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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS FITOTERÁPICO: PERFIL FITOQUÍMICO, CONTROLE E VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA MARCOS ANDRÉ CUNHA DE OLIVEIRA RECIFE 2005
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
FITOTERÁPICO: PERFIL FITOQUÍMICO, CONTROLE E VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA
MARCOS ANDRÉ CUNHA DE OLIVEIRA
RECIFE 2005
2
MARCOS ANDRÉ CUNHA DE OLIVEIRA
FITOTERÁPICO: PERFIL FITOQUÍMICO, CONTROLE E VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA
Recife Departamento de Ciências Farmacêuticas da UFPE
2005
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas
Orientadora: Profa. Dra. Miracy Muniz de Albuquerque Co-Orientador: Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier
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4
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Reitor Amaro Henrique Pessoa Lins
Vice-Reitor Gilson Edmar Gonçalves e Silva
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação Celso Pinto de Melo
Diretor do Centro de Ciências da Saúde José Thadeu Pinheiro
Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde Márcio Antonio de Andrade Coelho Gueiros
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas Jane Sheila Higino
Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas Samuel Daniel de Sousa Filho
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação de Ciências Farmacêuticas Miracy Muniz de Albuquerque
Vice-Coordenador do Programa de Pós-Graduação de Ciências Farmacêuticas
Pedro José Rolim Neto
5
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter-me dado força para realizar este trabalho com carinho e dedicação.
Aos meus pais Vargas e Guaraci pelo carinho, apoio, incentivo, compreensão e companheirismo durante toda a minha vida.
Aos meus irmãos Marcelo e Micheline, pela paciência nos dias de maior agitação e ansiedade.
Aos meus familiares, que, apesar da distância, sempre me deram atenção e ações de estima e consideração.
À minha orientadora profa. Dra. Miracy Muniz de Albuquerque pela oportunidade e confiança em meu potencial, pela orientação e incentivo.
Ao Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier pela orientação, atenção, cooperação, ajuda e sugestões para a realização deste trabalho.
À Farmacêutica Dra. Adelaide Tavares Queiroz pela cooperação e fornecimento de materiais imprescindíveis para execução deste trabalho.
Ao pessoal do Núcleo de Controle de Qualidade em Medicamentos e Correlatos (NCQMC), Severino Grangeiro Junior (Ceará), Daniele, Ruth, Rosario, André, Aurenice, Ana Cristina, Rosane, Leilyane, Ítala, Juliana, pela amizade, alegria, ótima convivência e pelo companheirismo no nosso dia-a-dia.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Aos colegas e Amigos do Departamento de Ciências Farmacêuticas que carinhosamente me conhecem como Marcão.
Aos integrantes da Associação Farmacêutica de Pernambuco, em especial para profa. Elba Lúcia e João Eudes, pela ótima convivência.
Aos colegas e amigos do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Aos colegas e amigos Farmacêuticos da Farmácia Independente Zênia, Brígida, Klayton, Marluce, Ivana, George.
Aos Amigos Farmacêuticos da Farmácia Pague Menos Renata Cavalcante, Ana Alice, Ulrich, André Maurício, João, Rosângela, Tuliane, Karina.
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Aos colegas e amigos Junior Ceará, Danilo Bedor, Lamartine, Lívio, Artur, Chico, Tiago, Eduardo Gonçalves (Duda), Carlos Fernando (Brasa), Gustavo (Bob Gol), Marcelo, Ádley, Bráulio, Erick, Jovita, Juliana, Osnir, Daniele, Leilyane, Juliana, Ítala, Vandessa, Janaína, Lívia, Talita, Elisângela, Aldo, Marcília, Tiago 2, Herbert, Janayna.
A Iguacy Duque e Levi Rodrigues pelos constantes incômodos que proporcionei.
Agradeço à CAPES pela concessão da bolsa de estudo.
RESUMO
O presente trabalho determina o perfil cromatográfico das plantas utilizadas na produção do
fitoterápico ROBUSTERINA. Tal produto é constituído por Berberis vulgaris L, Gossypium
herbaceum L. e Viburnum opulus L. As cascas da raiz de B. vulgaris são empregadas como
tônico amargo e para litíase biliar. As cascas da raiz e sementes de G. herbaceum têm ações
antiespasmódicas e uterotônicas. As cascas do caule de V. opulus são antiespasmódicas e
tônicas. Três amostras de cada planta foram analisadas por cromatografia em camada delgada
analítica (CCDA), buscando-se estabelecer a identidade dos grupos de metabólitos
secundários presentes face aos relatos da literatura. Para as matérias-primas foram analisadas
matéria orgânica estranha, perda por dessecação, cinzas (totais, insolúveis em ácido e
sulfatadas) e metais pesados. Já para o produto acabado foram avaliados os aspectos
macroscópicos (verificação da cor, odor sabor), características físicas (teor alcoólico
(determinado em alcoômetro), densidade (pelo método do picnômetro), pH (determinado por
potenciômetro) e resíduo seco total). Devido à presença de alcalóides em Berberis vulgaris e,
ausência de metodologias analíticas de quantificação para o produto, foi proposta validação de
método, de acordo com as exigências atuais. A metodologia fundamenta-se na determinação
espectrofotométrica de alcalóides utilizando-se Dragendorff como reagente precipitante e
Sulfato de Berberina Merck
como referência padrão. Os perfis fitoquímicos obtidos foram
confrontados com dados da literatura, comprovando a autenticidade da matéria-prima. Para as
matérias-primas foram determinadas especificações de controle de qualidade para matéria
orgânica estranha, perda por dessecação, cinzas (totais, insolúveis em ácido e sulfatadas) e
metais pesados. Para o produto Robusterina foram analisadas as características organolépticas
(verificação da cor, odor, sabor), características físicas (limpidez, teor alcoólico, densidade,
pH, resíduo seco total e solubilidade). Os estudos obtidos permitem sugerir especificações de
valores mínimos e máximos para o controle de qualidade para Tintura de Robusterina. Quanto
à validação a curva de calibração foi determinada com seis concentrações entre 40 e 200
g/mL. A equação da reta é y = 0,0038x + 0,0092 com R2 de 0,9996. Os parâmetros robustez,
precisão, especificidade, limite de detecção e quantificação e exatidão foram avaliados
estatisticamente com intervalo de 95% de confiança (teste t de Student, ANOVA). De acordo
com as análises estatísticas, observou-se que o método é linear, robusto, preciso e exato. Os
limites de detecção e de quantificação foram respectivamente 3,1578 e 10,5263 g/mL.
II
ABSTRACT
This works purpouse was the chromatographic profile of the plants especimens used in the
production of ROBUSTERINA phytopharmaceutical. Such species are presents Berberis
vulgaris L, Gossypium herbaceum L. and Viburnum opulus L. The root bark of B. vulgaris is
used as tonic bitter taste and biliary litiasis. The root bark of G. herbaceum has antispasmodic
and uterotonic actions. The stem bark of V. opulus has antispasmodic and tonic. Three
samples of each plant had been analyzed by analytical thin layer chromatography (ATLC),
searching to establish the identity of the groups of secondary metabolics gifts face to the
stories of literature. For raw materials they had been analyzed organic substance stranger,
loss for dessecation, leached ashes (total, insoluble in acid and sulfated) and heavy metals.
Already for the finished product the macroscopic aspects had been evaluated (verification of
the color, odor flavor), physical characteristics (alcoholic text (alcoholmeter), density
(picnometer), pH (potentiometer) and total dry residue). Due to presence of alkaloids in B.
vulgaris and absence of analytical methodologies of quantification for this product, it was
proposal method validation, in accordance with the current requirements. The methodology is
followed at spectrophotometric alkaloid determination using Dragendorff as precipitating
agent reacting and Berberine Sulphate Merck
as reference standard. The phytochemistry
profiles had been collated with data from the literature, proving the authenticity of the raw
materials. For raw materials specifications of quality control are determined: stranger organic
substances, loss for dessecation, leached ashes (total, insoluble in acid and sulfated) and
heavy metals. For Robusterina product the organoleptics characteristics had been analyzed
(verification of the color, odor, flavor), physical characteristics (limpidity, alcoholic text,
density, pH, total dry residue and solubility). The gotten studies allow to suggest
specifications of minimum and maximum values for the quality control for tincture of
Robusterina. How much to the validation the calibration curve was determined with six
concentrations between 40 and 200 g/mL. The equation of the straight line is y = 0,0038x +
0,0092 with R2 of 0,9996. The parameters robustness, precision, specificity, limit of detection
and quantification and exactness had been evaluated statisticaly with reliable interval of 95%
(test t of Student, ANOVA). In accordance with the statistical analyses, were observed that
the method is linear, robust, necessary and accurate. The limits of detection and quantification
had been respectively 10,5263 and 3,1578 g/mL.
III
LISTA DE FIGURAS
Revisão de Literatura
Figura 1 Berberis vulgaris.................................................................................................
4
Figura 2 Estrutura Química da Berberina..........................................................................
6
Figura 3 Gossypium herbaceum.........................................................................................
8
Figura 4 Estrutura Química do Gossipol............................................................................
9
Figura 5 Viburnum opulus................................................................................................. 12
Figura 6 Estrutura Química da Escopoletina.....................................................................
13
Figura 7 Estrutura Química da Amentoflavona.................................................................
14
Figura 8 Estrutura Química do Ácido Ursólico.................................................................
14
Artigo III
Figura 1 Curva de Regressão Linear obtida da média das Três Curvas de Calibração autênticas.............................................................................................................
57
Figura 2 Gráfico de Resíduos.............................................................................................
58
IV
LISTA DE TABELAS
Artigo I
Tabela 1 +++ Resultado da Pesquisa de Matéria Orgânica Estranha de Berberis vulgaris,
Gossypium herbaceum e Viburnum opulus de lotes diferentes do mesmo
fornecedor............................................................................................................
28
Tabela 2 Resultado da Pesquisa de determinação de umidade de Berberis vulgaris
Gossypium herbaceum e Viburnum opulus de lotes diferentes do mesmo
fornecedor............................................................................................................
29
Tabela 3 Resultado da Pesquisa de cinzas totais de Berberis vulgaris, Gosssypium
herbaceum e Viburnum opulus de lotes diferentes do mesmo fornecedor..........
30
Tabela 4 Resultado da Pesquisa de Cinzas Insolúveis em Ácido de Berberis vulgaris,
Gosssypium herbaceum e Viburnum opulus de lotes diferentes do mesmo
fornecedor............................................................................................................
31
Tabela 5 Resultado da Pesquisa de Cinzas Sulfatadas de Berberis vulgaris, Gosssypium
herbaceum e Viburnum opulus de lotes diferentes do mesmo
fornecedor............................................................................................................
32
Artigo II
Tabela 1 Resultados de Parâmetros de Controle de Qualidade para a Robusterina..........................................................................................................
41
Artigo III
Tabela1 Quantificação Espectrofotométrica de alcalóides- Resultados da Linearidade- Dados da Curva de Calibração............................................................................
56
Tabela 2 Resultados da Análise de Variância para Linearidade........................................
57
Tabela 3 Avaliação da Robustez variando o parâmetro de pH.......................................... 58
V
Tabela 4 Avaliação da robustez variando o pH de acordo com a ANOVA.......................
58
Tabela 5 Avaliação de Robustez Variando o parâmetro de Velocidade de Centrifugação
59
Tabela 6 Avaliação da robustez variando a velocidade de centrifugação de acordo com
a ANOVA............................................................................................................
59
Tabela 7 Avaliação da robustez variando o parâmetro Marca do Solvente.......................
60
Tabela 8 Teste-t Student Robustez de Marca do Solvente.............................................
60
Tabela 9 Resultados da Repetitividade...............................................................................
61
Tabela 10 Resultados da Precisão Intermediária..................................................................
61
Tabela 11 Precisão Intermediária de acordo com a ANOVA..............................................
62
Tabela 12 Resultados da Exatidão para concentrações baixa, média e alta.........................
62
Tabela 13 Teste t de Student para Exatidão
Concentrações baixa (50%), média (100%) e alta (150%)........................................................................................................
62
VI
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................
1
2. REVISÃO DA LITERATURA..........................................................................................
4
2.1 Estudos sobre Berberis vulgaris.......................................................................................
4
2.2 Estudos sobre Gossyium herbaceum................................................................................ 7
2.3 Estudos sobre Viburnum opulus.......................................................................................
11
2.4 Produção de Fitoterápicos e Controle de Qualidade........................................................ 15
2.5 Controle de Qualidade de Fitoterápicos........................................................................... 16
2.6 Validação de Metodologia Analítica................................................................................
17
3. OBJETIVO.........................................................................................................................
19
4. ARTIGO I Determinação de Parâmetros de Controle de Qualidade das matérias-primas utilizadas na produção de fitoterápico empregado para disfunções do ciclo menstrual.........
21
Resumo...................................................................................................................................
21
Abstract...................................................................................................................................
22
4.1 Introdução.........................................................................................................................
22
4.2 Material e Métodos...........................................................................................................
25
4.3 Métodos............................................................................................................................ 25
4.4 Resultados e Discussão.................................................................................................... 27
4.5 Conclusão......................................................................................................................... 32
4.6 Agradecimentos................................................................................................................ 33
4.7 Referências....................................................................................................................... 33
5. ARTIGO II Determinação de Parâmetros de Controle de Qualidade de Produto
Fitoterápico Robusterina.........................................................................................................
36
Resumo................................................................................................................................... 36
Abstract................................................................................................................................... 37
VII
5.1 Introdução......................................................................................................................... 37
5.2 Material e Métodos........................................................................................................... 39
5.3 Parâmetros de Controle de Qualidade para Robusterina.................................................. 39
5.4 Resultados e Discussão..................................................................................................... 41
5.5 Conclusão......................................................................................................................... 42
5.6 Agradecimentos................................................................................................................ 42
5.7 Referências....................................................................................................................... 42
6. ARTIGO III Desenvolvimento e Validação da Metodologia de Quantificação
Espectrofotométrica de Alcalóides em Fitoterápico contendo Berberis
vulgaris................................................................................................................................... 45
Resumo................................................................................................................................... 45
Abstract.................................................................................................................................. 46
Introdução...............................................................................................................................
46
Objetivo..................................................................................................................................
48
Material e Métodos.................................................................................................................
48
Desenvolvimento da Metodologia..........................................................................................
48
Estudo da Validação............................................................................................................... 49
Resultados e Discussão...........................................................................................................
51
Conclusão............................................................................................................................... 54
Agradecimentos...................................................................................................................... 54
Referências............................................................................................................................. 54
Tabelas....................................................................................................................................
56
VIII
7 CONCLUSÃO FINAL........................................................................................................
63
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................ 64
9 ANEXOS.......................................................................................................................... 74
1
1. INTRODUÇÃO
O conhecimento sobre plantas medicinais simboliza muitas vezes o único recurso terapêutico
para vários grupos étnicos e comunidades. O uso de plantas no tratamento e cura das enfermidades é
tão antigo, quanto a espécie humana (MACIEL, 2002). Substâncias de origem vegetal são utilizadas
desde tempos antigos, para tratamento de doenças (LOACES et al, 2003).
É necessário mencionar que o conhecimento das plantas faz parte dos primeiros estudos do
homem, visto que este necessitava coletar raízes, caules, folhas e frutos destinados à caça, à
alimentação e à cura de seus males (GOTTLIEB & KAPLAN, 1993).
O uso de plantas durante a história foi fundamental para que a produção de medicamentos, e o
tratamento de enfermidades dessem os primeiros passos. A terapêutica hoje mostra que,
medicamentos com ações específicas também provêm dos produtos naturais. Isto é visto quando é
analisado o número de substâncias obtidas de forma direta e indireta de fontes naturais (CALIXTO,
2003). Pesquisadores da área de produtos naturais mostram-se surpresos pelo fato de produtos
encontrados na natureza apresentarem uma grande diversidade em termos de estrutura e de
propriedades biológicas e físico-químicas (WALL & WANI, 1996). Estima-se que 15 a 17% das plantas
foram estudadas no que diz respeito a potencialidades medicinais (SOEJARTO, 1996).
Atualmente 40% dos fármacos usados na terapêutica são provenientes de fontes naturais, onde
25% são de origem vegetal (SHU, 1998).
Para se ter uma idéia deste potencial terapêutico, dentre os 520 novos fármacos aprovados
entre 1983 e 1994, pela Food and Drug Administration (FDA) ou outra entidade comparável, 196
vieram direta ou indiretamente de fonte natural (CRAGG, 1997).
O número de plantas estudadas é crescente ano a ano. Isto é observado a partir de ações do
segmento acadêmico, que preconiza a importância dos recursos naturais para o desenvolvimento
(SIMÕES, REUNIÃO DO CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE, 2001). Por isso, há atualmente, interesse da
indústria farmacêutica em produtos naturais como fonte de modelos para novos fármacos
(KINGSTON, 1996, HARVEY, 2000) e como matéria-prima para desenvolvimento de fitoterápicos
(SCHENKEL et. al, 2001).
Quanto maior o número de espécies, maior o potencial de novos medicamentos. No Brasil, esse
potencial está quase todo a ser descoberto. Segundo Gottlieb (1981), não se sabe nada sobre a
composição química de 99,6% de nossa flora. A despeito dos mais de 40 anos de pesquisa de plantas
medicinais no Brasil, o número de espécies estudadas é muito reduzido (SOUZA, 1993).
Levantamentos etnobotânicos são fundamentais para o conhecimento e o estudo de outras
plantas com finalidades medicinais. Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) estimam que
2
aproximadamente 80% da população dos países em desenvolvimento utilizam para atendimento
primário da saúde, especialmente a medicina tradicional, da qual a maior parte envolve o uso de
extratos vegetais ou seus princípios ativos (FARSNSWORTH et al., 1985). Essa situação é semelhante
no Brasil, constatada pelos trabalhos que vem sendo realizados em diversas regiões brasileiras;
porém, ainda em número insuficiente, mostrando o longo trajeto a ser percorrido pela pesquisa
brasileira (DI STASI, 1995).
Com respeito às potencialidades da nossa flora, já nos idos dos anos 80, apontava-se que o
entusiasmo em relação ao uso de plantas medicinais e seus extratos na assistência à saúde pode ser
entedido pela sua aceitabilidade, derivada da inserção cultural e pela atual disponibilidade desses
recursos, ao contrário do que ocorre com outros medicamentos, que na sua maioria são dependentes
de matéria-prima e tecnologias externas (SIMÕES et. al, 1986, SCHENKEL et. al, 1985).
O único recurso terapêutico de uma boa parcela da população brasileira e de mais de 2/3 da
população mundial, o mercado de fitoterápicos no mundo movimenta um montante de US$ 22
bilhões por ano e vem seduzindo a cada ano mais adeptos nos países desenvolvidos. Não há
estatísticas precisas sobre o mercado brasileiro de fitoterápicos, mas ele deve movimentar recursos
de ordem de US$ 0,7 a 1 bilhão anuais (7 a 10% do mercado de medicamentos do país) (CIÊNCIA
HOJE, 2000).
A tendência observada para a fitoterapia é que ela desempenhará um papel cada vez mais
importante na assistência de saúde da população. Desta forma, não se pode negar a importância da
avaliação dos efeitos terapêuticos de cada um destes fitoterápicos, através de estudo randomizado,
duplo cego e controlado por placebos, envolvendo um número significante de pessoas. Além do
estabelecimento de atividade por meio de testes clínicos, outro aspecto relevante é a padronização
desta atividade, de modo a assegurar uma quantidade uniforme desta em cada dose (CALIXTO, 2000).
A utilização de plantas medicinais tornou-se um recurso alternativo em terapêutica que
apresenta uma grande aceitação pela população e, notadamente vem crescendo junto à comunidade
médica, desde que sejam utilizadas plantas estudadas no que se diz respeito a sua eficácia e
segurança (VEIGA,JR. 2002).
Há uma controvérsia, oriunda principalmente da imprecisão de dados e falta de pesquisa, sobre
o número de espécies vegetais fanerogâmicas existentes no Brasil. Dos diversos biomas brasileiros
(Floresta Amazônica, Cerrado, Mata Atlântica, Pantanal, Caatinga, Manguezal, etc), estima-se que
existem de 40 mil (FARNSWORTH et. al, 1991) a 55 mil espécies (DAVIS et. al, 1986). Segundo Plotkin
(1991), o Brasil é o país com maior números de espécies vegetais do mundo. Um total de espécies
estimado está entre 350-550 mil espécies, onde 55 mil espécies são catalogadas (DIAS, 1996, apud
GUERRA et al, 2001).
3
Apesar de deter um dos principais mercados de medicamentos do mundo o Brasil, enfrenta
sérios problemas relativos ao acesso a medicamentos, pela sua população carente (aproximadamente
50%), o governo brasileiro não se preocupou em apoiar universidades, institutos de pesquisas,
laboratórios estatais e indústrias farmacêuticas nacionais para possibilitar o desenvolvimento de
fitoterápicos (CIÊNCIA HOJE, 2000).
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Estudos sobre Berberis vulgaris L.
2.1.1 Botânico
A família Berberidaceae compreende cerca de 13 gêneros, com aproximadamente 650
espécies distribuidas nas regiões temperadas do Hemisfério Norte, exceto Berberis com
representantes também na América do Sul. A família apresenta 500 espécies do gênero Berberis .e
100 espécies do gênero Mahonia (CRONQUIST,1981).
B. vulgaris é um arbusto com aproximadamente 1 a 3 metros de altura, nativo da Europa e
Ásia Oriental. É encontrado também na América do Norte (ALONSO,1998) (Figura 1), e, em
Portugal, é cultivada como planta ornamental (CUNHA, 2003).
FIGURA 1 - Berberis vulgaris (figura extraída de www.rolv.no/bilder/
galleri/medplant/berb_vul.htm)
Apresenta ramos espinhosos, as folhas das gemas principais se transformam em espinhos,
mais freqüentemente trifurcados; os ramos laterais, únicos providos de folhas normais, nascem nas
axilas de tais espinhos (STRASSBURGER et al, 1984). As flores são muito pequenas e de cor amarela
(ALONSO,1998). São compostas de três sépalas externas e três internas, todas como se fossem
pétalas e de outras seis pétalas, dispostas na mesma maneira, e mesma cor e com um par de
5
glândulas nectaríferas na base. Os estames também são em número de seis e o fruto, uma baga de
cor coral ovóide (QUER,1962). A floração ocorre entre o fim da primavera e meados do verão
(ALONSO,1998).
Dentre a vasta sinonímia popular, B. vulgaris é conhecido como acetillo, acetín, agracejo
(espanhol), barberry (inglês), bérbero, berberis (português), crespino (italiano), épine-vinette
(francês) (ALONSO,1998).
As partes utilizadas para uso medicinal são os frutos, casca da raiz (PDR FOR HERBAL
MEDICINES, 2000) e folhas.
2.1.2 Composição
Levando-se em consideração as partes utilizadas, tanto os frutos quanto as cascas das raízes e
folhas apresentam constituintes químicos importantes para justificar seu uso medicinal.
Os frutos apresentam vitamina C, vestígios de alcalóides isoquinolínicos, antocianinas, ácidos
clorogênico e málico e açúcares (CUNHA, 2003). Também são encontrados, os ácidos cítrico e
tartárico, goma e pectina (ALONSO,1998).
Este gênero tem sido extensivamente estudado, devido à presença de alcalóides e compostos
fenólicos. As espécies de berberis são conhecidas por produzirem alcalóides isoquinolínicos, todos
derivados biogeneticamente de tirosina. Foram encontrados os alcalóides berbamina, berberina,
oxiacantina, jatrorhizina, columbamina, palmatina, isotetrandrina, bervulcina, vulracina,
magnoflorina, berberrubina (BEAL,1960, DOMAGALINA et. al., 1971, DROST et, al., 1974 e
SCHIFF,1983).
No córtex da raiz e folhas são encontrados os alcalóides berberina, palmatina, columbamina,
berbamina, oxiacantina e magnoflorina, perfazendo um total de 3% de alcalóides o que confere cor
amarela característica ao córtex (ALONSO,1998).
Dentre estes alcalóides destaca-se a berberina, conhecida pela suas ações farmacológicas,
estando presente em inúmeras espécies do gênero. Ela tem uma semelhança estrutural com a
morfina, e, em altas concentrações, detém certa toxicidade (ALONSO,1998).
Berberina é o alcalóide responsável pela coloração amarela dos caules e das raízes, e que lhes
confere fluorescência amarela quando expostos à luz ultravioleta entre 275 e 366 nm. Sua estrutura
que contém nitrogênio quaternário (Figura 2), forma sal com ácido mineral, tal como ácido
clorídrico e ácido sulfúrico, através da eliminação de uma molécula de água (COSTA, 1970).
6
FIGURA 2 Estrutura Química da Berberina
2.1.3 Aspectos Farmacológicos
As atividades farmacológicas atribuídas ao gênero berberis devem-se a um grupo especial de
alcalóides, os isoquinolínicos. Uma maior atenção é dada à berberina, pertencente à classe das
protoberberinas devido à sua grande predominância nas espécies do gênero berberis.
A Berberina tem demonstrado eficácia, na parte clínica e experimental, frente à leishmaniose
visceral e cutânea (GHOSH et. al.,1983, GOSH et. al.,1985, VENNERSTROM et. al.,1990).
Em concentrações normais, a berberina é um tônico amargo que apresenta propriedades
digestivas, eupépticas e orexígenas. Alguns estudos in vitro demonstraram que a berberina tem ação
antibacteriana (AMIN et. al.,1969), antifúngica (MAHAJAN et. al.,1982 e NAKAMOTO et. al.,1990),
anti-helmíntica (SINGHAL et. al.,1976) e antiviral (GUDIMA et. al.,1994). No caso dos vírus da gripe
A e B, mostrou-se eficaz, por exibir ação inibitória da replicação in vitro, em torno de 90%
(LESNAU,1990).
A berberina demostrou atividade bacteriostática em frente ao vibrião da cólera (LAHRI et.
al.,1967, RABBANI et. al.,1987) e Escherichia coli (SACK et. al.,1982, SUN et. al.,1988).
É também observado a ação da berberina frente à tracoma, infecção ocular que pode
desencadear a cegueira, causada pelo Clamidia trachomatis (PIZZORNO et. al.,1985).
Segundo VENNERSTROM E KLAYMAN (1988), a berberina, palmatina, jatrorhizina e outros
derivados alcaloídicos foram testados em relação à atividade antimalárica in vitro contra
Plasmodium falciparum e in vivo contra P. berghei. A berberina exibiu potência comparável à
quinina in vitro.
A berberina apresenta uma tímida atividade hipotensora em ratos, que pode ser prolongada
fazendo-se substituições de grupos, como por exemplo, a troca do grupo o-metila do carbono 9 por
o-n-butila (FUKUDA et. al.,1970).
A administração intravenosa da berberina em animais de laboratório, produziu efeitos
antimuscarínicos e hipotensor arterial. A nível cardíaco produz ação estimulante do músculo
cardíaco, mas em altas doses, o efeito é contrário (PREININGER, 1975). Estudos in vitro demonstram
7
que a berberina reduziu a ação anticoagulante da heparina em sangue humano e canino
(PREININGER, 1975).
A berberina tem sido estudada em relação às ações anticancerígenas. Ela inibiu tumores
sistêmicos B1, KB e OS (DUKE, 1985).
O sulfato de berberina inibiu a ação da teleocidina, conhecido agente cancerígeno, na
formação de tumores cutâneos induzidos por 7,12-dimetilbenz[a]antraceno em camundongos
(PIZZORNO et. al.,1985).
A berberina apresenta atividade uterotônica (WILLIAMSON et. al.,1988) e uterocontractante
(DUKE, 1985); estimula a secreção de bile e bilirrubina, e melhora os sintomas de colecistite crônica
e corrige níveis elevados de tiramina em pacientes com cirrose hepática (PIZZORNO et. al.,1985).
A palmatina, também encontrada em B. vulgaris, tem demonstrado atividade farmacológica,
quando usado como estomáquico, colagogo e para tratamento de febres palustres (GUPTA E DIXIT,
1989) verificaram atividade antiespermatogênica em cães.
O córtex da raiz da B. vulgaris é usado popularmente com tônico estomacal e colagogo. Nas
dispepsias crônicas, acompanhadas de inapetência, tem resultados satisfatórios. Neste caso é
preparado uma infusão a 4%, tomando-a 3 vezes ao dia (QUER,1962). Como infusão ou cozimento
dos frutos, toma-se uma colher de café 2 a 3 vezes por dia (CUNHA, 2003). A tintura é feita em
proporção (1:10) das cascas das raízes, com posologia de 20 a 40 gotas ao dia (CUNHA, 2003). A
tintura 1:10 é preparada de acordo com a Farmacopéia Alemã 10 ed. (PDR FOR HERBAL MEDICINES,
2000).
2.2 Estudos sobre Gossypium herbaceum L.
2.2.1 Botânico
Atualmente estão identificadas cinqüenta espécies de algodão do gênero Gossypium
distribuídas nos continentes Asiático, Africano, Americano e na Austrália. Gossypium é um dos
oito gêneros que compõem a tribo Gossypieae, da Família Malvaceae (FRYXELL, 1979).
Os algodoeiros cultivados mundo afora pertencem a quatro espécies distintas deste gênero:
duas alotetraplóides (Gossypium hirsutun L. e G. barbadense L.) e duas diplóides (G. arboreum L.
e G. herbaceum L.).
As flores são simples, isoladas e apresentam cinco pétalas. Cada uma delas possui dois
cálices, um normal e outro formado por três grandes brácteas
folhas modificadas em forma de
coração (CIÊNCIA ILUSTRADA, 1973).
O fruto é uma cápsula que se origina do desenvolvimento de um ovário supero que contém
cinco cavidades, onde se alojam as sementes. Depois de atingida a maturação, o fruto abre-se
8
espontaneamente. Com essa abertura, a lanugem sai para o exterior. Para que se possa fazer a
colheita do algodão é preciso que ocorra a fecundação do óvulo no interior do ovário, e que ele
sofra uma série de transformações até que se torne fruto (CIÊNCIA ILUSTRADA, 1973).
Diante de uma vasta sinonímia vulgar, o G. herbaceum L. é conhecido como algodonero
(espanhol), cótone (italiano), cotonnier (francês), cotton plant (inglês) e baunwolle (alemão)
(COIMBRA, 1958). Apresenta também no Brasil como Amamiu (em tupi) (CRUZ, 1965) (Figura 3).
FIGURA 3
Gossypium herbaceum (figura extraída de biotech.tipo.gov.tw/ plantjpg/2/ )
2.2.2 Composição
Dentre as partes utilizadas podemos destacar a raiz e a semente.
As sementes contêm celulose, uma pequena quantidade de cera e ácidos palmítico, esteárico e
pectínico (TESKE, 1997). Também apresenta aproximadamente 20% de óleo, 20% de matéria
protéica, 23% de matéria nitrogenada, 7% de gossipol e fenóis. O córtex da raiz contém ácido
gossípico, resina, fitosterol, óleos fixos, gossipol, açúcares, gomas, taninos, clorofila,
acetovanilona, ácido salicílico, substâncias fenólicas e betaína. O óleo fixo é constituinte de
glicerídeos do ácido palmítico, linoléico, oléico e esteárico, acompanhados de menores quantidades
9
de ésteres dos ácidos araquídico, mirístico, miristoleico, palmitoleico e respectivos ácidos livres
(SOUZA, 1991).
O constituinte químico ativo do algodoeiro é o gossipol (C30H30O8) (Figura 4). È um
pigmento amarelo de ocorrência natural em plantas da Família Malvaceae, em especial nas
sementes de espécies de Gossypium (ABOU-DONIA, 1976). È também encontrado no córtex da raiz.
O gossipol é solúvel em metanol, etanol, éter, clorofórmio e dimetilformamida. Muito solúvel
em soluções diluídas aquosas de carbonato de sódio onde se decompõe rapidamente. È insolúvel
em água (THE MERCK INDEX, 1976).
É um sesquiterpeno dimérico. É um composto binaftil. È quiral devido à rotação restrita em
torno da ligação internaftil. O isômero (-) é ativo como contraceptivo masculino e os sintomas
tóxicos são provenientes do isômero (+) (Figura 4).
FIGURA 4 Estrutura Química do Gossipol
2.2.3 Aspectos Farmacológicos
A atividade biológica do isômero (-) do gossipol foi evidenciado a partir de relatos de vários
autores (MORRIS et al.,1986, JOSEPH et al., 1986, TANPHAICHITR et al., 1988, MATLIN et al., 1988, LIN et
al., 1989 E GONZÁLEZ-GARZA et al., 1993).
O gossipol, constituinte amplamente estudado em nove espécies de Malvaceae é utilizada na
medicina tradicional em disenteria, gonorréia e como antisséptico (AGUILAR et al., 1994).
O gossipol no decorrer dos anos foi estudado e testado em atividades in vitro e in vivo contra
diversos agentes patogênicos como Trypanosoma cruzi (MONTAMAT et al., 1982, ABE et al., 1986),
Plasmodium falciparum (ROYER et al., 1986, TRIPATHI et al., 2004), Entamoeba histolytica
(GONZÁLEZ-GARZA et al., 1989), Trichomonas vaginalis (GONZÁLEZ-GARZA et al., 1995), Giardia
lamblia (MATA-CARDENAS et al., 1998), herpes simplex vírus II (RADOLPH et al., 1986) e vírus HIV
(ROYER et al., 1991). Também tem ações inseticidas, antimicrobianas e antifertilizantes (STIPANOVIC
et al., 1984, FISHER et al., 1988, PERCY et al., 1996).
10
Os efeitos do gossipol sobre a reprodução foram vistos após estudos de LIU (1957) APUD QIAN
E WANG (1984). O interesse pelo gossipol iniciou-se com a descoberta das suas propriedades
anticonceptivas masculinas, além de apresentar resultados satisfatórios no tratamento de alguns tipos
de câncer . Testes clínicos indicam que o gossipol passou a ser utilizados no controle dos cânceres de
mama e genital (BAND et al., 1989, HU et al., 1994, LIU et al., 2002).
Cientistas usam o gossipol no tratamento da endometriose (ZHANG et al.,1994) porque ele tem
ação inibitória enzimática inespecífica (HERVE et al., 1996), proporcionando a alteração da divisão
celular.
O uso do gossipol pode causar irritação no trato gastrointestinal (THE MERCK INDEX, 1976); em
altas doses e ingestões por tempo prolongado, pode ser hepatotóxico (ALI ET AL.,1984). Estudos em
animais demonstraram que em doses elevadas provocaram edema pulmonar, paralisia e diminuição
da respiração (THE MERCK INDEX, 1976).
O gossipol, hoje é encontrado, para tratamento específico de algumas doenças. Podemos então
destacar algumas: Câncer (adrenal): comprimidos: 40 a 60 mg ao dia (FLACK et al., 1993); câncer
(glioma): comprimido: gossipol racêmico, 10 mg, todos os dias, durante um mês (BUSHUMOW et al.,
1999); controle de Natalidade: Mulheres (gel vaginal): Aplicação do gel de gossipol-ácido acético
(0,5 g/mL) na vagina, após o ato sexual (RATSULA et al., 1983); controle de natalidade: Homens
(comprimidos): 10 a 20 mg (dia) por um período de 75 e 180 dias até a redução da quantidade de
esperma após exame (LIU et al., 1987, COUTINHO et al., 1988, COUTINHO et al., 2000, GU et al., 2000).
O gossipol também pode apresentar interações com algumas drogas tais como cloroquina
(NWOHA, et al.,1995), digoxina (SHAOZHEN, 1980, LIU et al., 1988, YE et al., 1989), ferro (HERMAN et
al., 1973), anti-inflamatórios não esteróides (DESMET et al., 1993, WAGNER et al.,1995 DESMET et al.,
1993), e com etanol (MESSIHA et al., 1991, AKINGBEMI et al., 1997)
O algodoeiro como planta medicinal é bastante utilizado popularmente. A parte usada (cascas
da raiz) é empregada na forma de cozimento, extrato fluido e tintura (CRUZ, 1965). É utilizado como
emoliente e diurético. Favorece a digestão, contribui para um melhor funcionamento das vias
urinárias, combate algumas doenças de pele como espinhas, cravos e boubas (CRUZ, 1965). Suas
mais importantes ações são para as enfermidades da mulher. É assim que, sendo um vegetal de
comprovada ação hemostática, dá os melhores resultados no combate às desordens menstruais e nas
hemorragias após o parto. Emprega-se ainda no tratamento das inflamações e dores do útero e do
ovário e na retenção da placenta, usando-se igualmente para provocar contrações uterinas (CRUZ,
1965).
2.3 Estudos sobre Viburnum opulus L.
11
2.3.1 Botânico
O gênero compreende mais de 230 espécies, distribuídas na América do Sul (Peru) até
Sudeste da Ásia, onde apresenta a maioria dos exemplares (EGLOF, 1962). O viburnum
(Caprifoliaceae) contém várias espécies, mas somente 21 estão sendo estudadas, sob o ponto de
vista químico (KUO, 1992).
Nativo da Ásia Ocidental, norte da África e Europa meridional, o Viburnum opulus cresce ao
abrigo de bosques subtropicais úmidos, zonas pantanosas e terrenos em altitudes de até 1.200
metros (ALONSO, 1998). Também é bastante distribuído na América do Norte, e, foram utilizadas
por aborígines americanos, para tratamento de doenças espasmódicas, especificamente as
dismenorréias.
É uma árvore pequena, que apresenta altura máxima de 5 m. O tronco apresenta córtex claro,
liso e muito ramificado, as folhas podem ser tri ou pentalobuladas, dentadas. Apresenta flores
brancas, que aparecem no final da primavera e início do verão (Figura 5). As inflorescências dão
origem a frutos, de cor roxa e ovalados e com uma semente em seu interior (ALONSO, 1998).
Dentre a vasta sinonímia vulgar, o V. opulus apresenta nomes populares viburno americano,
bola de neve, rosa-de-guelres e viorne (ALONSO, 1998). Na Europa, sobretudo em Portugal, é
bastante conhecido como Espinheiro negro.
As partes da planta utilizadas para uso medicinal são a casca do tronco e dos ramos (CUNHA et
al., 2003).
12
FIGURA 5 Viburnum opulus (figura extraída de www.missouriplants.com/
Whiteopp/Viburnum_opul...)
2.3.2 Composição
As espécies de Viburnum caracterizam-se quimicamente por apresentar iridóides,
triterpenóides, cumarinas e flavonas (KUROYANAGI et al., 1986, IWAGAWA et al., 1994, MACHIDA et
al., 1997).
O V. opulus apresenta vários constituintes químicos enumerados a seguir, segundo ALONSO
(1998): Cumarinas (escopoletina, esculetina e escopolina), ácidos orgânicos (ácido clorogênico,
ácido isoclorogênico, ácido salicílico (0,2%), ácido oxálico, ácido cítrico, ácido málico e ácido
isovaleriânico (presente no córtex), flavonóides (amentoflavona), ácidos triterpênicos (ácido
ursólico e ácido oleanólico) e outros (taninos (2%) triterpenos (alfa e beta amirina), princípio
amargo (viburnina, presente nas folhas e nos frutos ) e óleo essencial.
+
13
2.3.3 Aspectos Farmacológicos
Dentre os componentes ativos, alguns tem atividade farmacológica. Os ácidos fenólicos,
juntamente com a fração flavonóide apresentam ação diurética, antisséptica, antiinflamatória e
venotônica (ALONSO, 1998).
A atividade antiespasmódica de alguns extratos vegetais de espécies de Viburnum, tem sido
atribuída ao teor de escopoletina (6-metoxi-7-hidroxicumarina) (Figura 6) e outras cumarinas
(JARBOE et al., 1967, TYLER et al., 1979, e ROBBERS et al., 1996). A escopoletina também regula a
pressão arterial. Ela dilata os vasos sanguíneos, atua contra a sobrecarga de trabalho do coração.
FIGURA 6 Estrutura Química da Escopoletina
Segundo estudos de ROMERO (1997) a escopoletina nas concentrações de 25,70 - 524,80 M,
inibiu as contrações induzidas por uma variedade de agonistas que incluem a fenilefrina, potássio,
serotonina e prostaglandina 2
(PGF2 ) em anéis de aorta isolados de rato. O efeito dessa
cumarina nas contrações induzidas por fenilefrina não foi afetado pela remoção do endotélio ou
bloqueio da NO-sintase pelo L-NAME. A escopoletina não interferiu com a reestocagem dos
estoques intracelulares sensíveis à noradrenalina. Isto sugere que a ação espasmolítica não
específica da escopoletina pode ser atribuída pelo menos em parte à sua habilidade de inibir a
mobilização do cálcio intracelular dos estoques sensíveis à noradrenalina.
Também há estudos que a escopoletina apresenta atividade bacteriostática em várias espécies
de bactérias (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus sp, Klebsiella pneumoniae e
Pseudomonas aeruginosa) (www.phytochemicals.info/phytochemicals/scopoletin
acessada em
22/05/2005). Também atua contra as inflamações, é anti-histamínico e é coadjuvante no tratamento
de artrite e bursite e contra tendovaginites.
Outro componente ativo importante a ser destacado é a amentoflavona (Figura 7). É um
biflavonóide dimérico. que demonstrou ação anti-ulcerogênica (GOEL, 1988), inibidor dos vírus
influenza A e B e herpes 1 e 2 (LIN, 1999), inibidor da fosfolipase A2 e ciclo-oxigenase após
indução da inflamação pela carragenina (KIM, 1998) e inibição da ligação entre os
benzodiazepínicos e o receptor de GABA-A in vitro (BAUREITHEL, 1997). Apresenta também ação
venotônica, vasoconstrictora, hemostática e diurética (ALONSO, 1998). Também tem ação inibitória
sob betaglucuronidase e lizosima em neutrófilos de ratos (TORDERA, 1994).
14
FIGURA 7 Estrutura Química da Amentoflavona
O ácido ursólico (Figura 8) outro componente encontrado que apresenta ação frente ao
Plasmodium falciparum no caso da resistência dele à cloroquina (STEELE, 1999), e também para
combate à leucemia (BAEK, 1997).
FIGURA 8 Estrutura Química do Ácido Ursólico
Foi também encontrado o viopudial, com atividade antiespasmódica sobre o músculo liso
(NICHOLSON et al., 1972).
A viburnina, encontrada nos frutos, pode provocar gastroenterocolite, ao ser consumido
fresco. Para evitar este efeito, deve-se ferver os frutos previamente (ALONSO, 1998).
O gênero Viburnum foi usado por muitos anos como antiarbotivo (OSOL, 1955). Foi observada
ainda propriedade relaxante no útero, a partir do extrato metanólico (JARBOE et al., 1966). É usado
como regulador intestinal e relaxante dos ovários e do útero, é bastante efetivo na prevenção do
aborto e de afecções nervosas durante a gravidez. Também promove diminuição do fluxo
menstrual.
Pelo fato de apresentar efeito espasmolítico, podem ser empregados em cólicas, bronquites
espasmódicas, cãímbras, metrorragias e dismenorréias. A sua atividade adstringente é útil na
diarréia e feridas superficiais de pele. As decocções são usadas para aftas e úlceras, e em desordens
15
a nível oftálmico. Na Europa tem sido usado em convulsões por epilepsia (ALONSO, 1998). Ele
ainda reduz a pressão arterial, pelo fato de relaxar a musculatura dos vasos (ALONSO, 1998).
2.4 Produção de Fitoterápicos e Controle de Qualidade
O produto fitoterápico, segundo legislação em vigor (RDC N 48, de 16 de Março de 2004, da
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)), deixa entrever que, para a transformação de
uma planta em medicamento, é necessário preservar a integridade química e farmacológica do
vegetal, garantindo a constância de ação biológica e segurança de utilização, além de valorizar o
seu potencial terapêutico (SIMÕES et. al, 2004).
Para alcançar esses objetivos, a produção de fitoterápicos requer estudos prévios relativos a
vários aspectos (agronômicos, botânicos, químicos, farmacológicos, toxicológicos) e de
desenvolvimento de metodologias analíticas e tecnológicas (PETROVICK et al, 1997).
Estudos Botânicos
Objetiva a identificação inequívoca de uma espécie vegetal, através de análise de
características anatômicas e morfológicas. È importante também estabelecer características
botânicas comparativas que possam detectar a presença de uma ou mais espécies adulterantes
(SIMÕES et al, 2004).
Estudos Agronômicos
Tais estudos visam à produção abundante e homogênea de matéria-prima, preservando o meio
ambiente, espécie e biodiversidade.Os aspectos a serem investigados visam à otimização da
produção da produção a partir de estudos edáfico-climáticos, densidade de plantio, necessidades
nutricionais, beneficiamento e armazenamento, melhoramento genético e ocorrência de pragas
(IKUTA, 1993).
Estudos Químicos
È compreendido neste estudo, as etapas de isolamento, elucidação estrutural e identificação de
constituintes, responsáveis ou não pela ação biológica. Também pode-se aplicar o estabelecimento
de marcadores químicos, indispensáveis para planejamento e monitoramento das ações de
transformação tecnológicas e para estudos de estabilidade dos produtos intermediário e final
(SIMÕES et al, 2004).
Estudos de Atividade Biológica
A avaliação da atividade biológica inclui a investigação da atividade farmacológica e
toxicológica de substâncias isoladas, de frações ou extratos da droga vegetal (SIMÕES et al, 2004).
Independentemente do ponto de vista considerado, o conhecimento dos aspectos de atividade
16
biológica do vegetal é requisito essencial para a transformação da planta medicinal em produto
fitoterápico (DE SMET, 1997).
Estudos de Desenvolvimento de Metodologias Analíticas
Os métodos analíticos permitem a avaliação da qualidade do produto fitoterápico, garantindo
a constância de ação terapâutica e segurança de utilização. Os métodos analíticos cumprem funções
diferenciadas segundo Simões et al (2004):
a) Avaliação do teor de substância ou grupo de substâncias ativas e do perfil qualitativo dos
constituintes químicos de interesse presentes na matéria-prima vegetal, produtos intermediários e
produto final.
Tal avaliação, que pode ser de forma qualitativa, semi-quantitativa ou qualitativa, envolve a
utilização de métodos espectrofotométricos, cromatográficos, físicos, físico-químicos ou químicos.
Quando os constituintes químicos são desconhecidos, as análises são realizadas com uso de
marcadores químicos, a partir de abundância, facilidade de detecção e doseamento (SIMÕES et al,
2004).
Se o objetivo da análise é o controle de qualidade de qualidade do produto acabado, as
exigências analíticas se baseiam em diversos fatores como especificidade, exatidão, precisão e
tempo de rotina analítica. Para fins de controle de qualidade e registro do produto fitoterápico, o
método analítico deve ser validado para uma substância ou grupo de substâncias (PETRY, 1999).
Também é recomendado estudos de estabilidade, permitindo, inclusive, a detecção de produtos
oriundos da degradação de substâncias ativas, ou marcadores químicos.
b) Avaliação das características físicas e físico-químicas dos produtos tecnologicamente
transformados.
A utilização de métodos analíticos que visam a quantificação de substâncias ativas ou de
referência e aspectos relativos à forma farmacêutica são essenciais para a obtenção da
homogeneidade dos lotes produzidos.
2.5 Controle de Qualidade de Fitoterápicos
A qualidade é definida como o conjunto de critérios que caracterizam a matéria-prima para o
uso a qual se destina.
A partir do momento que haja parâmetros de qualidade para a matéria-prima e levando-se em
consideração um planejamento adequado e um controle rigoroso do processo de produção do
medicamento, a qualidade do produto final poderá estar assegurada (GAEDCKE, 2000). A qualidade
da matéria-prima vegetal é de fundamental importância para a qualidade do fitoterápico (SIMÕES et
al, 2004).
17
Contudo, não só a qualidade das matérias-primas vegetais garante a eficácia a segurança e a
qualidade do produto final. A eficácia é dada pela comprovação, por ensaios farmacológicos pré-
clínicos e clínicos e efeitos biológicos. A segurança é determinada por ensaios que comprovam a
ausência de efeitos tóxicos e inexistência de contaminantes nocivos à saúde (metais pesados,
agrotóxicos, microorganismos, produtos de degradação). A segurança e eficácia de um fitoterépico
são definidas para cada produto, pois dependem de fatores como obtenção de extratos, formulação
farmacêutica do produto final, entre outros (SIMÕES et al, 2004).
Assim, é importante a pré-definição de parâmetros de qualidade para a matéria-prima vegetal,
além de procedimentos de preparação dos extratos padronizados (produtos padronizados).
A qualidade das matérias-primas deve ser realizada de acordo com bases científicas e
técnicas. Nos procedimentos de rotina na análise de qualidade, geralmente é preconizado o
emprego de metodologias químicas, físicas ou físico-químicas e biológicas com as necessidades de
correlação entre os parâmetros analisados e a finalidade a qual se destina (SIMÕES et al, 2004).
Os parâmetros de qualidade para fins farmacêuticos são em princípio estabelecidos nas
Farmacopéias. Para as matérias-primas vegetais, oriundas de plantas clássicas (estudadas sob o
ponto de vista químico e farmacológico) existem monografias definindo alguns critérios
(identidade, pureza e teor).
Alguns parâmetros essenciais para a qualidade da matéria-prima vegetal podem sofre variação
dependendo da procedência do material. As variações na composição química, na pureza e nas
características fenotípicas ressaltam a importância dos estudos de caracterização farmacognóstica,
relacionadas com atividade farmacológica. Sendo assim, a origem geográfica exata e as condições
de cultivo, estágio de desenvolvimento, colheita, secagem e armazenamento, bem como de
tratamento com agrotóxicos, descontaminantes e conservantes devem ser conhecidos (BHP, 1996).
Os ensaios de qualidade de matérias-primas vegetais preconizados nas farmacopéias e
diferentes literaturas de área objetivam a verificação de identidade botânica do material, pureza do
material e caracterização dos constituintes químicos da espécie. Todo o procedimento analítico
deve ser validado e nos ensaios quantitativos, variações nos resultados deverão ser consideradas
estatisticamente. Nas análises das matérias-primas é preconizada a realização destes ensaios em
triplicata, calculando-se a média e o coeficiente de variação (SIMÕES et al, 2004).
2.6 Validação de Metodologia Analítica
Hoje, várias normas, tanto nacionais quanto internacionais, e também os sistemas da
qualidade denotam destaque no tocante à importância da validação de métodos analíticos e a
18
documentação do trabalho de validação, para a obtenção de resultados confiáveis e adequados ao
uso pretendido.
A validação de metodologia analítica é um aspecto bastante importante e vital para a garantia
da qualidade analítica e se constitui numa das exigências das normas de Boas Práticas de
fabricação (BPF) vigentes. Os métodos de ensaio para avaliar a conformidade dos produtos
farmacêuticos com especificações estabelecidas devem atingir padrões adequados de exatidão,
precisão e confiabilidade (BARROS, 2002).
A validação de método analítico é a confirmação por exame e fornecimento de evidência
objetiva de que os requisitos específicos para um determinado uso pretendido são atendidos (NBR
ISO/IEC 17025, 2001). A validação inclui a especificação dos requisitos do método;
determinação das características do método; verificação de que os requisitos podem ser atendidos
com o uso do método e uma declaração sobre a validade do método (NBR ISO/IEC 17025, 2001).
É de fato importante o uso de ferramentas estatísticas adequadas tais como teste T de student
e F, análise de variância, regressão linear, entre outras; é indicado para demonstração de
evidência objetiva da validade do método.
A farmacopéia americana (USP 25, 2002), na seção de Ensaios Gerais, apresenta
recomendações para a validação de métodos analíticos e apresenta também um sumários das
características de desempenho requeridas para os vários tipos de métodos de ensaios. Então
define-se que a validação de metodologia demonstra que o método é adequado ao uso
pretendido.
De acordo com a Resolução n
899, de 29 de Maio de 2003, do Ministério da Saúde, a
metodologia será considerada validada, desde que sejam avaliados parâmetros relacionados
abaixo:
Especificidade / Seletividade
Curva de Calibração / Linearidade
Intervalos da Curva de Calibração
Precisão
Limite de Detecção (LD)
Limite de Quantificação (LQ)
Exatidão
Robustez
19
Tanto a USP (The United States Pharmacopoea) quanto ICH (International Conference of
Harmonization) reconhecem que não existe necessidade de avaliar todos os parâmetros de
performance analítica. O tipo de método e seu respectivo uso determinam quais parâmetros
devem ser investigados.
O processo de validação pode dividir os ensaios analíticos em 4 categorias, dependendo dos
parâmetros analisados:
Categoria I - Quantificação do componente em maior quantidade ou ingrediente ativo
Categoria II
Determinação de impurezas ou produtos de degradação em produtos
farmacêuticos ou matéria-prima
Categoria III
Determinação das características de performance, como por exemplo:
dissolução, liberação do ativo
Categoria IV Testes de Identificação
3. OBJETIVO
3.1 Geral
Avaliar o perfil fitoquímico, definir parâmetros de controle de qualidade das matérias-primas
das três plantas e do produto (Robusterina), desenvolver e validar metodologia analítica de
doseamento para a Robusterina.
3.2 Específico
Determinar o perfil fitoquímico de Berberis vulgaris, Gossypium herbaceum e Viburnum
opulus;
Estabelecer especificações de Controle de Qualidade para as matérias-primas (cascas de raiz e
caule);
Estabelecer especificações de Controle de Qualidade para a Robusterina;
Desenvolver uma metodologia analítica para alcalóides na Robusterina;
Validar metodologia de quantificação espectrofotométrica de alcalóides em produto contendo
Berberis vulgaris.
20
4.ARTIGO I Artigo a ser submetido
21
DETERMINAÇÃO DE ESPECIFICAÇÕES PARA CONTROLE DE
QUALIDADE DAS MATÉRIAS-PRIMAS UTILIZADAS NA PRODUÇÃO DE
FITOTERÁPICO EMPREGADO PARA DISFUNÇÕES DO CICLO
MENSTRUAL
Marcos A.C. de Oliveira 1, Miracy M. de Albuquerque 1*, Haroudo S. Xavier 2, Ruth R.
Strattmann 1, Severino G. Junior 1, Adelaide T. Queiroz 3.
1 - Núcleo de Controle de Qualidade de Medicamentos e Correlatos, Departamento de
Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE
2 - Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade
Federal de Pernambuco, Recife-PE
3 - Diniz & Brandão S. A Indústria e Comércio, Jaboatão dos Guararapes-PE
_________________________________________________________________________
RESUMO
As plantas medicinais são responsáveis por ¼ do total de prescrições médicas nos países
desenvolvidos. No Brasil o consumo de medicamentos de origem vegetal vem crescendo, por
promover o suprimento de necessidades primárias da população carente. No estudo proposto, foram
determinadas as especificações para controle de qualidade para as plantas, utilizadas no fitoterápico
Robusterina composto por Berberis vulgaris (casca da raiz), Gossypium herbaceum (casca da raiz)
e Viburnum opulus (casca do caule), especificações estas que não constam em compêndios oficiais,
sendo necessário estabelecê-las. Foram analisados, matéria orgânica estranha, perda por
dessecação, cinzas (totais, insolúveis em ácido e sulfatadas) e metais pesados. No que se refere a
matéria orgânica estranha podemos preconizar um máximo de 3%, a partir de recomendações do
documento Quality control methods for medicinal plants materials da Organização Mundial de
Saúde (OMS) já que os resultados encontrados estão abaixo deste limite (média de 1,66% para B.
vulgaris, 0,82% para G. herbaceum e 1,64% para V. opulus). Referente ao teor de água, pode-se
estabelecer limites 9,22
0,26 % (B. vulgaris), 10,25
0,19 % (G. herbaceum) e 9,27
10 %
(Viburnum opulus), visto que não se encontram em compêndios oficiais. No que se refere a cinzas
totais, podemos sugerir 7,10
0,31 % (B. vulgaris), 13,36 0,18 % (G. herbaceum) e 11,73 0,23
% (V. opulus). Quanto às cinzas insolúveis em ácido, podemos sugerir 5,55
0,31 (B. vulgaris),
4,29
0,12 % (G. herbaceum) e 5,09
0,09 % (Viburnum opulus). Para o parâmetro cinzas
sulfatadas podemos sugerir 4,6
0,5 %, (B. vulgaris), 6,9
0,17 % (G. herbaceum)e 4,18
0,10
%.(V. opulus) Todos obtidos a partir de valores máximos e mínimos encontrados. O
22
estabelecimento destes critérios, com valores mínimos e máximos, garante a determinação de
especificações de qualidade, que pode ser monitorado e acompanhado.
Unitermos: Fitoterápico; Parâmetros de Controle de Qualidade; Robusterina
*Contato com o autor: Fone/Fax: (81) 2126-8571/2126-8572. E-mail: [email protected]
Abstract: Determination of specifications for Quality Control the raw materials used to the
production of Phytopharmaceutical used to disfuctions of menstrual cycle
The medicinal plants are responsible for ¼ of the total of medical lapsings in the developed
countries. In Brazil the use of such products is increasing, for promoting the suppliment of primary
necessities of the devoid population. In the considered study, the specifications for quality control
for the plants, used in the phytopharmaceutical Robusterina composed for Berberis vulgaris (root
bark), Gossypium herbaceum (root bark) and Viburnum opulus (stem bark) had been determined
specifications these that do not consist in official compendiums, being necessary to establish them.
They had been analyzed, organic substance stranger, loss for dessecation, leached ashes (total,
insoluble in acid and sulfatated) and heavy metals. For organic substance stranger we can praise in
maximun 3%, from recommendations of the document "Quality control methods will be medicinal
plants materials" of the World Health Organization (WHO) since the joined results are below of
this limit (average of 1,66% for B. vulgaris, 0.82% for G. herbaceum and 1.64% for V. opulus).
Referring to the water text, it can be established limits of 9,22 ± 0,26 % (B. vulgaris), 10,25 ± 0,19
% (G. herbaceum) and 9,27 ± 10 % (Viburnum opulus), since they do not meet in official
compendiums. For total leached ashes, we can suggest 7,10 ± 0.31 % (B. vulgaris), 13,36 ± 0,18 %
(G. herbaceum) and 11,73 ± 0,23 % (V. opulus). How much to insoluble leached ashes in acid, we
can suggest 5,55 ± 0.31 (B. vulgaris), 4,29 ± 0,12 % (G. herbaceum) and 5,09 ± 0,09 % (Viburnum
opulus). For the parameter leached ashes sulfatated we can suggest 4,6 ± 0,5 %, (B. vulgaris ), 6,9 ±
0,17 % (G. herbaceum)e 4,18 ± 0,10 %.(V. opulus) All gotten from found maximum and minimum
values. The establishment of these criteria, with minimum and maximum values, guarantees the
determination of quality specifications, that can be monitored and be folloied.
Keywords: Parameters of Quality Control; Robusterina
4.1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais respondem por cerca de 25 % do total das prescrições médicas em
países industrializados (Farnsworth et al, 1976, Akerele, 1984); nos países em desenvolvimento a
participação de plantas medicinais no arsenal terapêutico alcança 80 %.
23
O consumo de medicamentos de origem vegetal tem aumentado no país, devido a diversos
fatores, dentre eles as necessidades da assistência primária da população (Luz et al, 1995),
sobretudo as mais carentes. Considerando este fato, o modismo e o preço dos medicamentos
industrializados, pode-se observar uma expansão do comércio de plantas medicinais a nível
mundial.
A participação crescente de medicamentos de origem vegetal no arsenal terapêutico, aumenta
a necessidade de efetuar o controle de qualidade, através de técnicas eficientes. As plantas
medicinais, que constituem matéria-prima para produção de fitoterápicos podem apresentar
variações no teor de princípios ativos e deteriorações (Sharapin, 2001). Os fitoterápicos apresentam
fatores intrínsecos (quimiotaxonomia e variabilidade química) que são devidos à planta em si e
fatores extrínsecos (agronomia). A presença ou ausência de substâncias farmacologicamente ativas
pode variar muito dentro da mesma espécie. A composição química varia, também, de acordo com
o local de colheita, das condições de clima e solo, da época do ano em que a colheita é realizada e
das diferentes técnicas de cultivo (Sharapin, 2001).
Entende-se por qualidade o conjunto de critérios que caracterizam a matéria-prima para o uso
ao qual se destina. O estabelecimento de parâmetros de qualidade para a matéria-prima, adicionada
a um planejamento e controle de processo de produção pode desencadear uma melhor qualidade do
produto final (Gaedcke et al., 2000).
A identificação e pureza da droga, bem como a avaliação e determinação dos princípios ativos
são tarefas indispensáveis para obtenção de produtos de boa qualidade (Oliveira et al., 1996).
A Resolução RDC N
48, de 16 de Março de 2004, da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA), regula os medicamentos fitoterápicos e, para efeito de registro, exige relatório
de controle de qualidade. Apesar dos esforços da ANVISA, a atividade de farmacovigilância é
incipiente e praticamente inexistente para fitoterápicos (Brandão et al., 1998).
A partir do pressuposto legal em vigor, que define o fitoterápico como medicamento e que a
ele se aplicam todas as exigências técnicas pertinentes, busca-se tornar disponíveis o total das
informações que permitam a execução do controle de qualidade que atende minimamente as
exigências.
O presente trabalho visa determinar parâmetros de qualidade para as partes das plantas
utilizadas (Berberis vulgaris, Gossypium herbaceum e Viburnum opulus) na produção da
Robusterina.
Foram analisados matéria orgânica estranha, perda por dessecação, cinzas (totais, insolúveis
em ácido e sulfatadas) e metais pesados. O estabelecimento desses critérios, permitem o
24
acompanhamento e a documentação de todos os procedimentos e é fundamental para assegurar a
qualidade.
Relativo ao teor de água, a droga vegetal deve ter o mínimo de umidade para uma boa
conservação. O excesso de umidade em matérias-primas vegetais permite a ação de enzimas,
podendo acarretar a degradação de constituintes químicos, além de proporcionar o desenvolvimento
de fungos e bactérias (Simões et al., 2004). O teor máximo de umidade estabelecido nas diferentes
farmacopéias varia entre 8 e 14%, com poucas exceções especificadas nas monografias. Estes
valores podem ser menores, especialmente nas drogas que tem a facilidade de absorvê-la e quando
esse excesso possa causar deterioração. (Sharapin, 2001) Como as plantas utilizadas não constam
em farmacopéias, tivemos que analisá-las e determinar os parâmetros.
No que se refere as cinzas, sua determinação compreende a caracterização de cinzas totais,
cinzas sulfatadas (resíduo de incineração) e cinzas insolúveis em ácido clorídrico. As cinzas totais
envolvem a determinação tanto das cinzas fisiológicas e das não fisiológicas e consiste em medir a
quantidade do resíduo não volatilizado após a calcinação da droga (Sharapin, 2001). Cinzas
sulfatadas são representadas pelo resíduo não volatilizado após calcinação com ácido sulfúrico
concentrado. Freqüentemente é recomendado, o tratamento prévio da amostra, com ácido sulfúrico,
aumentando a reprodutibilidade do método, sendo, geralmente, o mais indicado para drogas
vegetais (Hartke, 1986). Os metais presentes na droga convertem-se em sulfatos, e, como estes são
mais estáveis ao calor, permitem obter resultados mais precisos do que aqueles obtidos por simples
calcinação (Sharapin, 2001). As cinzas insolúveis em ácido se obtém do resíduo de cinzas totais ou
sulfatadas, após fervura com ácido clorídrico diluído. O processo se completa com a filtração para
afastar os solúveis e pela ignição do resíduo. Este procedimento permite determinar o teor de sílica,
areia e terra silícea presentes na droga (Sharapin, 2001) As cinzas insolúveis expressam o conteúdo
em derivados de sílica decorrentes da contaminação da droga com areia e/ou terra. São dados
interessantes que podem ser entendidos também, como valores quantitativos próximos a um
doseamento (Marques, 1996). A análise de cinzas é importante no controle de qualidade de drogas
vegetais, principalmente quando estas se apresentam pulverizadas (Luz et al, 1995). No caso de
Berberis vulgaris, Gossypium herbaceum e Viburnum opulus não foram encontrados citações
para os parâmetros de cinzas (totais, insolúveis em ácido e sulfatadas).
O estabelecimento de limites de tolerância para metais pesados em plantas medicinais tem
sido discutido. Os procedimentos usuais de extração de drogas vegetais são capazes de extrair
percentuais de metais pesados que variam de 3 a 48% presentes na droga. Além do mais, nos dias
atuais, técnicas específicas podem permitir a descontaminação do vegetal (Schilcher et al., 1987). O
ensaio limite para metais pesados permite que impurezas metálicas reajam colorimetricamente com
25
o íon sulfeto e não pode ultrapassar o limite especificado nas monografias em termos de
microgramas de chumbo por grama da amostra em análise (Farmacopéia Brasileira IV Edição,1988,
V.3.2.3). Analogamente, a reação com tioacetamida pode ser empregada para a determinação do
limite de metais pesados, em termos de chumbo.
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
O material utilizado (cascas da raiz de Berberis vulgaris, cascas da raiz de Gossypium
herbaceum e casca de caule de Viburnum opulus sendo três lotes de cada planta denominados lote
1a, 1b e 1c) foi gentilmente cedido pelo laboratório Diniz & Brandão, que adquire a partir do
distribuidor QUIMER. A casca da raiz de B. vulgaris é procedente da Europa e originária da Ásia,
coletada no mês de maio, seca ao sol e apresenta uma granulometria 3.0. A Casca do caule de V.
opulus é procedente da Índia, coletada no mês de maio, seca ao sol e apresenta uma granulometria
de 3.0. A casca do caule de G. herbaceum é fornecida pelo Laboratório Diniz & Brandão, tem
procedência na Região Metropolitana do Recife, coletada no mês de maio, seca ao sol.
4.2.1 MATERIAL
4.2.2 REAGENTES
Ácido clorídrico 3 M, Água destilada, Ácido sulfúrico concentrado, Solução padrão de
chumbo (10 ppm Pb), Solução a 25% (p/V) de sulfato de magnésio em ácido sulfúrico M, Àcido
sulfúrico M, Ácido clorídrico 0,2 M, Fenolftaleína SI, Hidróxido de amônio 6 M, Ácido acético
glacial, Tampão acetato pH 3,5, Reagente de tioacetamida.
4.3 MÉTODOS +
4.3.1 ANÁLISE DAS MATÉRIAS-PRIMAS VEGETAIS
4.3.1.1 CARACTERIZAÇÕES FÍSICAS +
DETERMINAÇÃO DE MATERIAL ESTRANHO
As amostras (cascas da raiz de Berberis vulgaris, cascas da raiz de Gossypium herbaceum e
casca de caule de Viburnum opulus) foram analisadas, com auxílio de uma lupa (lupa de mesa
simples, ampliação 2.4X; 7.3 dioptrias; foco 137.7mm), sendo todo o material estranho separado e
pesado em Balança eletrônica de precisão METTLER mod. AE 260. O resultado foi expresso em
porcentagem de elementos estranhos, com base no peso da tomada de ensaio (Farmacopéia
Brasileira IV Edição, 1988).
26
DETERMINAÇÃO DE ÁGUA
As amostras (cascas da raiz de Berberis vulgaris, cascas da raiz de Gossypium herbaceum e
casca de caule de Viburnum opulus) foram reduzidas a pó semi-fino (moído em moinho de faca e
passado em tamis) e determinada sua umidade pelo método gravimétrico (Farmacopeia Brasileira
IV Edição, 1988). As amostras foram dessecadas em estufa (Estufa de secagem e Esterilização
FANEM mod. 315 SE) a 100-105 C durante 5 horas. Após este tempo, as amostras foram
colocadas em dessecador para resfriamento e posterior pesagem. O ensaio foi dado como concluído
quando duas pesagens sucessivas não diferiram entre si por mais de 5 mg.
DETERMINAÇÃO DE CINZAS TOTAIS
As amostras (cascas da raiz de Berberis vulgaris, cascas da raiz de Gossypium herbaceum e
casca de caule de Viburnum opulus) foram reduzidas a pó semi-fino (moído em moinho de faca e
passado em tamis), pesadas e transferidas para cadinho previamente calcinado, resfriado e pesado.
Foram levados à ignição a temperatura de 675
25 C (USP 27) em Mufla (FORNITEC ROBERT
SHAW PYROTEC) até que todo o material fosse eliminado. As amostras foram resfriadas em
dessecador e pesadas. Foram calculadas a porcentagem de cinzas em relação à droga seca ao ar.
DETERMINAÇÃO DE CINZAS INSOLÚVEIS EM ÁCIDO
Os resíduos obtidos na determinação de cinzas totais foram fervidos por 5 minutos com 25
mL de ácido clorídrico 3 M (USP 25) em cadinho coberto com vidro de relógio. Após este tempo, o
vidro de relógio foi lavado com água quente, juntando-se a água ao cadinho. Filtrou-se o resíduo
insolúvel em ácido sobre papel isento de cinza, lavando o filtrado até que se mostre neutro. A
seguir as amostras foram levadas à ignição em Mufla (FORNITEC ROBERT SHAW PYROTEC),
resfriadas em dessecador e pesadas. Foram calculadas a porcentagem de cinzas insolúveis em
ácido, em relação à droga seca ao ar.
DETERMINAÇÃO DE CINZAS SULFATADAS
As amostras das cascas da raiz de Berberis vulgaris, cascas da raiz de Gossypium herbaceum
e casca de caule de Viburnum opulus foram reduzidas a pó semi-fino (moído em moinho de faca e
passado em tamis). Tomou-se 2 g das plantas pesadas e transferiu-se para cadinho previamente
calcinado, resfriado e pesado. Foram adicionados 2 mL de ácido sulfúrico M e aquecidos
brandamente sobre chapa quente até carbonização e a seguir foram incinerados cuidadosamente a
cerca de 800 C até desaparecimento do material. Foram resfriados e adicionados 1 mL de ácido
27
sulfúrico M para umedecer o resíduo que foi novamente calcinado e incinerados na estufa a 800 C
(Farmacopéia Brasileira IV Edição, V.2.10. 1988).
DETERMINAÇÃO DE METAIS PESADOS
As amostras (cascas da raiz de Berberis vulgaris, cascas da raiz de Gossypium herbaceum e
casca de caule de Viburnum opulus) foram reduzidas a pó, pesadas e transferidas para cadinho
previamente calcinado, resfriado e pesado. A determinação de metais pesados foi feita de acordo
com o ensaio limite para metais pesados (Farmacopéia Brasileira IV Edição, 1988).
4.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
DETERMINAÇÃO DE MATERIAL ESTRANHO
A Farmacopéia Brasileira (2000) inclui como impurezas, a presença de fungos, insetos e
outros materiais contaminantes. A OMS (WHO, 1998), preconiza a ausência de contaminações
visíveis, por fungos ou insetos, bem como contaminações animais, como excrementos em materiais
vegetais para fins medicinais.
No que se refere à pureza das drogas, não ocorreram problemas de contaminações ou
adulterações devido à procedência idônea do material. Para este item, a Organização Mundial de
Saúde (OMS) (WHO, 1992) estipula um máximo de 3% de matéria orgânica estranha que pode
apresentar-se junto com a droga. Para as três plantas, os resultados encontrados foram muito
inferiores ao preconizado pela OMS, podendo-se sugerir o valor máximo de 3% (Tabela 1) o que
confere a procedência idônea do material.
28
Tabela 1- Resultado da Pesquisa de Matéria Orgânica Estranha de Berberis vulgaris, Gosssypium
herbaceum e Viburnum opulus de lotes diferentes do mesmo fornecedor.
Ensaios Matéria Orgânica % Média
B. vulgaris * 1 2 3
Lotes 1 1,5 1,6 1,8 1,63 2 1,8 1,7 1,6 1,70 3 1,7 1,7 1,6 1,66
G. herbaceum * 1 2 3
Lotes 1 0,8 0,9 0,8 0,83 2 0,9 0,9 0,9 0,90 3 0,8 0,7 0,7 0,73
V. opulus** 1 2 3
Lotes 1 1,5 1,7 1,6 1,60 2 1,8 1,7 1,6 1,70 3 1,5 1,6 1,8 1,63
* Casca da Raiz ** Casca do Caule
DETERMINAÇÃO DE ÁGUA
Nas análises de determinação de água, as cascas de raiz de B. vulgaris apresentaram valor
mínimo de 8,96% e valor máximo de 9,49%. Analisando estatisticamente através do ANOVA
(análise de variância) pode-se afirmar que não há diferença significativa entre os resultados, para
um nível de confiança de 95%, já que o Fcalculado = 0,322 é menor que o Ftabelado = 5,14. Para cascas
da raiz de Gossypium herbaceum o valor mínimo obtido foi de 10,06% e o valor máximo de
10,45%. Analisando estatisticamente através do ANOVA não há diferença significativa em nível de
confiança de 95%, pois o Fcalculado = 0,274 é menor que o Ftabelado = 5,14. Para as cascas do caule de
V. opulus, o valor mínimo obtido foi de 9,17% e o valor máximo de 9,37%. Analisando
estatisticamente através do ANOVA, não há diferença estatisticamente significativa, para um nível
de confiança de 95%, já que o Fcalculado = 0,181 é menor que o Ftabelado = 5,14 (Tabela 2). A partir das
análises estatísticas podemos observar que os lotes utilizados não apresentaram diferenças
estatisticamente significativas entre eles. O teor máximo de umidade estabelecido nas diferentes
farmacopéias varia entre 8 e 14%, com poucas exceções especificadas nas monografias (Simões et
al., 2004).
29
Tabela 2 - Resultado da Pesquisa de determinação de umidade de Berberis vulgaris, Gosssypium
herbaceum e Viburnum opulus de lotes diferentes do mesmo fornecedor.
Ensaios de Determinação de Umidade % Média CV%
B. vulgaris* 1 2 3
Lotes 1 9,26 9,14 9,32 9,24 0,992 2 9,22 8,96 9,15 9,11 1,477 3 9,46 9,49 9,39 9,44 0,543
G. herbaceum* 1 2 3
Lotes 1 10,14 10,20 10,06 10,13 0,693 2 10,26 10,30 10,27 10,27 0,202 3 10,40 10,45 10,37 10,42 0,388
V. opulus** 1 2 3
Lotes 1 9,35 9,28 9,29 9,31 0,407 2 9,37 9,35 9,34 9,35 0,163 3 9,20 9,17 9,23 9,20 0,326
* Casca da Raiz ** Casca do Caule
DETERMINAÇÃO DE CINZAS (TOTAIS, INSOLÚVEIS EM ÁCIDO E SULFATADAS)
Para a B. vulgaris, as cinzas totais apresentaram entre os lotes, um valor mínimo de 6,79% e
um valor máximo de 7,42%. Analisando estatisticamente através do ANOVA não há diferença
significativa, para um nível de confiança de 95%, já que o Fcalculado = 0,05 é menor que o Ftabelado =
5,14. Para o G. herbaceum, as cinzas totais apresentaram entre os lotes, o valor mínimo de 13,18%
e um valor máximo de 13,55%. Neste caso o Fcalculado = 0,03 é menor que o Ftabelado = 5,14 não
havendo diferença significativa entre os resultados em nível de confiança de 95%. Para o V. opulus,
as cinzas totais apresentaram entre os lotes, o valor mínimo de 11,50% e um valor máximo de
11,97%. Analisando estatisticamente através do ANOVA não há diferença significativa, em nível
de confiança de 95%, já que o Fcalculado = 0,002 é inferior que o Ftabelado = 5,14. A Tabela 3 expressa
os resultados das cinzas totais das três plantas. A partir das análises estatísticas podemos observar
que os lotes utilizados não apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre eles.
30
Tabela 3 - Resultado da Pesquisa de cinzas totais de Berberis vulgaris, Gosssypium herbaceum e
Viburnum opulus de lotes diferentes do mesmo fornecedor.
Ensaios de Cinzas Totais % Média CV%
B. vulgaris* 1 2 3
Lotes 1 7,38 7,42 7,35 7,38 0,476 2 6,79 6,82 6,99 6,87 1,571 3 7,23 7,32 7,28 7,28 0,620
G. herbaceum* 1 2 3
Lotes 1 13,49 13,55 13,51 13,52 0,226 2 13,30 13,38 13,40 13,36 0,396 3 13,25 13,18 13,22 13,22 0,266
V. opulus** 1 2 3
Lotes 1 11,88 11,97 11,92 11,92 0,378 2 11,75 11,72 11,70 11,72 0,215 3 11,52 11,48 11,50 11,50 0,174
* Casca da Raiz ** Casca do Caule
Para a B. vulgaris em relação à determinação de cinzas insolúveis em ácido o valor mínimo
obtido foi de 5,24% e o máximo foi de 5,87%. Observou-se que não houve diferença
estatisticamente significativa, em nível de confiança de 95%, já que o Fcalculado = 0,06 é inferior ao
Ftabelado = 5,14. No G. herbaceum o valor mínimo obtido foi de 4,17% e o valor máximo foi de
4,41%. Analisando estatisticamente através do ANOVA não há diferença significativa entre os
resultados, em nível de confiança de 95%, pois o Fcalculado = 0,25 é menor que o Ftabelado = 5,14. Para
o V. opulus, as cinzas insolúveis em ácido apresentaram o valor mínimo de 5,00% e o valor
máximo de 5,18%. Observou-se que não houve diferenças estatisticamente significativas, em nível
de confiança de 95%, já que Fcalculado = 0,40 é menor que o Ftabelado = 5,14. A Tabela 4 denota os
resultados deste parâmetro, para as três plantas.
31
Tabela 4 - Resultado da Pesquisa de Cinzas Insolúveis em Ácido de Berberis vulgaris, Gosssypium
herbaceum e Viburnum opulus de lotes diferentes do mesmo fornecedor.
Ensaios de Cinzas Insolúveis em Ácido % Média CV%
B. vulgaris * 1 2 3
Lotes 1 5,24 5,29 5,32 5,28 0,765 2 5,45 5,48 5,51 5,48 0,547 3 5,75 5,87 5,81 5,81 1,033
G. herbaceum * 1 2 3
Lotes 1 4,17 4,19 4,22 4,19 0,600 2 4,32 4,35 4,37 4,35 0,579 3 4,34 4,37 4,41 4,37 0,803
V. opulus** 1 2 3
Lotes 1 5,12 5,10 5,08 5,10 0,392 2 5,08 5,06 5,00 5,05 0,825 3 5,18 5,20 5,16 5,18 0,386
* Casca da Raiz ** Casca do Caule
O B. vulgaris apresenta, para as cinzas sulfatadas, o valor mínimo de 4,45% e o valor máximo
de 4,75%. Analisando estatisticamente através do ANOVA não há diferença significativa entre os
resultados, em nível de confiança de 95%, já que o Fcalculado = 0,02 é inferior ao Ftabelado = 5,14. No
G. herbaceum, o valor mínimo foi de 6,73% e o valor máximo de 7,07%. Observou-se através do
ANOVA que não há diferença significativa, em nível de confiança de 95%, já que Fcalculado = 0,002
é inferior ao Ftabelado = 5,14. Para o V. opulus o valor mínimo obtido foi de 4,08% e o valor máximo
de 4,28%. Analisando estatisticamente através do ANOVA não há diferença significativa, em nível
de confiança de 95%, já que o Fcalculado = 0,04 é menor que o Ftabelado = 5,14. A Tabela 5 mostra os
resultados, expressos em %.
32
Tabela 5 - Resultado da Pesquisa de Cinzas Sulfatadas de Berberis vulgaris, Gosssypium
herbaceum e Viburnum opulus de lotes diferentes do mesmo fornecedor.
Ensaios de Cinzas Sulfatadas % Média CV%
B. vulgaris * 1 2 3
Lotes 1 4,75 4,70 4,68 4,71 0,765 2 4,45 4,50 4,52 4,49 0,803 3 4,60 4,65 4,59 4,61 0,697
G. herbaceum* 1 2 3
Lotes 1 7,07 7,03 7,00 7,03 0,499 2 6,95 6,92 6,97 6,95 0,362 3 6,73 6,82 6,78 6,78 0,665
V. opulus** 1 2 3
Lotes 1 4,20 4,18 4,13 4,17 0,865 2 4,30 4,33 4,28 4,30 0,585 3 4,12 4,08 4,14 4,11 0,743
* Casca da Raiz ** Casca do Caule +
DETERMINAÇÃO DE METAIS PESADOS
Foram observados que as amostras das plantas (cascas da raiz de Berberis vulgaris, cascas da
raiz de Gossypium herbaceum e casca de caule de Viburnum opulus) não apresentaram
contaminação por metais pesados, pois a cor marrom que se desenvolveu para a amostra não foi
mais intensa do que a obtida pelo padrão.
4.5 CONCLUSÃO
No que se refere a matéria orgânica estranha podemos preconizar um máximo de 3%. Para
este item, a Organização Mundial de Saúde (OMS) (WHO, 1992) estipula um máximo de 3% de
matéria orgânica estranha que pode apresentar-se junto com a droga. Os resultados encontrados
estão abaixo deste limite (média de 1,66% para B. vulgaris, 0,82% para G. herbaceum e 1,64% para
V. opulus). Referente ao teor de água, pode-se estabelecer limites 9,22
0,26 % (B. vulgaris),
10,25
0,19 % (G. herbaceum) e 9,27
10 % (Viburnum opulus). Como não foram encontrados
em compêndios oficiais, sugerimos estabelecer estes limites. Segundo Simões (2004), o teor
máximo de umidade estabelecido nas diferentes farmacopéias varia entre 8 e 14%, com poucas
exceções especificadas nas monografias. No que se refere a cinzas totais, podemos estabelecer
33
limites de 7,10
0,31 % (B. vulgaris), 13,36
0,18 % (G. herbaceum) e 11,73
0,23 % (V.
opulus). Quanto às cinzas insolúveis em ácido, podemos sugerir limites de 5,55
0,31 (B.
vulgaris), 4,29
0,12 % (G. herbaceum) e 5,09
0,09 % (Viburnum opulus). Para o parâmetro
cinzas sulfatadas podemos estabelecer limites de 4,6
0,5 %, (B. vulgaris), 6,9
0,17 % (G.
herbaceum)e 4,18
0,10 %.(V. opulus) Todos obtidos a partir de valores máximos e mínimos
encontrados. O estabelecimento destes critérios, com valores mínimos e máximos, garante a
determinação de especificações de qualidade, que pode ser monitorado e acompanhado, já que não
foram encontrados nos principais compêndios oficiais. E serve como prova documental para a
empresa comprovar e assegurar a qualidade, perante órgãos fiscalizadores.
4.6 AGRADECIMENTOS
Agradecemos à CAPES pela concessão bolsa de estudo ao primeiro autor e ao Laboratório
Diniz & Brandão pelo fornecimento das tinturas para o desenvolvimento do trabalho.
4.7 REFERÊNCIAS
FARNSWORTH, N. R.; MORRIS, R. H. Higher plants
the sleeping giant of drug development. Am. J. Pharm, v. 148, p. 46-52, 1976.
SCILCHER, H.; PETERS, H.; WANK, H. Pestizide und Schwermetalle in Arzneipflanzen und
Arzneipflanzen-Zubereitungen. Pharm. Ind. v. 49, n. 2, p.203-211, 1987.
BRANDÃO, M. G. L.; FREIRE, N.; VIANA-SOARES, C. D. Vigilância de Fitoterápicos em
Minas Gerais. Verificação da Qualidade de diferentes amostras comerciais de camomila. Cad. S.
Pub. v. 14, n. 3, p. 613-616, 1998.
AKERELE, O. WHO`s Tradicional Medicine Programme: progress and perspectives. WHO
Chron. v. 38, p.8-81, 1984.
LUZ, S. F. B.; SATO, M. E.; DUARTE, M.R.; SANTOS C. A. M. 1995. Parâmetros para o
Controle de Qualidade de Folhas de Casearia sylvestris sw.
Guaçatonga. Rev. Bras.
Farmacognosia. v. 5, p.1-11, 1995.
SHARAPIN, N. Controle de Qualidade de Plantas Medicinais e Fitofármacos
Prescrições
Farmacopéicas. Boletim Oficial de la corporación para la investigación Multidisciplinaria y el
desarrollo sustentable de la Flora Nacional. v. 2, n. 3, p. 3-7, 2001.
34
HARTKE, K. Deutsches Arzneibuch 9-Kommentar. Stuttgart: Wissenschaftliche, 1986.
WHO. Quality Control methods for medicinal plant materials. Genebra, 1998, 115p.
GAEDKE, F.; STEIHOFF, B. Phytopharmaka. Stuttgart: Wissenschaftliche, 2000.
SIMÕES, C. M.O.; SCHENKEL, E.; GOSMANN, G.; DE MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.;
PETROVICK, P. R. Farmacognosia da planta ao medicamento. Florianópolis: Editora da UFSC,
2004.
OLIVEIRA, F.; AKISUE, G.; AKISUE, M. K. Farmacognosia. São Paulo: Editora Atheneu, 1996.
World Health Organization. WHO PHARM, 92559/rev.1. Geneva, 1992, 84p.
Farmacopéia Brasileira 1988, IV Edição Parte I
V. Métodos de Análise. São Paulo: Atheneo
Editora São Paulo Ltda.
MARQUES L. C. Curso de Fitoterapia. Recife: Sindicato das Industrias de Produtos
Farmacêuticos do Estado de Pernambuco, 1996
35
5.ARTIGO II Artigo a ser submetido
36
DETERMINAÇÃO DE ESPECIFICAÇÕES DE CONTROLE DE QUALIDADE
DO PRODUTO FITOTERÁPICO ROBUSTERINA
Marcos A.C. de Oliveira 1, Miracy M. de Albuquerque 1*, Haroudo S. Xavier 2, Ruth R.
Strattmann 1, Severino G. Junior 1, Adelaide T. Queiroz 3.
1 - Núcleo de Controle de Qualidade de Medicamentos e Correlatos, Departamento de
Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE
2 - Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade
Federal de Pernambuco, Recife-PE
3 - Diniz & Brandão S. A Indústria e Comércio, Jaboatão dos Guararapes-PE
_________________________________________________________________________
RESUMO
Tinturas são preparações alcoólicas ou hidroalcoólicas resultantes da extração de drogas
vegetais ou animais ou da diluição dos respectivos extratos. São classificadas em simples e
compostas, conforme preparadas com uma ou mais matérias-primas. São geralmente límpidas e em
repouso podem formar um ligeiro sedimento, sem comprometimento de suas características. A
tintura de Robusterina, fornecida pelo Laboratório Diniz & Brandão, tem indicação no tratamento
de disfunções do ciclo menstrual e é composta pelas cascas de raiz (Berberis vulgaris e Gossypium.
herbaceum) e caule (Viburnum. opulus), produzida pelo processo de percolação Para o produto
Robusterina foram analisados as características organolépticas (verificação da cor, odor sabor),
características físicas: limpidez, teor alcoólico, densidade, pH, resíduo seco total e solubilidade. O
produto Robusterina deve apresentar coloração castanho escuro, sabor adocicado e pouco
adstringente, odor característico e isento de partículas estranhas, ser miscível com Água, Metanol,
Etanol, Ácido clorídrico, Ácido sulfúrico, pouco miscível em Hidróxido de sódio e imiscível em
Éter, Clorofórmio, Hexano e Anidrido acético. O Laboratório Diniz & Brandão apresenta
parâmetros em relação à Densidade, pH e grau alcoólico (encontrado em anexo). Quanto à
densidade, o Laboratório especifica resultados entre 0,9630 e 0,9890. Os resultados obtidos após
análise apresentaram uma média de 0,9830 e está de acordo com as especificações preconizadas
pelo laboratório. No que se refere ao pH, o laboratório delimita valores entre 3,90 e 4,80, e os
resultados obtidos tiveram média de 4,617, estando de acordo. Quanto ao grau alcoólico, o
laboratório denota valores entre 7,5 e 12,5 GL e obtivemos valor médio de 11,5 GL. Em relação
aos parâmetros, resíduo seco e teor em etanol, sugerimos limites de 0,562
2,88 e 30,88
0,13 %
(V/V) respectivamente, pois o laboratório não especifica limites para estas duas análises.
37
Os estudos realizados permitiram sugerir especificações com valores mínimos e máximos para o
controle de qualidade da Tintura de Robusterina.
Unitermos: Fitoterápico; Tintura, Percolação, Parâmetros de Controle de Qualidade; Robusterina
*Contato com o autor: Fone/Fax: (81) 2126-8571/2126-8572. E-mail: [email protected]
Abstract: Determination of Specifications of Quality Control in natural product Robusterina
Tinctures are alcoholic or hidroalcoholic preparations resultants of the extration of vegetal or
animal drugs or of the dilution of respective extracts. They are classified in simple and composed,
as prepared with one or more raw materials. They are generally limpid and in rest they can form a
fast sediment, without compromise of its characteristics. The ticture of Robusterina, supplied for
the Laboratory Diniz & Brandão, has indication in the treatment of disfuctions of the menstrual
cycle and is composed for root bark (Berberis vulgaris and Gossypium. herbaceum) and stem bark
(Viburnum. opulus), produced for the process of percolating. For Robusterina product had been
analyzed the organoleptic characteristics (verification of the color, odor flavor), physical
characteristics: limpidity, alcoholic text, density, pH, total dry residue and solubility. The
Robusterina presents coloration dark chestnut, candy flavor and little astringent, characteristic and
exempt odor of strange particles, to be miscible with Water, Methanol, Ethanol, Hydrochloric Acid,
Sulfuric acid, little miscible in sodium hydroxide and imiscible in Ether, Chloroform, Hexane and
acetic anhydride. The Laboratory Diniz & Brandão presents parameters in relation to the Density,
pH and alcoholic degree (found in annex). How much to the density, the Laboratory specifies
resulted between 0,9630 and 0,9890. The results gotten after analysis had presented a average of
0,9830 and are in accordance with the parameters praised for the laboratory. For pH, the laboratory
delimits values between 3,90 and 4,80, and the gotten results had had average of 4,617, being in
agreement. How much to the alcoholic degree, the laboratory denotes values between 7,5 and 12,5
°GL and got average value of 11,5 °GL. In relation to the parameters respectively, dry residue and
text in ethanol, we suggest parameters to 0,562 ± 2,88 and 30,88 ± 0,13 % (V/V). The carried
through studies had allowed to suggest specifications with minimum and maximum values for the
quality control of the Dye of Robusterina.
Keywords: Phytopharmaceutical; Tincture, Percolation, Specifications of Quality Control; Robusterina
5.1 INTRODUÇÃO
Tinturas são definidas como soluções extrativas alcoólicas ou hidroalcoólicas preparadas a
partir de matérias-primas vegetais ou extratos de plantas, misturas hidroalcoólicas em várias
concentrações (Simões et al., 2004). São obtidas por maceração ou percolação ou por outros
38
processos, podendo igualmente ser preparadas por dissolução ou diluição de um extrato etanólico
de título apropriado (Farmacopéia Portuguesa VII, 2002), contendo 1 parte de droga seca e 10
partes de solvente ou a partir de 1 parte de droga seca e 5 partes de solvente. São quase sempre
límpidas, e, em repouso, podem formar um ligeiro sedimento, o que não modifica as suas
características (Farmacopéia Portuguesa VII, 2002). As soluções obtidas pela diluição de extratos
secos ou concentrados em misturas hidroetanólicas de concentrações adequadas são também
consideradas tinturas (Farmacopéia brasileira IV Edição, 1988, List et al., 1989).
A percolação tem como característica a extração exaustiva de substâncias ativas de uma droga
vegetal, sendo esta moída, e colocada em um recipiente cônico ou cilíndrico (percolador) de vidro
ou de metal, fazendo-se passar através daquela o líquido extrator (Simões et al., 2004). O produto
obtido denomina-se percolado (Voigt, 2000). Na percolação simples, inicia-se com o
intumescimento prévio do material vegetal com o líquido extrator, durante 1 a 2 horas,
procedimento este realizado fora do percolador, de forma que as forças de expansão resultantes não
venham afetar a estrutura deste (Simões et al., 2004). Após o intumescimento segue-se a fase de
empacotamento homogêneo. É importante observar nesta fase fenômenos como homogeneidade de
enchimento, tamanho de partícula e fenômenos de difusão. Também são importantes a forma e
dimensões do percolador e velocidade de fluxo na eficiência da percolação (Simões et al., 2004).
Os produtos de origem vegetal tecnologicamente acabados necessitam de um controle de
qualidade. Pelo fato de tinturas e extratos serem as formas fitoterápicas mais utilizadas, a
determinação dos parâmetros de controle de qualidade, é de fundamental importância, para a
padronização deste. Este controle contribui, sem dúvida, para o tripé eficácia, segurança e
qualidade, refletindo por conseqüência no binômio custo-benefício. Estes princípios são necessários
ao desenvolvimento científico e tecnológico dos fitoterápicos e asseguram a melhor aceitação da
classe médica, que os prescreve e propiciam confiabilidade àqueles que os venham a consumir.
Os parâmetros analisados nas tinturas vegetais são características físicas, como índice de
dulçor e amargor, viscosidade, densidade, teor alcoólico, pH, rotação óptica, índice de refração e
cromatografia comparativa em camada delgada (Di Stasi, 1995).
O grau alcoólico é muito importante nas tinturas porque é o álcool responsável pela extração
dos ativos da planta para que tenham efeito no ser humano. O teor alcoólico (em etanol) é medido
após destilação do líquido extrator.
O pH é outra característica importante para extrato e tinturas vegetais. A Robusterina contém
alcalóides, provenientes da B. vulgaris (Berberina, por exemplo). Dependendo do líquido extrator e
do pH, poderá ocorrer precipitação dos alcalóides, situação não interessante, pois este grupo é
responsável pelas ações terapêuticas do produto.
39
A tintura de Robusterina, fornecida pelo Laboratório Diniz & Brandão, é fabricada utilizando
as cascas de raiz (Berberis vulgaris e Gossypium. herbaceum) e caule (Viburnum. opulus). Tem
ação no tratamento de disfunções do ciclo menstrual. A B. vulgaris apresenta ação sedativa e
antiespasmódica, o G. herbaceum possui ação emenagoga, hemostática e ocitócica e V. opulus
como hemostático. A tintura de Robusterina é indicada como normalizador das funções menstruais,
e é contra indicado no período de gravidez, pelo fato de estimular a contração uterina.
Para o produto foram analisados 6 lotes de Robusterina, fornecidos trimestralmente nos anos
de 2004 e 2005, no que se refere às características organolépticas (verificação da cor, odor sabor),
características físicas: limpidez, teor alcoólico, densidade, pH, resíduo seco total e solubilidade.
5.2 MATERIAL E MÉTODOS
5.2.1 MATERIAL
A Tintura de Robusterina (total de 6 lotes) foi gentilmente cedida pelo laboratório Diniz &
Brandão. Tais lotes foram fornecidos de três em três meses entre os anos de 2004 e 2005, utilizando
matérias-primas de lotes diferentes das três plantas (cascas de raiz (Berberis vulgaris e
Gossypium. herbaceum) e caule (Viburnum. opulus).
5.2.2 REAGENTES
Água, Metanol, Etanol, Ácido Clorídrico, Hidróxido de Sódio, Éter etílico, Clorofórmio,
Hexano, Anidrido acético, Ácido sulfúrico.
5.3 PARÂMETROS DE CONTROLE DE QUALIDADE PARA ROBUSTERINA
5.3.1 CARACTERIZAÇÕES FÍSICAS
5.3.1.1 CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS
As características organolépticas de cada lote da Robusterina, foram analisadas e, a partir dos
resultados foram delineados parâmetros de controle para que se garanta uma uniformidade lote a
lote. Observou-se a coloração o sabor e o odor, além de presença ou não de material estranho.
DETERMINAÇÃO DO GRAU ALCOÓLICO (Farmacopéia Brasileira, II Edição (1959)).
Quando o fitoterápico está sob a forma de tintura, utiliza-se o alcoômetro de Gay Lussac. Este
índice só deve ser utilizado para misturas de água e álcool (Di Stasi, 1995). Amostra da Robusterina
foi transferida para uma proveta, determinou-se a temperatura e o grau alcoólico, para posterior
aferição do grau alcoólico real, usando a tabela preconizada pela Farmacopéia Brasileira, II Edição
(1959).
40
DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE RELATIVA (Farmacopéia Brasileira, IV Edição (1988).
A densidade relativa é baseada na relação entre o peso de uma substância ao ar a 20 C e o
peso de igual volume de água à mesma temperatura, usando-se o picnômetro calibrado. O
picnômetro seco foi pesado na Balança eletrônica de precisão METTLER mod. AE 260 vazio e
com água recém destilada à 20ºC. Em seguida, a amostra foi colocada, com o cuidado de remover o
seu excesso e pesada. Foi obtido o peso da amostra através da diferença da massa do picnômetro
cheio e vazio. A relação entre a massa da amostra líquida e a massa da água, ambas a 20ºC, fornece
a densidade relativa.
DETERMINAÇÃO DO pH (Farmacopéia Brasileira, IV Edição (1988)).
Para a determinação do pH do produto utilizou-se um pHmetro calibrado com tampão pH 7 e
pH 4.
DETERMINAÇÃO DE RESÍDUO SECO TOTAL (British Pharmacopoea, 2004)
As amostras de Robusterina (2 g) foram colocadas em cápsulas de porcelana, evaporados à
secura em banho-maria (HAAKE DC 10) colocados em estufa (Estufa de secagem e Esterilização
FANEM mod. 315 SE) a 105 C, por 3 horas, e, então, novamente pesadas, após resfriamento, até
peso constante. O resultado é expresso em porcentagem de resíduo obtido.
DETERMINAÇÃO DE TEOR EM ETANOL (British Pharmacopoea, 2004)
O teor em etanol de um líquido é expresso pelo número de volumes de etanol, determinados a
20
0,1 C contidos em 100 volumes do líquido. O número representa o título alcoométrico
expresso em percentagem (por cento V/V). Para 25 mL de Robusterina, foram adicionados 100 mL
de água. Em seguida realizou-se a destilação. 90 mL do destilado foi recolhido em balão de 100 mL
e completou-se o volume com água. Determinou-se a densidade utilizando o picnômetro (British
Pharmacopoea, 2004). Após a determinação da densidade relativa, o resultado é multiplicado por 4
(quatro), e determina-se o teor em etanol em percentagem V/V a 20 C.
41
5.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os lotes analisados apresentaram as seguintes características: coloração castanho escuro,
sabor adocicado e pouco adstringente, odor característico de licor de jenipapo e isento de partículas
estranhas.
A tintura de Robusterina é miscível com Água, Metanol, Etanol, Ácido clorídrico, Ácido
sulfúrico, pouco miscível em Hidróxido de sódio e imiscível em Éter, Clorofórmio, Hexano e
Anidrido acético.
Os resultados do grau alcoólico, densidade relativa, pH, resíduo seco e teor em etanol
encontram-se listados na tabela 1, correspondendo a média de três determinações.
Tabela 1. Resultados de Parâmetros de Controle de Qualidade para a Robusterina
Para grau alcoólico, o resultado médio entre os lotes foi de 11,50
4,7 GL, mostrando-se
que os resultados estão bastante próximos entre os lotes (resultados entre 11 e 13 GL). Em relação
à densidade relativa, o menor valor encontrado foi de 0,9794 e o maior foi de 0,9847, com valor
médio de 0,9830. Observa-se a homogeneidade entre os lotes. O pH mostrou-se entre 4,5 e 4,7 com
média de 4,617. No que se refere ao resíduo seco os resultados encontrados estão entre 0,5353 e
0,5822, com valor médio de 0,5620. O teor em etanol obtido por destilação utilizando o método de
picnômetro, apresentou o valor médio de 30,883 % V/V. Tal resultado foi obtido utilizando o
Lotes
Ensaios (Médias)
Numero de medidas (3)
Grau
Alcoólico
( GL)
Densidade
Relativa
pH Resíduo
Seco
(% m/m)
Teor em Etanol
(% V/V)
Lote 1 11 0,9841 4,5 0,5743 30,9
Lote 2 12 0,9847 4,7 0,5822 30,9
Lote 3 13 0,9794 4,7 0,5353 30,8
Lote 4 12 0,9845 4,6 0,5655 30,9
Lote 5 12 0,9832 4,7 0,5565 30,9
Lote 6 11 0,9828 4,5 0,5605 30,9
Média 11,500 0,983 4,617 0,562 30,883
DesvPad 0,5477 0,0020 0,0983 0,0162 0,0408
CV% 4,7628 0,1999 2,1297 2,8849 0,1322
42
resultado da densidade, relacionando-a com tabela expressa na farmacopéia portuguesa VII
(relações entre a densidade e o teor em etanol). É a tabela alcoométrica da Organização
Internacional de Metrologia Legal 1972, Recomendação Internacional n 22.
5.5 CONCLUSÃO
O produto Robusterina deve apresentar coloração castanho escuro, sabor adocicado e pouco
adstringente, odor característico e isento de partículas estranhas. Estes resultados estão de acordo
com laudos emitidos pelo laboratório fornecedor do produto, que estabelece-os como parâmetros de
qualidade do seu produto. O produto deve ser miscível em Metanol, Etanol, Ácido clorídrico,
Ácido sulfúrico, pouco miscível em Hidróxido de sódio e imiscível em Éter, Clorofórmio, Hexano
e Anidrido acético. O Laboratório Diniz & Brandão apresenta parâmetros em relação à Densidade,
pH e grau alcoólico (encontrado em anexo). Quanto à densidade, o Laboratório especifica
resultados entre 0,9630 e 0,9890. Os resultados obtidos após análise apresentaram uma média de
0,9830 e está de acordo com as especificações preconizadas pelo laboratório. No que se refere ao
pH, o laboratório delimita valores entre 3,90 e 4,80, e os resultados obtidos tiveram média de 4,617,
estando de acordo com as especificações do laboratório. Quanto ao grau alcoólico, o laboratório
denota valores entre 7,5 e 12,5 GL e obtivemos valor médio de 11,5 GL. Em relação aos
parâmetros, resíduo seco e teor em etanol, sugerimos limites de 0,562
2,88 e 30,88
0,13 %
(V/V) respectivamente, face às análises realizadas entre os 6 lotes disponibilizadas pelo laboratório
entre os trimestres dos anos de 2004 e 2005. Estes limites foram determinados a partir do resultado
médio das análises e coeficiente de variação.
5.6 AGRADECIMENTOS
Agradecemos à CAPES pela concessão bolsa de estudo ao primeiro autor e ao Laboratório
Diniz & Brandão pelo fornecimento das tinturas para o desenvolvimento do trabalho.
5.7 REFERÊNCIAS
SIMÕES, C. M.O.; SCHENKEL, E.; GOSMANN, G.; DE MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.;
PETROVICK, P. R. Farmacognosia da planta ao medicamento. Florianópolis: Editora da UFSC,
2004.
FARMACOPEIA PORTUGUESA VII. Lisboa: Imprensa Nacional - Casa da Moeda, 2002
Farmacopéia Brasileira 1988, IV Edição Parte I
V. Métodos de Análise. São Paulo: Atheneo
Editora São Paulo Ltda.
43
LIST, P H.; SCHMIDT, P. C. Phytopharmaceutical Technology. London: Heyden, 1989.
VOIGT, R. Pharmazeustische Technologie. Ausgabe, Stuttgart: Deutscher Apotheker, 2000.
DI STASI, L C. Plantas Medicinais: Arte e Ciência Um Guia de Estudo Interdisciplinar.
Araraquara: Editora UNESP, 1995.
Farmacopéia dos Estados Unidos do Brasil 2.ed. São Paulo: Indústria Gráfica Siqueira S. A. 1959
44
6. ARTIGO III Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia
45
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA DE
QUANTIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DE ALCALÓIDES EM
FITOTERÁPICO CONTENDO BERBERIS VULGARIS L.
Marcos A.C. de Oliveira 1, Miracy M. de Albuquerque 1*, Haroudo S. Xavier 2, Ruth R. Strattmann 1, Severino G. Junior 1, Adelaide T. Queiroz 3.
1 - Núcleo de Controle de Qualidade de Medicamentos e Correlatos, Departamento de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE
2 - Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal
de Pernambuco, Recife-PE
3 - Diniz & Brandão S. A Indústria e Comércio, Jaboatão dos Guararapes-PE
_________________________________________________________________________
RESUMO
A ROBUSTERINA é um produto fitoterápico registrado no ministério da saúde, com eficácia no
tratamento de disfunções do ciclo menstrual. Em sua composição encontram-se Berberis vulgaris,
de ação sedativa e antiespasmódica; Gossypium herbaceum, L., enemagoga, hemostática e
ocitócica; Viburnum opulus, L., antiespasmódico nas cólicas menstruais. De acordo com a
Resolução RDC N
48, de 16 de março de 2004, observa-se que o produto adequa-se na definição
de FITOTERÁPICO. A presença de alcalóides em Berberis vulgaris e a ausência de metodologias
analíticas de quantificação para o produto, nos incentivaram a propor e validar um método
apoiando-nos na Resolução RE N
899, de 29 de Maio de 2003. Tal metodologia fundamenta-se na
determinação espectrofotométrica de alcalóides utilizando-se Dragendorff como reagente
precipitante, e o Sulfato de Berberina Merck , como Substância Química de Referência. A curva
de calibração foi determinada com seis concentrações entre 40 e 200 g/mL. A equação da reta é y
= 0,0038x + 0,0092 com R2 de 0,9996. Os parâmetros robustez, precisão, especificidade, limite de
detecção e quantificação e exatidão foram avaliados estatisticamente com intervalo de 95% de
confiança (teste t de Student, ANOVA). O método apresentado é considerado como um método
alternativo, por não constar nas atuais edições das farmacopéias Brasileira e Americana, e como tal,
foi validado segundo a Legislação em vigor. Os resultados obtidos mostram que o método atende
aos requisitos de Boas Práticas de Fabricação, pois apresenta a exatidão, a sensibilidade, a
especificidade, a reprodutibilidade, a precisão, a robustez, a linearidade (faixa de trabalho) e
finalmente a confiabilidade requerida para um método analítico.
46
Unitermos: Robusterina, Fitoterápico, Validação, Alcalóides, Doseamento.
*Contato com o autor: Fone/Fax: (81) 2126-8571/2126-8572. E-mail: [email protected]
Abstract: Development and Validation of Methodology of Spectrofotometric Quantification
of Alkaloids in natural product containing Berberis vulgaris L..
The ROBUSTERINA is a phytotherapic product, with effectiveness in the treatment of menstrual
cycle disfunctions. In its composition they meet Berberis vulgaris, sedative and antispasmodic
action; Gossypium herbaceum, L., emmenagogue, hemostatic and ocitocic; Viburnum opulus, L.,
antispasmodic in menstrual colics. In accordance with Resolution RDC N° 48, of 16 of March of
2004, is observed that the product is adjusted in Phytotherapic definition. The presence of alkaloids
in Berberis vulgaris and the absence of analytical methodologies of quantification for the product,
in had stimulated them to consider and to validate a method supporting us in Resolution RE N°
899, of May 29th of 2003. Such methodology is based on the determination of alkaloids in
spectrophotometer method, using Dragendorff as precipitate reacting, having the Berberine
Sulphate Merck, as Chemical Substance of Reference. The calibration curve was determined with
six concentrations between 40 and 200 g/mL. The equation of the straight line is y = 0,0038x +
0,0092 with R2 of 0,9996. The parameters robustness, precision, especificity, limit of detection and
quantification and exactness had been evaluated with reliable interval of 95% (test t of Student,
ANOVA). The presented method is considered as an alternative method, for not consisting in
current editions of the farmacopéias Brazilian and American, and as such, was validated according
to Legislation in vigor. The gotten results show that the method takes care of to the Good
requirements of Practical of Manufacture, therefore present the exactness, sensitivity, the
specificity, the reproductibility, the precision, the robustness, the linearity (work band) and finally
the trustworthiness required for an analytical method.
Keywords: Robusterina, Phytopharmaceutical, Validation, Alkaloids, Quantification
INTRODUÇÃO
A Robusterina é um medicamento (solução oral) de origem exclusivamente vegetal.
Encontra-se no mercado nacional desde 1932, sendo utilizada no tratamento das disfunções e
regulação do ciclo menstrual e, por estimular a contração uterina, seu uso é contra-indicado no
período gestacional. A dose média diária é de uma colher de sopa (15 ml) 3 vezes ao dia. O
tratamento deve ser suspenso quando houver normalização do ciclo menstrual, ou no caso de
gravidez. Apresenta-se em sua constituição três plantas: Berberis vulgaris, Gossypium herbaceum e
Viburnum opulus.
47
Berberis vulgaris, é uma Berberidaceae arbustiva com uma altura de 2 a 3 metros (Alonso,
1998, p.175). É nativa da Europa e Ásia Oriental, e, na atualidade, encontrada também no Norte da
África e partes da América e Ásia Central (PDR for Herbal Medicines, 2000).
Apresentando uma vasta sinonímia vulgar, é conhecida como agracejo (espanhol) (Bruneton,
1991) barberry (inglês), bérberis (português), crespino (italiano) (Alonso, 1998, p. 175) e épine-
vinette (francês) (Duke, 1985). Apresenta outros nomes como Berberry, pipperidge, jaundice berry,
sow berry, mountain grape e oregon grape (PDR for Herbal Medicines, 2000). As partes da planta
utilizadas para uso medicinal são os frutos, a casca da raiz e as folhas (Alonso, 1998, p. 176).
Os frutos têm em sua constituição dextrose, levulose, ácido cítrico, ácido tartárico, goma e
pectina (Alonso, 1998, p. 176). Na casca das raízes são encontrados alcalóides como a berberina,
palmatina, columbamina, berbamina, oxyacantina e magnoflorina perfazendo um total de 3% em
alcalóides, o que confere ao córtex uma coloração amarela. A atividade farmacológica da planta é
atribuída aos alcalóides presentes, principalmente a berberina (Pizzorno;Murray, 1985). A berberina
está presente em outras famílias de plantas (Papaveraceae, Ranunculaceae, etc) (Alonso, 1998, p.
176). Também são encontrados ácidos málico, cítrico, chelidonico e tartárico, além de resina e
taninos (Duke, 1985)
A Resolução RDC N
48, de 16 de Março de 2004, da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA), regula os medicamentos fitoterápicos e, para efeito de registro, exige relatório
de controle de qualidade, incluindo então as metodologias analíticas. A falta de metodologia
analítica para a Berberis vulgaris, nos despertou o interesse em desenvolver uma metodologia
analítica para o produto, a qual foi validada, de acordo com a Resolução RE N 899, de 29 de Maio
de 2003, do Ministério da Saúde.
De acordo com a resolução RE N
899, a metodologia será considerada validada, desde que
sejam avaliados parâmetros relacionados: Especificidade/Seletividade, Curva de
Calibração/Linearidade, Intervalos de Curva de Calibração, Precisão, Limite de Detecção (LD),
Limite de Quantificação (LQ), Exatidão, Robustez.
A validação da metodologia analítica é de grande importância para a Garantia da Qualidade
Analítica e se constitui numa das exigências das Normas de Boas Práticas de Fabricação (BPF)
vigentes. Os métodos de ensaio para avaliar a conformidade dos produtos farmacêuticos com
especificações estabelecidas devem atingir padrões adequados de exatidão, precisão e
confiabilidade (Barros, 2002).
48
OBJETIVO
Para o estudo, foi dada ênfase a Berberis vulgaris, pois é a única planta que apresenta na sua
constituição alcalóides, para a qual foi desenvolvida e validada uma metodologia analítica baseada
na determinação espectrofotométrica de alcalóides, utilizando Dragendorff como reagente
precipitante.
A metodologia analítica proposta e validada foi desenvolvida a partir de pesquisas, tendo-se
como destaque o trabalho desenvolvido por Sreevidya et. al (2003).
MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL
O material utilizado (Robusterina, tintura de berberis, tintura de viburno e tintura de
algodoeiro) foi gentilmente cedido pelo Laboratório Diniz & Brandão.
Utilizaram-se vidrarias certificadas por lote, do fabricante Thermex .
A Substância Química de Referência (S.Q.R) determinada para a validação da metodologia
analítica foi o Sulfato de berberina, Merck . No experimento foram manuseadas as seguintes
substâncias: Ácido clorídrico diluído (HCl 1N); Reagente de Dragendorff; Nitrato de bismuto
pentahidratado, (VETEC); Iodeto de potássio (Mallinckrodt); Água destilada; Ácido acético glacial;
Álcool etílico absoluto (J. T. Baker); Álcool etílico absoluto (Nuclear); Sulfito de sódio (Merck );
Ácido nítrico concentrado; Tiouréia (Merck ).
Desenvolvimento da Metodologia
Preparação da solução de Sulfato de berberina S.Q.R.
Foram pesados 61,3 mg de Sulfato de berberina (S.Q.R) (equivalente a 50 mg de berberina)
(Balança Analítica Mettler Modelo AE 260) e transferidos quantitativamente para balão
volumétrico de 50 mL; completou-se o volume com água destilada; tomou-se 5 mL de cada solução
(triplicata) e acidificou-se a pH entre 2-2,5 com HCl 1N; transferiu-se 5 mL da solução acidificada
para cada tubo de centrífuga (triplicata); a cada tubo foram adicionados 2 mL do Reagente de
Dragendorff e centrifugou-se a 2400 rpm/ 30 minutos (Centrifuga Fanem Modelo Série
204N/116653); desprezou-se o sobrenadante e tratou-se o resíduo com 1 mL de Álcool etílico
absoluto; foram adicionados 2 mL de Sulfito de sódio a 1% e centrifugou-se a 2400 rpm / 30
minutos; desprezou-se o sobrenadante e tratou-se o resíduo com 2 mL de Ácido nítrico
concentrado; transferiu-se o conteúdo resultante para balão volumétrico de 50 mL, completou-se o
volume com Água destilada; Foi tomado 1 mL desta solução e adicionou-se 5 mL de Tiouréia a
49
3%; A mistura de Ácido nítrico e Tiouréia foi usada como branco; A amostra foi lida a 435nm (em
Espectrofotômetro Varian Modelo 6345).
Obteve-se uma curva de linearidade com as seguintes concentrações: 40, 80, 100, 120, 150 e
200 g/mL
Preparação da Amostra (Robusterina, Laboratório Diniz & Brandão Lote 0405033
validade 05/2007)
Foram tomados 40 mL do produto (que corresponde a uma concentração 6,66 mg/mL* de
Berberis vulgaris na Robusterina) e acidificou-se a pH entre 2-2,5 com HCl 1N; distribuiu-se este
volume em 4 tubos de centrífuga; a cada tubo adicionou-se 4 mL do Reagente de Dragendorff e
foram centrifugados a 2400 rpm / 30 minutos (Centrifuga Fanem Modelo Série 204N/116653);
prosseguiu-se como descrito na solução de Sulfato de berberina S.Q.R e as amostras foram
lidas em espectrofotômetro a 435 nm.
* A concentração de 6,66 mg/mL é resultante da produção da Robusterina, onde é
adicionado 1 Kg de Berberis vulgaris para um volume final de 150 L do produto.
Estudo da Validação
Os parâmetros avaliados foram a Robustez, Linearidade, Especificidade, Precisão, Limite de
Detecção (LD), Limite de Quantificação (LQ), Exatidão.
A robustez de um método é a medida de sua capacidade de não ser alterado frente À pequenas
e deliberadas variações dos parâmetros analíticos (RDC N
48, de 16 de Março de 2004). A
robustez do método foi determinada sobre as variações de pH, velocidade de centrifugação e marca
de solvente. As análises foram realizadas em quadruplicata. A sua avaliação foi feita através da
análise de variância (ANOVA) one-way.
A linearidade foi avaliada através da análise de regressão linear pelo método dos mínimos
quadrados dos pontos médios de 3 (três) curvas de calibração autênticas, usando-se seis
concentrações (40, 80, 100, 120, 150 e 200 g/mL). Para verificação da significância da equação de
regressão, foram efetuados testes de ajuste do modelo linear e validade da regressão.
Robustez (RDC N 48, de 16 de Março de 2004)
Linearidade(RDC N 48, de 16 de Março de 2004)
50
Foi realizada uma mistura das tinturas de algodoeiro e de viburno e procedeu-se conforme
descrito para S.Q.R. A mistura funcionou como branco/compensação para provar a ausência de
alcalóides nestas duas plantas (Gossypium herbaceum e Viburnum opulus). ,
A precisão foi determinada através dos métodos de repetitividade e precisão intermediária. A
repetitividade foi determinada pela análise de seis amostras individuais. A precisão intermediária
foi determinada em dois dias por dois analistas diferentes.
A repetitividade foi expressa através do coeficiente de variação (CV) e a precisão
intermediária foi expressa, além do CV, através do intervalo de confiança da média pelo teste t de
Student (Ribani et al., 2004).
É a menor concentração do analito em uma amostra que pode ser detectada, mas não
necessariamente quantificada, sob determinadas condições experimentais.
É calculado também na prática como uma concentração que produz um sinal três vezes maior
que o nível de ruído médio medido com o branco ou solução controle (Leite, 1989).
LD = 3 DP
DP = Desvio Padrão Médio da menor concentração
= Médias dos coeficientes angulares
É a menor concentração do analito que pode ser determinada com precisão e exatidão,
aceitáveis, sob determinadas condições experimentais (Barros, 2002).
Para se realizar o LD e LQ foi considerada o desvio padrão da reta com relação à absorvância
do primeiro nível de concentração (40 g/mL) do Sulfato de berberina nas três curvas de calibração
e seus coeficiente angulares (inclinação da reta). Foi considerada a razão de três vezes da linha da
base para o LD e dez vezes para o LQ.
LQ = 10 DP
DP = Desvio Padrão Médio da menor concentração
= Médias dos coeficientes angulares
Especificidade(RDC N 48, de 16 de Março de 2004)
Precisão(RDC N 48, de 16 de Março de 2004)
Limite de Detecção (LD)
Limite de Quantificação (LQ)
51
A exatidão do método foi avaliada em três níveis de concentração: 50, 100 e 150 %, onde 100
% correspondeu a concentração de 29,46 g/mL. Foram preparadas, conforme descrito para a
preparação da S.Q.R. sendo que, para a quantidade de 50 %, tomou-se o volume de 0,5 mL, para
100 %, volume de 1,0 mL e para 150 %, um volume de 1,5 mL, que foram adicionados com 5 mL
de Tiouréia e lidos em espectrofotômetro a 435nm.
Os testes foram feitos em triplicata de cada nível de concentração e foram avaliados através
do teste t de Student, comparando-se os resultados em relação ao valor teórico definido para cada
concentração analisada.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi feita uma varredura espectrofotométrica com o Sulfato de berberina, na concentração de
100 g/mL, para determinar o comprimento de onda de 435 nm, de acordo com Sreevidya (2003) .
A partir desta observação, iniciou-se a determinação da curva de calibração tomando os dados
descritos na Tabela 1.
LINEARIDADE
Os resultados foram plotados e está representado na figura 1 (Anexo), tendo no eixo dos x a
concentração de Sulfato de berberina e no eixo dos y absorvância. A equação de regressão linear
obtida pelo método proposto, utilizando três curvas de calibração autênticas, foi y = 0,0038x +
0,0092. O coeficiente de correlação obtido de 0,9996, demonstra a boa qualidade da curva de
calibração, pois menor a dispersão do conjunto de pontos e menor a incerteza dos coeficientes de
regressão estimados (Figura 1) (Anexos).
A partir da análise de variância (Tabela 2) (Anexo) podemos testar a validação do modelo e a
significância estatística da curva ajustada. As análises de variância dos dados demonstraram que o
método é linear, na faixa de concentração testada (40-200 g/mL) e que não há falta de ajuste do
modelo, já que o Fcalculado = 3,24, é menor que o Ftabelado = 3,25 com 4 e 12 graus de liberdade e 95%
de confiança mostrando que o modelo linear está bem ajustado na faixa de concentração estudada
(Pimentel, 1996).
O gráfico dos resíduos (Figura 2) (Anexos) mostra que o método está bem ajustado, indicando
uma distribuição linear e aleatória dos dados.
Exatidão(RDC N 48, de 16 de Março de 2004)
52
ROBUSTEZ
Foram analisadas amostras em quadruplicata para cada parâmetro de variação estudado:
alteração de pH (2,3; 2,4 e 2,5), velocidade de rotação (2000, 2200 e 2400 rpm) e marca do
solvente (álcool etílico absoluto). Todos os resultados foram tratados estatisticamente por ANOVA
one-way.
Avaliação da Robustez variando o pH
A Tabela 3 (Anexo), mostra a avaliação da robustez, variando o parâmetro de pH.
Para o parâmetro avaliado (pH), verificou-se estatisticamente através do ANOVA (análise de
variância) que não há diferença significativa entre os resultados. Obtendo-se um Fcalculado = 0,826
menor que o Ftabelado = 4,256, o método apresenta-se robusto, não existindo, em um nível de 95% de
confiança, variação estatisticamente significativa quanto ao pH (Tabela 4) (Anexo).
Avaliação da Robustez variando a velocidade de centrifugação
A Tabela 5 (Anexo) mostra os resultados da robustez variando o parâmetro de Velocidade de
Centrifugação.
Para o parâmetro avaliado (velocidade de centrifugação), verificou-se estatisticamente através
do ANOVA (análise de variância) que não há diferença significativa entre os resultados. Obtendo-
se um Fcalculado = 1,827 menor que o Ftabelado = 4,256, o método apresenta-se robusto, não existindo,
em um nível de 95% de confiança, variação estatisticamente significativa quanto à velocidade de
centrifugação (Tabela 6) (Anexo).
Avaliação da Robustez variando a Marca do Solvente
O Álcool etílico é utilizado para lavar o resíduo antes de se adicionar o Sulfito de sódio,
conforme descrito para a preparação da S.Q.R. Sulfato de berberina e Amostra. Os resultados estão
na Tabela 7 (Anexo).
Para a avaliação da robustez variando a marca do solvente álcool etílico absoluto, utilizou-se
o teste t de Student como ferramenta estatística para comparar as médias entre eles. Sendo o
Tcalculado (1,2156) menor que o Ttabelado (2,4469) não há diferença estatisticamente significativa com
um nível de 95% de confiança entre a média da concentração do solvente álcool etílico absoluto da
marca Nuclear e o da marca J. T. Backer. Os resultados afirmam que o método é robusto para o
parâmetro estudado (Tabela 8) (Anexo).
As variações encontradas não são significativas e refletem os erros aleatórios durante o
procedimento analítico.
53
O método apresentou-se robusto para a variação de pH, velocidade de centrifugação e marca
do solvente. Os resultados de Análise de Variância e teste t de Student para os parâmetros avaliados
mostram que não há diferença estatisticamente significativa entre as variações de pH, velocidade de
centrifugação e marca do solvente, com intervalo de 95% de confiança.
PRECISÃO
Repetitividade
A Tabela 9 explicita os resultados do ensaio de Repetibilidade.
Observando-se os resultados, podemos concluir que o método tem uma boa repetibilidade,
visto que o coeficiente de variação (CV%) é inferior ao especificado pela Resolução vigente, que é
de 5 %.
Precisão Intermediária
A precisão intermediária foi realizada em diferentes dias e com diferentes analistas, utilizando
a mesma concentração. A Tabela 10 mostra os resultados da precisão intermediária, entre dias e
analistas.
O estudo da precisão do método entre ensaios demonstrou que não há grandes diferenças
entre as amostras analisadas individualmente em pequeno intervalo de tempo, assim como a
precisão entre dias e entre analistas e os resultados encontrados demonstram que estas se
enquadram dentro dos limites especificados. Na análise de variância o Fcalculado foi menor que o
Ftabelado não havendo diferença estatisticamente significativa em um nível de 95% de confiança entre
os dois analistas (Tabela 11).
LIMITE DE DETECÇÃO (LD) E LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LQ)
A partir do momento que se define que o método é linear, podem ser calculados os valores de
LD e LQ, utilizando a média do desvio padrão (DP) do primeiro ponto da reta e coeficientes
angulares (ic). O LD calculado foi de 3,1578 g/mL e o LQ foi de 10,5263 g/mL.
ESPECIFICIDADE
Foi preparada uma mistura com as tinturas de algodoeiro e de viburno na proporção 1:1, que
também fazem parte da tintura de Robusterina, e que não apresentam alcalóides. A análise foi
determinada em quadruplicata, para testar a especificidade do método para alcalóides. O método
mostrou-se específico para alcalóides, pois as leituras de absorvância foram próximas a zero.
54
EXATIDÃO
A determinação da exatidão foi realizada no mesmo dia com três concentrações diferentes
baixa, média e alta (50%, 13,50 g/mL); 100% (29,46 g/mL); 150% (45,47 g/mL).
A exatidão do método foi comprovada pelo estudo de três concentrações diferentes (50%,
100%, 150%) e o percentual de recuperação nas três concentrações analisadas encontrou-se dentro
dos limites como mostram os resultados da Tabela 12.
Realizou-se estudo de significância estatística utilizando-se o teste t de Student. Com base
nos dados observados na Tabela 13, pode-se constatar que não há diferença estatisticamente
significativa, com intervalo de 95% de confiança, entre os resultados obtidos e os valores teóricos
definidos, mostrando que o método para determinação de alcalóides na Robusterina é exato.
CONCLUSÃO
O método apresentado demonstrou ser simples, para determinação da QUANTIFICAÇÃO
ESPECTROFOTOMÉTRICA DE ALCALÓIDES EM FITOTERÁPICO CONTENDO BERBERIS VULGARIS L, sendo
robusto, linear, preciso, exato e seletivo. Portanto é uma alternativa de método analítico para
utilização em rotina de Indústrias farmacêuticas, uma vez que não consta, até o presente momento,
em nenhum dos compêndios oficiais. Os resultados obtidos mostram que o método atende aos
requisitos de Boas Práticas de Laboratório e aos critérios de validação exigidos na Resolução
RE
899/ANVISA e aos guias da USP e ICH.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos à CAPES pela concessão bolsa de estudo ao primeiro autor e ao Laboratório
Diniz & Brandão pelo fornecimento das tinturas para o desenvolvimento do trabalho.
REFERÊNCIAS
RIBANI, M.; BOTTOLI, C.B.G.; COLLINS, C.H.; JARDIM I.C.S.F. Validação em métodos
cromatográficos e eletroforéticos. Quím Nova. v. 27, n. 5, p. 771-780, 2004.
SREEVIDYA, N.; MEHROTHA, S. Spectrophotometric Method for Estimation of Alkaloids
precipitable with Dragendorff´s Reagent in Plant Materials. J AOAC Int. v. 86, n.6, p. 1124-1127,
2003.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RE N 899, de 29 de Maio de 2003.
Diário Oficial da União, de 02 de Junho de 2003.
55
CUNHA, A P.; SILVA, A P.; ROQUE, O R. Plantas e Produtos Vegetais em Fitoterapia. Lisboa:
Fundação Calouste Gulbenkian, 2003.
BARROS, C.B. 2002. Validação de Métodos Analíticos. Biológico. v.64, n. 2, p. 175-177, 2002.
PDR FOR HERBAL MEDICINES 2000. Montvale, New Jersey: Medical Economics Company.
ALONSO, J.R 1998. Tratado de Fitomedicina. 1. ed. Buenos Aires: Isis Ediciones, 1998.
PIMENTEL, M.F.; BARROS, N.B. Calibração: Uma Revisão para Químicos Analíticos. Quím
Nova. v.19, n. 3, p. 268-277, 1996.
BRUNETON, J. Elementos de Fitoquimica y de Farmacognosia. Zaragoza: Editorial ACRIBIA,
1991.
LEITE, F. Validação em Análise Química. 3. ed. São Paulo: Editora Átomo, 1989.
DUKE, J.A. CRC Handbook of Medicinal Herbs. Florida: CRC Press, Inc, p. 78, 1985.
PIZZORNO, J.E.; MURRAY, M.T. (looseleaf). A Textbook of Natural medicine. Seattle,
Washington: John Bastyr College Publications. 1985.
LEUNG, AY. Encyclopedia of Common Natural Ingredients used in food, drugs, and
cosmetics. New York: John Wiley & Sons. 1980.
LEWIS, W.H.; ELVIS-LEWIS, M.P.F. Medical Botany. New York: John Wiley & Sons, p. 515,
1977.
FARNSWORTH, N. Potential value of plants as sources of a new antifertility agents. J Pharm Sci.
v. 64, p. 535-593, 1975.
PREININGER, V. 1975. The Pharmacology and Toxicology of the papaveraceae alkaloids. In:
Manske RHF Holmes HL. The alkaloids. v. 15. New York: Academic Press, p. 239, 1975.
FERNALD, M.L.; KINSEY, A.C.; ROLLINS, R.C. Edible wilds plants of Eastern North
America. New York: Harper and Brothers, p. 452, 1958.
56
Tabela 1. Quantificação Espectrofotométrica de Alcalóides - Resultados da Linearidade
Dados da Curva de Calibração
ABSORVÂNCIAS
CONCENTRAÇÃO
g/mL Curva 1 Curva 2 Curva 3
MÉDIA CV %
40 0,164 0,160 0,156 0,1600 2,50
80 0,318 0,316 0,310 0,3147 1,32
100 0,381 0,385 0,387 0,3843 0,79
120 0,469 0,465 0,462 0,4653 0,75
150 0,586 0,583 0,579 0,5827 0,60
200 0,763 0,765 0,767 0,7650 0,26
* Autor para correspondência
Profa. Dra. Miracy Muniz de Albuquerque Universidade Federal de Pernambuco Departamento de Ciências Farmacêuticas. CCS.
Núcleo de Controle de Qualidade em Medicamentos e Correlatos. Av. Prof. Artur de Sá s/n, Cidade Universitária Recife-PE CEP: 50.740-521 - Fone/Fax: (81) 2126-8571/2126-8572 E-mail: [email protected]
57
y = 0,0038x + 0,0092
R2 = 0,9996
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 50 100 150 200 250
ug/mL
Ab
s
Figura 1. Curva de Regressão Linear obtida da média das Três Curvas de Calibração
autênticas
Tabela 2. Resultados da Análise de Variância para Linearidade
Fonte SQ gl MQ F F-crítico
Modelo SQ reg 0,670816935 1 0,670816935
36130,33 4,4940
Residual SQ res 0,000297065 16 1,85666E-05
Curva Linear*
Falta de ajuste SQ faj
0,000154399 4 3,85997E-05
3,2467 3,2592
Erro puro SQ erp 0,000142667 12 1,18889E-05
Não há falta de
ajuste**
Total SQ tot 0,671114 17 0,039477294
SQ = Soma Quadrática; gl = Graus de Liberdade; MQ = Média Quadrática
* Regressão Estatisticamente Significativa
** Proporcionando uma curva linear
58
Figura 2.
resíduos
Figura 2. Gráfico de Resíduos
Tabela 3. Avaliação da robustez variando o parâmetro de pH
Tabela 4. Avaliação da robustez variando o pH de acordo com a ANOVA.
Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3
Amostra 4
pH
g/mL g/mL g/mL g/mL
2,3 29,20 29,20 29,20 28,32
2,4 28,48 29,00 29,20 28,84
2,5 28,68 29,00 28,68 28,32
MÉDIA 28,79 29,07 29,03 28,49
DESVPAD
0,3717 0,1155 0,3002 0,3002
CV(%) 1,2911 0,3973 1,0343 1,0537
Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3
Amostra 4
pH g/mL g/mL g/mL g/mL
2,3 29,20 29,20 29,20 28,32
2,4 28,48 29,00 29,20 28,84
2,5 28,68 29,00 28,68 28,32
MÉDIA 28,79 29,07 29,03 28,49
DESVPAD
0,3717 0,1155 0,3002 0,3002
CV(%) 1,2911 0,3973 1,0343 1,0537
Fonte de variação
SQ Gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 0,20 2 0,10 0,826 0,468 4,256
Dentro dos grupos
1,09 9 0,12
Total 1,29 11
59
Tabela 5. Avaliação de Robustez Variando o parâmetro de Velocidade de Centrifugação
* Velocidade de Centrifugação
Tabela 6. Avaliação da robustez variando a velocidade de centrifugação de acordo com a
ANOVA.
Fonte de variação
SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 0,01 2 0,005 1,827 0,215 4,256
Dentro dos grupos
0,04 9 0,004
Total 0,05 11
Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3
Amostra 4
VC*
(rpm) g/mL g/mL g/mL g/mL
2000 29,90 29,90 30,04 29,90
2200 30,04 30,02 29,90 29,90
2400 29,90 29,82 29,90 29,90
MÉDIA 29,95 29,91 29,95 29,90
DESVPAD
0,0808 0,1007 0,0808 0,000
CV(%) 0,2699 0,3365 0,2699 0,000
60
Tabela 7. Avaliação da robustez variando o parâmetro Marca do Solvente.
Tabela 8. Teste-t Robustez de Marca do Solvente.
Amostra 1
Amostra 2 Amostra 3
Amostra 4
MARCA DO
SOLVENTE
g/mL g/mL g/mL g/mL
Nuclear 29,36 29,52 29,74 29,74
J. T. Backer
29,00 29,20 29,20 29,90
MÉDIA 29,18 29,36 29,47 29,82
DESVPAD 0,2545 0,2262 0,3818 0,1131
CV(%) 0,8724 0,7707 1,2957 0,3794
Nuclear J. T. Backer
Média 29,59 29,32
Variância (S2) 0,0342 0,1558
Stat t
P(T<=t) bi-caudal
T crítico bi-caudal
1,2156
0,2698
2,4469
61
Tabela 9. Resultados da Repetitividade.
Amostra g / mL Concentração %
01 28,68 0,4302
02 29,20 0,4380
03 29,20 0,4380
04 29,90 0,4485
05 29,90 0,4485
06 29,90 0,4485
MÉDIA 29,46 0,4420
DESVPAD 0,5147 0,0077
CV% 1,7468 1,7468
Tabela 10. Resultados da Precisão Intermediária.
Dias/Analistas Amostra-1 Amostra-2
Amostra-3
Amostra-4
g/mL g/mL g/mL g/mL
Dia-1 28,84 29,36 28,32 28,32
Dia-2
Ana
lista
-1
28,84 28,32 28,84 28,32
Dia-1 26,74 28,32 28,84 29,36
Dia-2
Ana
lista
-2
28,32 28,32 28,84 27,78
MÉDIA 28,19 28,58 28,71 28,45
DESVPAD 0,9940 0,5200 0,2600 0,6609
CV% 3,5268 1,8195 0,9056 2,3237
62
Tabela 11. Precisão Intermediária de acordo com a ANOVA.
Fonte de variação SQ gl MQ F calculado
F tabelado
Analistas 0,60 3 0,20 0,38 3,86
Dias 0,47 3 0,16 0,29 3,86
Erro 4,82 9 0,53
Total 5,89 15
Tabela 12. Resultados da Exatidão para concentrações baixa, média e alta.
Tabela 13. Teste t de Student para Exatidão Concentrações baixa (50%), média (100%)
e alta (150%).
Percentual T calculado T tabelado
50%
100%
150%
2,4173
2,9314
0,4885
4,3030
g / mL
DETERMINAÇÕES
13,50 g/mL 29,46 g/mL 45,47 g/mL
1 13,55 29,34 45,29
2 13,89 29,16 45,29
3 13,82 29,34 45,66
MEDIA 13,75 29,28 45,41
DESVPAD 0,1791 0,1064 0,2127
CV (%) 1,3023 0,3632 0,4684
63
7. CONCLUSÃO FINAL
O presente trabalho também determinou parâmetros de qualidade para as partes das plantas
utilizadas (Berberis vulgaris, Gossypium herbaceum e Viburnum opulus) Os parâmetros analisados
foram: matéria orgânica estranha, perda por dessecação, cinzas (totais, insolúveis em ácido e
sulfatadas), metais pesados. No que se refere a matéria orgânica estranha podemos preconizar um
máximo de 3%. Os resultados encontrados estão abaixo deste limite (média de 1,66% para B.
vulgaris, 0,82% para G. herbaceum e 1,64% para V. opulus). Referente ao teor de água, pode-se
estabelecer limites 9,22
0,26 % (B. vulgaris), 10,25
0,19 % (G. herbaceum) e 9,27
10 %
(Viburnum opulus). Como não foram encontrados em compêndios oficiais, sugerimos estabelecer
estes limites. Para as cinzas totais, podemos estabelecer limites de 7,10
0,31 % (B. vulgaris),
13,36
0,18 % (G. herbaceum) e 11,73
0,23 % (V. opulus). Relativo às cinzas insolúveis em
ácido, os limites preconizados foram de 5,55
0,31 (B. vulgaris), 4,29
0,12 % (G. herbaceum) e
5,09
0,09 % (Viburnum opulus). Para as cinzas sulfatadas, foi estabelecido limites de 4,6
0,5
%, (B. vulgaris), 6,9 0,17 % (G. herbaceum) e 4,18 0,10 %.(V. opulus).
O produto Robusterina deve apresentar coloração castanho escuro, sabor adocicado e pouco
adstringente, odor característico e isento de partículas estranhas. Estes resultados estão de acordo
com laudos emitidos pelo laboratório fornecedor do produto. Quanto à densidade, o Laboratório
especifica resultados entre 0,9630 e 0,9890. Os resultados obtidos após análise apresentaram uma
média de 0,9830. No que se refere ao pH, o laboratório delimita valores entre 3,90 e 4,80, e os
resultados obtidos tiveram média de 4,617. Quanto ao grau alcoólico, o laboratório denota valores
entre 7,5 e 12,5 GL e obtivemos valor médio de 11,5 GL. Em relação aos parâmetros, resíduo
seco e teor em etanol, sugerimos limites de 0,562
2,88 e 30,88
0,13 % (V/V) respectivamente,
face às análises realizadas entre os 6 lotes disponibilizadas pelo laboratório entre os trimestres dos
anos de 2004 e 2005. Estes limites foram determinados a partir do resultado médio das análises e
coeficiente de variação.
Segundo pesquisas observadas no presente trabalho, a presença de alcalóides em Berberis
vulgaris e a ausência de metodologias analíticas de quantificação para o produto, nos incentivaram
a propor e validar um método, de acordo com a Resolução RE N
899, de 29 de Maio de 2003. O
método apresentado é um método alternativo por que não consta na farmacopéia ou no formulário
oficial. Por isso é reconhecido pela ANVISA. Foi validado de acordo com a Resolução RE n
899
em vigor. Os resultados obtidos mostram que o método atende aos requisitos de Boas Práticas de
Laboratório, pois apresenta sensibilidade, reprodutibilidade, a precisão, a robustez, a linearidade e
principalmente a confiabilidade requerida para um método analítico.
64
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74
9. ANEXOS
75
76
PERFIL CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS UTILIZADAS
PARA PRODUÇÃO DO FITOTERÁPICO ROBUSTERINA .
Marcos A.C. de Oliveira 1, Miracy M. de Albuquerque 1*, Haroudo S. Xavier 2, Ruth R.
Strattmann 1, Severino G. Junior 1, Adelaide T. Queiroz 3.
1 - Núcleo de Controle de Qualidade de Medicamentos e Correlatos, Departamento de
Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE
2 - Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade
Federal de Pernambuco, Recife-PE
3 - Diniz & Brandão S. A Indústria e Comércio, Jaboatão dos Guararapes-PE
_________________________________________________________________________
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo avaliar os perfis cromatográficos de plantas utilizadas
na produção do fitoterápico ROBUSTERINA. O produto é constituído por três plantas: Berberis
vulgaris L, Gossypium herbaceum L. e Viburnum opulus. Alíquotas de 10 L das tinturas de B.
vulgaris, G. herbaceum e V. opulus (amostras 1a, ab e 1c), os extratos metanólicos a 10% (p/V)
(amostras 2a, 2b e 2c) e os extratos hidroalcoólicos (30:70) a 10% (p/V) das três plantas foram
submetidas à cromatografia em camada delgada analítica (CCDA) empregando-se placas prontas de
gel de sílica (Merck (art. 105553) e fases móveis de polaridades diversas. Revelando-se os
cromatogramas com reagentes adequados à caracterização de Alcalóides, Terpenóides
(Monoterpenos, Diterpenos, Triterpenos, Sesquiterpenos, Esteróides e Saponósidos), Polifenóis
(Cumarinas, Flavonóides, Proantocianidinas Condensadas e Leucoantocianidinas, Ácido Gálico),
Açúcares. Os resultados obtidos foram confrontados com dados pesquisados em literatura,
comprovando a autenticidade da matéria-prima utilizada para a produção do fitoterápico
ROBUSTERINA.
*Contato com o autor: Fone/Fax: (81) 2126-8571/2126-8572. E-mail: [email protected]
77
Abstract: Chromatographic Profile Of Plants Used For Production Of Phytotherapic
Robusterina.
The present work aims at to determine the chromatographic profile of the parts of used plants the
production of phytotherapic ROBUSTERINA. The product is constituted by three plants: Berberis
vulgaris L, Gossypium herbaceum L. and Viburnum opulus. Aliquot of 10 L of tinctures of B.
vulgaris, G. herbaceum and V. opulus (samples 1a, ab and ç), the methanolic extracts 10% (p/V)
and the hidroalcoholic extracts (30:70) 10% (p/V) of the three plants were submitted to a
chromatography in analytical thin layer (CCDA) using gel silica plates (Merck) silica (art. 105553)
and mobile phases of several polarities. Showing the chromatograms with adequate reagents to the
Alkaloid characterization, Terpenoids (Monoterpenes, Diterpenes, Triterpenes, Sesquiterpenes,
Steroids and Saponosides), Polifenols (Coumarins, Flavonoids, Condensed Proantocianidins and
Leucoantocianidins, Acid Gallic), Sugars. The gotten results had been collated with data searched
in literature, proving the authenticity of the raw material used for the production of phytotherapic
ROBUSTERINA.
Keywords: Secondary metabolism; Robusterina; Thin Layer Chromatography
INTRODUÇÃO
A Robusterina, produto fitoterápico encontrado no mercado nacional desde 1932, produzido
pelo laboratório Diniz & Brandão é utilizada no tratamento das disfunções e regulação do ciclo
menstrual e, por estimular a contração uterina, seu uso é contra-indicado no período gestacional. A
dose média diária é de uma colher de sopa (15 ml) 3 vezes ao dia. O tratamento deve ser suspenso
quando houver normalização do ciclo menstrual, ou no caso de gravidez. Apresenta-se em sua
constituição três plantas: Berberis vulgaris, Gossypium herbaceum e Viburnum opulus.
As plantas são ricas em vários princípios ativos e, portanto, é necessária pesquisa qualitativa
dos mesmos. A identidade baseada nos constituintes químicos característicos da espécie exige
conhecimentos fitoquímicos prévios (Simões et al., 2004). Como não se deve realizar a análise de
todos os grupos (a não ser que seja pesquisa inicial), prioriza-se um ou dois que deve existir de fato
na droga (Marques et al., 1996).
Como cada planta apresenta diversos grupos químicos, pode-se observar a presença de
diversos fitofármacos ativos. Portanto essa presença/ausência pode ser um componente auxiliar
importante na determinação da qualidade e identidade da droga.
As reações químicas permitem verificar a presença de grupos de substâncias, como
Alcalóides, Mono, Sesqui, Diterpenos, Iridóides e Saponósidos, Esteróides e Triterpenóides,
78
Proantocianidinas Condensadas e Leucoantocianidinas, Taninos Hidrolisáveis, Cumarinas,
Flavonóides, e Açucares Redutores (Simões et al., 2004).
Como regra padrão, sugere-se efetuar em paralelo um ensaio com uma droga que contenha
efetivamente aquele grupo a ser pesquisado, de modo a ter-se um modelo da cor que se espera
(Marques et al., 1996).
Para as análises de identificação, objetivo do corrente trabalho, é recomendado a
determinação do perfil cromatográfico utilizando a técnica e o sistema cromatográfico adequados
para o grupo de constituintes avaliados. É recomendada a utilização de padrões das substâncias
características, de extratos, de amostra autêntica ou, na ausência destes de substâncias marcadoras
ou de referência (Simões et al., 2004). A análise cromatográfica é uma alternativa importante para a
identificação de matérias-primas adquiridas na forma de preparados fitoterápicos intermediários (no
caso a ROBUSTERINA).
A escolha do método (CCD) foi determinada pelo fato dele constar em monografias das
Farmacopéias atualizadas como a Farmacopéia Brasileira, Britânica, Americana, Alemã, entre
outras. Também pode-se contar com algumas literaturas específicas sobre a análise de drogas
vegetais por CCD que apresentam fotos ou desenhos de cromatogramas (Wagner e Bladt, 1996).
Recomenda-se citar o documento da Organização Mundial da Saúde (WHO, 1998).
A CCD é utilizada com grande freqüência na análise vegetal, em virtude da simplicidade,
rapidez e sensibilidade oferecidas pela técnica, e ainda pelo rigor dos resultados (Costa, 2000).
Devido a este fator, tal técnica foi utilizada para se obter a comprovação da autenticidade das
plantas contidas no produto ROBUSTERINA.
MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL
O material utilizado (casca da raiz de Berberis vulgaris L., casca do caule de Viburnum opulus
L,.casca da raiz de Gossypium herbaceum L) e as tinturas foram gentilmente cedidas pelo
Laboratório Diniz & Brandão e pelo fornecedor QUIMER.
O material foi submetido à secagem em estufa Precision Thelco Model 18 (45 C), durante 10
horas, sendo posteriormente triturado e reduzidas a pó semi-fino (moído em moinho de faca e
passado em tamis) e acondicionado em recipientes plásticos apropriados e assim conservado,
enquanto não utilizado.
Foi utilizado ainda Berberina (Merck), gossipol, escopoletina, rutina, -sitosterol, -amirina,
ácido caféico, D (+)-glicose (Extrasynthese).
79
EQUIPAMENTOS
Balança eletrônica de precisão GEHAKA mod. BG 1000, balança semi-analítica FILIZOLA
mod. P/ 5Kg, Câmara Fotográfica Ashai Pentax P- 50 e Nikon, Câmara Ultra-violeta (250-365 nm)
CHOMATO VUE, estufa Precision Thelco Model 18, Multiprocessador ARNO.
OUTROS MATERIAIS
Borrifadores para revelação em CCD, colunas cromatográficas, cubas cromatográficas para
CCD, filmes fotográficos Kodak Gold Plus 100 e 400, gel de sílica 70-230 Mesh MERCK, placas
cromatográficas MERCK Art. 015533, tubos de ensaio.
ABORDAGEM FITOQUÍMICA
Alíquotas de 10 L das tinturas de B. vulgaris, G. herbaceum e V. opulus (amostras 1a, ab e
1c), os extratos metanólicos a 10% (p/V) (amostras 2a, 2b e 2c) e os extratos hidroalcoólicos
(30:70) a 10% (p/V) (amostras 3a, 3b e 3c) das três plantas foram submetidas à cromatografia de
camada delgada analítica (CCDA) empregando-se placas prontas de gel de sílica Merck (art.
105553) como fase estacionária, fases móveis de polaridades diversas e reveladores adequados à
caracterização de Alcalóides, Polifenóis, Monoterpenos, Sesquiterpenos, Diterpenóides e Iridóides,
Triterpenos e Esteróides, Saponósidos, Açucares Redutores, Proantocianidinas Condensadas e
Leucoantocianidinas e Taninos Hidrolisáveis (Alúmen de Ferro). A tabela 1 relaciona os sistemas
de eluição e os metabólitos.
80
Tabela 1. Metabólitos, sistemas de eluição, reveladores e referências bibliográficas utilizadas para abordagem
fitoquímica de Berberis vulgaris, Gossypium herbaceum e Viburnum opulus
METABÓLITO
SISTEMA DE ELUIÇÃO REVELADOR
REFERÊNCIA
Alcalóides AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100:11:11:27 v/v)
Dragendorff (WAGNER,
1996)
Monoterpenóides,
sesquiterpenóides e
Dirterpenóides
Benzeno-AcOEt (97:3 v/v) Vanilina
Sulfúrica
(WAGNER,
1996)
Triterpenóides e
Esteróides
AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100:0,5:0,5:0,5 v/v)
Lieberman/
Burchard
(HARBONE,
1982)
Iridóides AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100:11:11:27 v/v)
Vanilina
Sulfúrica
(WAGNER,
1996)
Saponinas AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100:11:11:27 v/v)
Vanilina Sulfúrica (WAGNER,1996)
Açúcares n-BuOH-Me2CO-Tampão fosfato pH= 5,0
(40:50:10 v/v)
Trifeniltetrazólio
(METZ, 1961)
Cumarinas Éter-tolueno-AcOH 10% (50:50:50 v/v) U.V (WAGNER,
1996)
Ácido Gálico AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100:11:11:27 v/v)
NEU (STIASY,
1912)
Flavonóides AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100:11:11:27 v/v)
NEU (MARKHAN,
1982
WAGNER,
1996)
Proantocianidinas
condensadas e
Leucoantocianidinas
AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100:11:11:27 v/v)
Vanilina clorídrica (ROBERTSON, 1955)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Berberis vulgaris
Os ensaios fitoquímicos mostraram a presença de alcalóides com fator de retenção (Rf) entre
0,25 e 0,3 em todas as amostras e um alcalóide aproximado de Rf 0,6 (sendo provavelmente a
berberina) mais notadamente visto na amostra 2a (extrato metanólico a 10% (p/V) (Figura 1 a). Há
também a presença de açúcar (glicose) em todas as amostras e um dissacarídeo (açúcar mais polar)
81
nas amostras 1a e 2a (Figura 1 b). Também foi observado a presença de saponósidos nas amostras
2a e 3a e uma presença discreta na amostra 1 (Figura 1 c). Quanto aos derivados cinâmicos, há a
presença nas três amostras, na amostra 2a observa-se o ácido cafeico com Rf aproximado de 0,65
(Figura 1 d). Os resultados confirmam dados observados na literatura, principalmente no que diz
respeito aos alcalóides. O surgimento de manchas com coloração azul escuro foram usados como
critério que evidencia a presença de mono, sesqui e diterpenóides, dependendo dos valores de Rf
apresentados, face a fase móvel empregada.
1 2 3 4 1 2 3
1 2 3
1 2 3 4
(1. Tintura de B. vulgaris 2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico (30:70) a 10% (p/v)
1. Tintura de B. vulgaris 2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico (30:70) a 10% (p/v) 4. Padrão GLICOSE
1. Tintura de B. vulgaris 2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico (30:70) a 10% (p/v)
1. Tintura de B. vulgaris 2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico (30:70) a 10% (p/v) 4. Padrão saponina MERCK
a b
c d
82
Figura 1. CCDA de Berberis vulgaris: a) Alcalóides, b) Açúcares, c) Saponósidos, d) Derivados
Cinâmicos
Gossypium herbaceum
Os ensaios fitoquímicos mostraram a presença de leucoantocianidinas em quantidade discreta,
principalmente na amostra 1b (tintura) (Figura 2 a). Também foi encontrado açúcar (glicose) em
todas as amostras analisadas, mas em menor quantidade na amostra 1b (tintura) (Figura 2 b).
Observou-se também a presença de triterpenos e esteróides, notadamente beta-sitosterol, na amostra
1b (tintura), não estando presente nas amostras 2b e 3b (Figura 2 c). Quanto aos mono, sesqui e
diterpenos a CCDA, nos mostra uma presença muito discreta, principalmente na amostra 2b e 3b,
com Rf aproximado de 0,2. Constatou-se a presença de um componente na tintura, com pequena
migração, e com abundante quantidade, provavelmente o gossipol (Figura 2 d). Quanto às
saponinas, a literatura faz alusões à presença dela. Ao efetuar a CCD, observou-se a presença destes
metabólitos em todas as amostras, confirmando saqueles relatos (Figura 2 e).
83
a b
1 2 3
1 2 3 4
1. Tintura de G. herbaceum 2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico (30:70) a 10% (p/v)
1. Tintura de G. herbaceum
2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico (30:70) a 10% (p/v) 4. Padrão GLICOSE
c
1 2 3 4
d
1 2 3 4
1. Tintura de G. herbaceum 2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico (30:70) a 10% (p/v) 4. Padrão
1. Tintura de G. herbaceum 2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico
(30:70) a
84
Figura 2. CCDA de G. herbaceum: a) Leucoantocianidinas e proantocianidinas , b) Açúcares, c)
Triterpenos e Esteróides, d) Mono, sesqui e diterpenos, e) Saponósidos
Viburnum opulus
Os ensaios fitoquímicos mostraram a presença de açúcares (glicose) em todas as amostras.
(Figura 3a). Há também a presença de saponósidos (Figura 3b) em todas as três amostras. Detectou-
se também a presença de Leucoantocianidinas e Proantocianidinas condensadas e triterpenos ( -
amirina). A Figura 3c evidencia a presença de biflavonóide fluorescente amentoflavona com Rf
aproximado de 0,35, utilizando-se um sistema cromatográfico (clorofórmio: acetona: ácido fórmico
130:10:3) diferentemente do proposto por Wagner (1996). A Figura 3d nos mostra a presença de
cumarinas, principalmente a escopoletina com Rf aproximado de 0,45. Nos trabalhos realizados
também houve a evidência de presença de derivados do ácido caféico (ácido clorogênico).
e
1. Tintura de G. herbaceum 2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico (30:70) a 10% (p/v)
85
a
1 2 3 4
b
1 2 3
1. Tintura de V. opulus 2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico (30:70) a 10% (p/v)
1 2 3
1. Tintura de V. opulus 2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico (30:70) a 10% (p/v)
c
1. Tintura de V. opulus 2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico (30:70) a 10% (p/v) 4. Padrão GLICOSE
86
Figura 3. CCDA de Viburnum opulus: a) Açúcares, b) Saponósidos c) Biflavonóides, d)
Cumarinas
CONCLUSÃO
O perfil fitoquímico, aplicado à técnica de CCDA para as três plantas estudadas mostraram
resultados que foram condizentes com a literatura pesquisada o que confirma a autenticidade das
plantas. Na B. vulgaris foram detectadas a presença de alcalóides, especificamente a berberina,
açúcar (glicose) e dissacarídeo, saponósidos e ácido caféico. No G. herbaceum foram encontrados
leucoantocianidinas, glicose, provável beta-sitosterol e gossipol, e também, saponósidos. Quanto ao
V. opulus, observou-se a presença de açúcar (glicose), saponósidos, leucoantocianidinas e
proantocianidinas condensadas, triterpeno (provável beta-amirina), biflavonóide (amentoflavona),
cumarinas (escopoletina) e derivados do ácido caféico (indícios de ser ácido clorogênico).
AGRADECIMENTOS
Agradecemos à CAPES pela concessão bolsa de estudo ao primeiro autor e ao Laboratório
Diniz & Brandão pelo fornecimento das tinturas para o desenvolvimento do trabalho.
1 2 3 4
1. Tintura de V. opulus 2. extrato metanólico a 10% (p/v) 3. extrato hidroalcoólico (30:70) a 10% (p/v) 4. Padrão ESCOPOLETINA
d
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REFERÊNCIAS
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