÇADA

Os estudos de degradação forçada são delineados para produzir testes

indicadores de estabilidade em condições extremas e para simular possíveis

produtos de degradação durante a produção e estocagem do produto. Segundo a

RDC nº 58/2013 as amostras a serem testadas devem ser submetidas às condições

de hidrólise ácida e básica, oxidação, fotólise e íons metálicos (BRASIL , 2013).

O objetivo é atingir, no mínimo, 10% do insumo degradado devendo-se,

porém, estabelecer um limite de degradação, uma vez que, ao estressar em excesso

uma molécula, pode haver a perda dos produtos primários. Os problemas

relacionados à estabilidade encontrados durante o estudo irão formar a base do

desenvolvimento na otimização do estudo indicador de estabilidade (BRASIL, 2013).

A estratégia inicial é semelhante para o insumo ativo e o produto acabado. A

estrutura molecular do insumo ativo se torna peça chave no delineamento do estudo,

pois a partir dela podemos deduzir se o composto irá absorver radiação UV para ser

detectada. A presença de grupos funcionais ionizáveis fornece uma informação

valiosa na predição do comportamento da molécula (BAERTSCHI, 2005).

14

O método mais utilizado na literatura é o de cromatografia líquida de alta

eficiência de fase reversa (RP-HPLC) com detector de arranjo de fotodiodos (PDA)

(CARTENSEN et al., 2000). O método cromatográfico ideal deve mostrar junto com

o insumo ativo principal todos os produtos de degradação, baseando-se na lei da

conservação de massas, isto é, qualquer perda do insumo ativo, em área

cromatográfica, será convertida em produtos de degradação em proporções iguais.

De fato, torna-se praticamente impossível um método cromatográfico que possa

cumprir fielmente tais requisitos. (BAERTSCHI, 2005)

3 ESCOLHA DAS CONDIÇÕES DE DEGRADAÇÃO

A escolha da concentração inicial do ativo a ser degradada deve ser de 1.0

mg/mL. (BAERTSCHI, 2005, ALSANTE et al. 2003) Se a solubilidade for uma

limitação, inerente à própria molécula pode-se utilizar metanol em quantidades

variadas. Testes devem ser realizados nas concentrações em que o insumo ativo vai

estar presente na formulação final. Outro aspecto prático é que amostras que

necessitam de grandes concentrações de ácido, álcali e agentes oxidantes para os

testes de estresse, são recomendadas a serem reduzidas a níveis toleráveis pela

coluna para serem injetados. Recomenda-se diluição com a fase móvel utilizada

(BAERTSCHI, 2011).

3.1 Condições de hidrólise ácida/básica

Condições ácidas, básicas e neutras devem ser empregadas para produzir

reações hidrolíticas. Isso é especialmente importante quando o composto a ser

testado possui grupos funcionais ionizáveis. As reações de degradação dependem

de uma variedade de fatores como a constante dielétrica, a polaridade do solvente e

a energia de superfície (BAERTSCHI, 2005). A figura 2 mostra um exemplo de

delineamento do estudo hidrolítico sob condição ácida e básica.

Muitos insumos ativos apresentam problemas de solubilidade em

concentrações analíticas. Logo, para analisar as características de hidrólise, pode

ser necessária a adição de um co-solvente para facilitar a dissolução. Os solventes

mais comuns utilizados nas análises são o metanol e acetonitrila. (ALSANTE et

al.,2003)

Um cuidado necessário a ser considerado é de que o metanol possui

potencial de participação na química de degradação da molécula atuando como

15

agente nucleofílico, portanto deve ser utilizado com ressalvas. A acetonitrila, por ser

considerada inerte, é recomendada. A neutralização da solução antes da injeção do

HPLC não é recomendada devido à possibilidade de precipitação ou de reações

secundárias.

Figura 2 - Modelo sugerido para estudos de degradação forçada por

hidrólise ácida/básica.

* em área cromatográfica degradada do insumo ativo.

FONTE: Adapatado de SINGH et al., 2000

3.2 Condições de oxidação

Reações de oxidação são um dos mais comuns mecanismos de degradação

de medicamentos e insumos. Existem três rotas de degradações principais a

considerar para testes de estresse: oxidação induzida por radicais, oxidação

mediada por peróxidos e oxidação por transferência de elétrons. (BOCCARDI et. al,

2005). As impurezas presentes sejam no insumo ativo, sejam no produto acabado,

são as principais causas de oxidação nas condições normais de estocagem.

16

O objetivo principal dos ensaios forçados é acelerar o processo natural de

oxidação e identificar impurezas que podem ser formadas durante testes acelerados

e de longa duração.

3.2.1 Reações induzidas por radicais (autoxidação)

As reações de autoxidação possuem um mecanismo complexo que consiste

em uma reação em cadeia mediada por radicais livres, divididas em três etapas. A

figura 3 mostra, em termos gerais, o processo de oxidação a partir de um iniciador.

Figura 3 – Sequência da reação em cadeia mediada por radicais livres

FONTE: BOCCARDI et al. 2005

Para formação de radicais livres na simulação de autoxidação são utilizados

compostos nitrogenados (Tabela 1). Originalmente, esta prática foi sugerida por

Boccardi et al. A molécula mais utilizada e popularmente conhecida é a

azobisisobutironitrila (AIBN). (BOCCARDI et al. , 2005) Os autores demonstraram

que estes iniciadores de radicais baseados em compostos nitrogenados são

capazes de produzir produtos de degradação primários observados nos estudos de

estabilidade de longa duração.

A Figura 4 mostra o mecanismo de formação de radicais livres através do

AIBN. Ao aquecer a amostra a 40ºC o AIBN expele o nitrogênio da sua estrutura

gerando carbonos reativos que rapidamente são oxidados por oxigênio molecular,

formando um radical peróxi que mimetiza o processo de autoxidação em condições

de estocagem (BOCCARDI et al., 2005).

17

A quantidade de iniciadores nitrogenados adicionados deve ser

aproximadamente 10 vezes a concentração de amostra.

Tabela 1 – Compostos nitrogenados comumente utilizados para produção de radicais livres nos testes de degradação forçada.

FONTE: Adaptado de BOCCARDI et al., 2005

Nome químico Estrutura química Solubilidade

em água

em água

em água

em água

em metan

ol

em metan

ol

18

Figura 4 - Mecanismo de formação de radicais peróxidos através do AIBN.

FONTE: BOCCARDI et al., 2005

3.2.2 Reações mediadas por peróxidos

As análises de degradação forçada envolvendo peróxidos, juntamente com

os estudos com iniciadores de radicais irão formar uma base mais completa da

susceptibilidade da molécula à oxidação. O peróxido de hidrogênio é o composto

mais empregado nos testes (PORTER et al., 1995)

As reações de oxidação com a utilização de peróxido de hidrogênio são

relativamente rápidas à temperatura ambiente, logo não é necessário aquecer as

amostras testadas. Ao elevar a temperatura de reação pode ocorrer a formação de

radicais hidroxilas, que são indesejados, pois são mais fortes e não seletivos, que

reagem muito rapidamente em solução levando a resultados diferentes em relação

ao peróxido de hidrogênio (BOCCARDI et al., 2005). A figura 5 mostra a formação

de radicais hidroxilas através do calor.

Figura 5 – Formação de radicais hidroxila a partir do peróxido de hidrogênio.

FONTE: BOCCARDI et al., 2005

As concentrações de peróxido utilizadas nos ensaios podem variar de 0,1 a

30%. Temperaturas de, no máximo, 40ºC são utilizadas para acelerar a reação. Um

período de 24h é suficiente para demonstrar a degradação com peróxido de

hidrogênio. A figura 6 mostra uma sugestão de delineamento de estudo de oxidação.

19

Quando é necessário estressar uma molécula com peróxidos em uma ampla

faixa de pH, deve-se levar em consideração o solvente utilizado. O metanol é o

solvente de escolha. A acetonitrila, em soluções de pH elevado, reage com o

peróxido de hidrogênio, formando um radical instável que não ocorre no processo

natural de oxidação.

Figura 6 -

Modelo sugerido para degradação forçada por oxidação * em área cromatográfica

degradada do insumo ativo.

FONTE: Adapatado de SINGH, 2000

3.2.3 Reações de transferência de elétronsO mecanismo de oxidação por transferência de elétrons ocorre na presença

de metais. A exposição de insumos a metais de transição tais como cobre e/ou ferro

podem levar à oxidação. A concentração de metal adicionada deve ser de 1 ppm de

Cu(II)Cl2 ou Fe(III)Cl3 (ALSANTE et al., 2007).

20

A figura 7 mostra o mecanismo de oxidação do arzoxifeno na presença do

íon cobre. O íon se complexa com a amina da acetonitrila, utilizada como diluente.

Na segunda reação ocorre a transferência de elétrons do oxigênio da molécula,

gerando um radical que ataca a estrutura interna, formando dímeros.

Figura 7 – Oxidação de transferência de elétrons mediada por metais.

FONTE: BAERTSCHI et al., 2011

Estes metais podem ser encontrados em vidrarias ou estar presentes em

impurezas dos solventes utilizados nas análises por HPLC. É importante haver um

procedimento padrão de limpeza das vidrarias que evitem quaisquer contaminações

que possam comprometer a qualidade dos ensaios. (DOTTERER et al., 2010)

4 CONDIÇÕES DE FOTOESTABILIDADE

A fotoestabilidade de insumos e produtos acabados pode ter impacto sobre

o prazo de validade, manuseio, estocagem e até a segurança do produto devido à

fototoxicidade e fotogenotoxicidade. Em 1998, com a implementação do ICH Q1B,

que define os parâmetros para condução dos estudos de degradação forçada, houve

um avanço significativo na padronização dos procedimentos em relação às outras

condições. (ICH, 1996)

No Brasil, a ANVISA publicou a RDC nº 45/2012, que segue os mesmos

padrões do ICH para a condução dos estudos de fotoestabilidade. A molécula deve

ser exposta a uma mistura de UV-B (280-320 nm), UV-A (320-400 nm) e luz visível

(400-800nm) em proporções variadas. (BRASIL, 2012) No entanto, a absorção de

21

luz pela molécula não leva, necessariamente, a fotodegradação. Em alguns casos, o

excipiente absorve radiação e transfere a energia para o insumo ativo, podendo

gerar degradação indireta. Os testes devem ser realizados na embalagem primária e

secundária e, quando em solução, utilizar uma amostra controle, protegida da fonte

de luz. A acetonitrila é o solvente indicado, pois o metanol pode produzir artefatos de

degradação a partir de radicais metóxi formados devido à exposição à luz

(BAERTSCHI, 2005). A figura 8 mostra um exemplo de fotodegradação e o

mecanismo proposto do medicamento fenoprofeno, a partir da radiação UV. O

tempo de exposição deve ser suficiente para haver uma degradação entre 10 e 20%,

no qual, dependendo da susceptibilidade da molécula a decomposição, pode variar

significativamente. (BAERTSCHI, 2011)

Quando os testes são feitos no produto acabado, tanto o insumo ativo como

os excipientes podem levar à degradação. É recomendado expor o placebo nas

mesmas condições e tempo para verificar uma possível interferência no método de

identificação (ALSANTE et al.. 2007).

4.1 Fontes de luz

Como citado anteriormente, a molécula deve ser estressada numa faixa de

luz de 400 a 800 nm, as quais compreendem o espectro de luz UV e vísivel.

Entretanto, é dificil predizer qual parte do espectro é mais destrutivo para uma

molécula específica. Logo, fontes de luz com diferentes distribuições de intensidade

no espectro podem levar a fotodegradações com perfis diferentes. (BAERTSCHI,

2011).

A RDC nº 45/2012 da ANVISA especifica que a exposição mínima de 1,2

milhões de lux/h integrados a uma energia UV de aproxidamente 200 watt h/m² para

testes confirmatórios (BRASIL, 2012), que são os mesmos parâmetros sugeridos

pelo ICH Q1B. O guia fornece duas opções de fontes de luz, as quais devem possuir

o certificado da ISO 10977 (1993) (ICH, 1996). É necessário manter um controle de

temperatura para garantir que não haja degradação térmica. Pode-se utilizar papel

alumínio para proteger as amostras-controle deste efeito, colocando-as junto à

amostra testada, sob o mesmo tempo e intensidade de exposição, garantindo assim

que, caso haja, a degradação existente seja resultado da exposição à luz.

22

Figura 8 – Degradação do fenoprofeno sob radiação UV. Abaixo é mostrado

o mecanismo proposto que leva a instabilidade da molécula.

FONTE: BAERTSCHI et al., 2011.

5 CONSIDERAÇÕES ANALÍTICAS NA VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA

Como descrito anteriormente, a cromatografia líquida de alta eficiência com

detector de arrranjo de fotodiodos é preferencialmente utilizada para o

desenvolvimento de um método indicador de estabilidade. A vantagem deste tipo de

detector é dar o poder ao analista de fazer uma varredura em uma ampla faixa do

espectro UV em uma única análise.

De acordo com o FDA, o método indicador de estabilidade é um

procedimento analítico capaz de discriminar o insumo ativo de quaisquer produtos

de degradação. Além disso, deve ter uma sensibilidade suficiente para detectar e

quantificar estes produtos (FDA, 1987). A necessidade de notificação, identificação e

qualificação do(s) produto(s) de degradação no decorrer do estudo de estabilidade

do medicamento deverá ser avaliada com base nas informações descritas na RDC

58/2013, conforme mostra a tabela 2.

23

Tabela 2: Critérios de notificação, identificação e qualificação dos produtos

de degradação em medicamentos.

Fonte: BRASIL, 2013

Para a avaliação dos produtos de degradação pode-se utilizar o cálculo do

balanço de massa, que nada mais é que quantificar os picos de degradação e então

comparar com a perda da quantidade de amostra do composto original. O balanço

de massa é aceito quando totalizar aproximadamente 100%, ou seja, a diminuição

da potência do composto original é convertida em produto de degradação

quantificável (ITO, 2012).

O conhecimento das propriedades físico-químicas do insumo ativo é o ponto

de partida do processo de desenvolvimento do método. O objetivo principal é obter

uma condição de separação capaz de determinar o maior número de picos possíveis

em uma análise. As variáveis mais comuns de separação incluem o tipo de solvente,

o pH da fase móvel, o tipo de coluna utilizada e a temperatura do forno. Deve-se

variar drasticamente estas condições para forçar mudanças no perfil de separação

dos picos (DOLAN, 2002).

Para obter um pH baixo ou intermediário na solução, pode-se usar tampão

fosfato na faixa de pH entre 2.5 – 6.5. Se o método for analisar a amostra acoplado

um detector de espectrometro de massas é importante selecionar tampões que

sejam compatíveis com o equipamento, como, por exemplo, 0,1% de ácido

trifluoroacético (pH ~ 1,9) e acetato de amônia para pH elevado. A temperatura da

coluna é uma ótima ferramenta para a seletividade do método, principalmente

quando utilizada uma eluição gradiente (DOLAN, 2002).

A validação de metodologia deve seguir os parâmetros da RE nº 899/2003

(BRASIL, 2003).

24

6 CONCLUSÃO

Os estudos de degradação forçada são parte importante no delineamento do

estudo indicador de estabilidade. Entretanto, é importante ressaltar que os produtos

de degradação forçada são ‘’potenciais’’ podendo, ou não, formar-se nas condições

normais de estocagem. Tanto os guias internacionais como a RDC 58/2013,

recentemente publicada pela ANVISA, não especificam como conduzir os ensaios, a

exceção dos testes de fotoestabilidade. O objetivo de qualquer estratégia usada

para degradação forçada é produzir uma degradação de 10-20% da concentração

inicial, para poder observar-se todos os produtos primários. Com o maior rigor dos

órgãos regulatórios, fica provada a necessidade de um maior entendimento da

condução de ensaios forçados, bem como o desenvolvimento de estudos

indicadores de estabilidade.

25

REFERÊNCIAS

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