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CATÁLISE ENZIMÁTICA

Bruno da Silva Thomazini

Gabriel Vendramini

Raquel Massaro

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA – UFSCar

São Carlos, 13 de Junho de 2011

Profa. Dra. Ignez Caracelli Prof. Dr. Julio Zukerman Schpector

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SUMÁRIO

1. MECANISMOS CATALÍTICOS

A. Catálise Ácido-Básica

B. Catálise Covalente

C. Catálise por Íons Metálicos Catálise Eletrostática

D. Catálise por meio de Efeitos de Proximidade e Orientação

E. Catálise por Ligação Preferencial do Estado de Transição

2. ANIDRASE CARBONICA

A. Estrutura Enzimática

B. Mecanismo Catalítico

3. SERINO-PROTEASES e CISTEÍNO-PROTEASES

A. O Sítio Ativo

B. Estruturas por Difração de Raio X

C. Mecanismo Catalítico

D. Zimogênios

4. ENZIMAS E NOVAS APLICAÇÕES E TECNOLOGIAS

ENZIMAS

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ENZIMAS – VISÃO GERAL

• Mediadoras de reações químicas;

• Função específica;

• Proteínas catalisadoras:

condições termodinâmicas;

sem alterações no processo global;

não consumidas;

específicas para substrato e reação química.

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ENZIMAS – VISÃO GERAL

• Atividade catalítica:

Enzimas (proteínas);

Enzimas (RNAs – ribozimas).

• União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB):

Seis classes.

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ENZIMAS – CLASSES

1. Oxidorreductases:

CH3 – CH – COO- + NAD+ CH3 – C – COO- + NADH + H+

OH O

CH2 - CH – COO- + THF CH2 – COO- + THF

Fonte: CHAMPE, C. P. et al. Bioquímica Ilustrada.

2e- 2H+

Lactato

Lactato- desidrogenase

Piruvato

OH NH3+

H2O

CH2 NH3

+

Glicina

Serina hidroximetil- transferase

Serina

2. Transferases:

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3. Hidrilases:

NH2 – C – NH2 + H2O CO2 + 2NH3

4. Liases:

CH3 – C – COO- CH3 – CH + CO2

O O

Fonte: CHAMPE, C. P. et al. Bioquímica Ilustrada.

ENZIMAS – CLASSES

Uréia

Urease

Piruvato- descarboxilase

Piruvato Acetaldeído

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5. Isomerases:

-OOC – CH – C –CoA -OOC – CH2 – CH2 – C - CoA

CH3 – C – COO- + CO2

-OOC – CH2 – C – COO-

Fonte: CHAMPE, C. P. et al. Bioquímica Ilustrada.

ENZIMAS – CLASSES

CH3

O O

Metilmalonil - CoA Succinil - CoA

Metilmalonil – CoA - mutase

6. Ligases:

Piruvato Oxalacetato

Piruvato- carboxilase O O ATP ADP + Pi

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PROPRIEDADES • Eficiência catalítica;

Fonte:CHAMPE, C. P. et al. Bioquímica Ilustrada.

• Eficiência catalítica;

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ENZIMAS – PROPRIEDADES

• Sítios ativos:

Fonte: CHAMPE, C. P. et al. Bioquímica Ilustrada.

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• Especificidade:

Complementaridade

Fonte:VOET, D.; VOET, J. G. Bioquímica.

ENZIMAS – PROPRIEDADES

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ESPECIFICIDADE

• Hipótese chave-fechadura:

• Hipótese ajuste induzido:

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MECANISMO CATALÍTICOS

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MECANISMOS CATALÍTICOS

• Fatores essenciais:

especificidade; organização otimizada.

• Natureza química:

catálise ácido-básica; catálise covalente; catálise por íons metálicos.

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MECANISMOS CATALÍTICOS

• Natureza física:

catálise eletrostática;

efeitos de proximidade e orientação;

ligação preferencial ao complexo do estado de transição.

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CATÁLISE ÁCIDO-BÁSICA

• Transferência de prótons entre substrato e enzima.

• Catálise ácida:

Grupo ácido doa um próton;

• Catálise básica:

Grupo básico recebe um próton;

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CATÁLISE ÁCIDO-BÁSICA

• Ex: tautomerização ceto-enólica

Fonte: VOET, D.; VOET, J. G. Bioquímica.

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CATÁLISE ÁCIDO-BÁSICA

• Ex: tautomerização ceto-enólica

• Aminoácidos ionizáveis: Lys, His, Arg, Asp, Glu, Cys e Tyr.

Fonte: VOET, D.; VOET, J. G. Bioquímica.

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CATÁLISE COVALENTE

• Ligação covalente transitória entre enzima-substrato;

• “Ataques” nucleofílico/eletrofílico de um radical do sítio catalítico sobre o substrato.

• Etapas:

reação nucleofílica; retirada de elétrons pelo catalisador

eletrofílico; eliminação do catalisador.

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CATÁLISE COVALENTE

Catálise predominantemente eletrofílica

Fonte: VOET, D.; VOET, J. G. Bioquímica.

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CATÁLISE POR ÍONS METÁLICOS

• Íons metálicos – cofatores metálicos;

• Metais: ligados à enzima ou na solução aquosa;

• Freqüentemente envolve metais de transição:

cargas positivas;

aceptores de pares eletrônicos.

• Interações iônicas:

orientação do substrato;

estabilizar cargas.

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CATÁLISE POR ÍONS METÁLICOS

• Três formas de participação:

ligação com o substrato;

mediando reações de oxirredução;

estabilizando eletrostaticamente.

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CATÁLISE POR ÍONS METÁLICOS

• Metaloenzimas:

contém íons metálicos fortemente ligados;

Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ ou Co3+.

• Enzimas ativadas por metais:

ligam íons metálicos da solução;

Na+, K+, Mg2+ ou Ca2+.

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CATÁLISE POR ÍONS METÁLICOS

• Enzimas/cofatores metálicos:

Fonte: MOTTA, V.T. Bioquímica Básica.

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CATÁLISE ELETROSTÁTICA

• Moléculas vizinhas - solventes:

redução dos efeitos de atração entre grupos químicos.

• Constante dielétrica muito baixa: reatividade química do substrato;

reduz a energia de ativação.

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CATÁLISE ELETROSTÁTICA

• Distribuição de cargas no sitio ativo:

estabilização dos estados de transição;

guiar substratos polares para seus sitios de ligação.

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CATÁLISE POR EFEITO DE PROXIMIDADE E ORIENTAÇÃO

• Enzimas têm maior eficiência catalítica com:

condição física do sítio catalítico;

relação espacial adequada complexo enzima-substrato orientado estado de transição.

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CATÁLISE POR EFEITO DE PROXIMIDADE E ORIENTAÇÃO

Fonte: VOET, D.; VOET, J. G. Bioquímica.

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CATÁLISE POR LIGAÇÃO PREFERENCIAL AO ESTADO DE TRANSIÇÃO

• Estado de transição liga-se com a enzima;

• Torção mecânica nos seus substratos:

“Mecanismo do balcão de estiramento”;

Facilita as reações.

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• Reação 315 vezes mais rápida quando R é o grupo CH3 e não H.

Fonte: VOET, D.; VOET, J. G. Bioquímica.

CATÁLISE POR LIGAÇÃO PREFERENCIAL AO ESTADO DE TRANSIÇÃO

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ANIDRASE CARBÔNICA

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ANIDRASE CARBÔNICA

• Metaloenzima

• Enzima da classe liase

• Monômero

• Sítio ativo Zn+

- Histidina 94 - Histidina 96 - Histidina 119

- Molécula de água

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ANIDRASE CARBÔNICA

Estrutura Enzimática

1hcb

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ANIDRASE CARBÔNICA 1hcb

Estrutura Enzimática

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ANIDRASE CARBÔNICA

Estrutura Enzimática com ligantes

1hcb

Bicarnobato

Zinco

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ANIDRASE CARBÔNICA 1hcb

Estrutura Enzimática

Zn

His119

His94

His96

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ANIDRASE CARBÔNICA

Estrutura Enzimática

1hcb

Zn

BCT

His

His

His

Água

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ANIDRASE CARBÔNICA

• Enzima que catalisa a conversão rápida de dióxido de carbono em um próton (H+) e um íon bicarbonato (HCO3-)

Anidrase Carbônica Dissociação

↓ ↓

CO2 + H2O ↔ H2CO3 ↔ H+ + HCO3-

Ácido Carbônico

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MECANISMO DE CATÁLISE ANIDRASE CARBÔNICA

Fonte: http://deqb.ist.utl.pt/bbio/72/pdf/cataliseenz.pdf

PROTEASES

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PROTEASES

• Catalizam a clivagem de ligações peptídicas (hidrolização)

• Responsáveis por:

– Renovação de Proteínas

– Reciclagem de aminoácidos

– Obtenção de novas proteínas

– Etc.

Fonte: http://graduacao.iqsc.usp.br/files/Aula12BioqIMecCatEnzExemplos201104072.pdf 41

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PROTEASES

• Subdivisões

– Exopeptidase: atuam grupamento amino ou carboxi terminal

– Endopeptidase: atuam regiões internas

• Divisão com base no grupo funcional: (Barret, 1994)

– *Serino Proteases – resíduo de serina no sítio ativo

– *Cisteíno Proteases – resíduo de cisteína no sítio ativo

– Aspartil – 2 unidades de ácido aspártico

– Metalo – utiliza íon metal no mecanismo de catálise

SERINO PROTEASES

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(EC 3.4.21) – 3 representa a Classe = Hidrolase (catalisa reações de hidrólise de ligações

covalentes) – 4 é a Sub-Classe = Peptidase (hidrolisa ligações peptídicas) – 21 é a Sub sub-classe das serino-endopeptidases (enzimas contendo serina no

sítio ativo)

SERINO PROTEASES

Serina

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SERINO PROTEASES Sítio Ativo

• Tríade Catalítica: resíduos (Ser, Asp e His)

Tripsina Fonte: PDB (2D8W)

Serina

Aspartato

Histidina

Quimotripsina Fonte: PDB (2Y6T)

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SERINO PROTEASES Identificação do Sítio Ativo

• Marcação covalente com DIPF (diisopropylphosphofluoridate) • Apenas a Ser reativa ligou ao DIPF - 1 de 20 Ser na Quimotripsina

Figura pg4 Arq Aula12Bioq.....

Fonte: http://graduacao.iqsc.usp.br/files/Aula12BioqIMecCatEnzExemplos201104072.pdf

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SERINO PROTEASES Estruturas de Raio X

• 1957 – Estrutura da quimotripsina bovina (David Blow) • Estrutura primária - ~40% idênticos • Ser reativa / His cataliticamente essencial / Asp próxima ao sítio • 2 domínios • Folhas anti paralelas • Estruturas Raio X sugerem uma base para diferentes especificidades

Tripsina Elastase

Fonte :http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/proteases2.htm Fonte: http://chemistry.umeche.maine.edu/MAT500/Peptidase2.html

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MECANISMO CATALÍTICO • Aplicável à todas serino-proteases

Fonte: DONALD VOET & JUDITH G. VOET Bioquímica Ed. Artmed, 2007

Ataque nucleofílico ao grupo carbonila

A)

Complexo

Enzima - Substrato

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Catálise ácida geral formação do intermediário acil-enzima

B)

Intermediário

Tetraédrico

MECANISMO CATALÍTICO

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Nova extremidade N-terminal

C)

Intermediário

acil-enzima

MECANISMO CATALÍTICO

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Substituição do grupo amina por uma molécula de água

D)

MECANISMO CATALÍTICO

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Fonte: DONALD VOET & JUDITH G. VOET Bioquímica Ed. Artmed, 2007

Reverso da Etapa B

E)

Intermediário

acil-enzima

MECANISMO CATALÍTICO

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Novo extremo C-terminal da cadeia polipeptídica

F)

MECANISMO CATALÍTICO

53

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- Catálise por tencionamento forma estrutura tetraédrica

- Intermediário tetraédrico estabilizado pelo buraco oxiânion

MECANISMO CATALÍTICO

CISTEÍNO PROTEASES

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(EC 3.4.22) – 3 representa a Classe = Hidrolase (catalisa reações de hidrólise de ligações

covalentes) – 4 é a Sub-Classe = Peptidase (hidrolisa ligações peptídicas) – 21 é a Sub sub-classe das cisteíno-endopeptidases (enzimas contendo cisteína

no sítio ativo)

CISTEÍNO PROTEASES

Cisteína

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CISTEÍNO PROTEASES

• Divididas de acordo com semelhanças estruturais e funcionais

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CISTEÍNO PROTEASES Estruturas de Raio X

• 1 única cadeia • 2 domínios formando a fenda catalítica

Papaina – 8pap

Domínio 1

Fenda Catalítica

Domínio 2

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CISTEÍNO PROTEASES Identificação do Sítio Ativo

• Tríade Catalítica

Cys25, His159 e Asn75 (Papaína)

• Cys e His estão em fendas opostas

par iônico estável em pH neutro, responsável pela atividade catalítica.

(Lewis, Johnson et al., 1981)

Fonte: http://ha1000tonc22.br.tripod.com/ 59

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His159

Asn175

Cys25

Papaína

Papaina – 8pap

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MECANISMO CATALÍTICO • cisteíno-proteases

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ZIMOGÊNIOS

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ZIMOGÊNIOS

• Precursores inativos de enzimas proteolíticas

• Possuem todos os resíduos catalíticos

• Sítio ativo distorcido

“A ativação seqüencial permite

rápida produção de grandes

quantidades de enzimas ativas

em resposta a diversos sinais

fisiológicos”.

Tripsina

Tripsinogênio

Elastase

Enteropeptidase

Quimotripsogênio

Quimotripsina

Pró-elastase

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Tripsinogênio clivagem da ligação entre Lys15 – Ile16.

Quimotripsinogênio clivagem da ligação peptídica Arg15-Ile16 catalisada pela

tripsina.

Pró-elastase é ativada pela clivagem de um pequeno peptídeo N-terminal.

ATIVAÇÃO DE ZIMOGÊNIOS

Fonte: DONALD VOET & JUDITH G. VOET Bioquímica Ed. Artmed, 2007

N-terminal

Tripsinogênio

N-terminal

Tripsina

APLICAÇÕES TECNOLÓGICAS

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APLICAÇÕES TECNOLÓGICAS

• Ano de 2009

• Enzimas utilizadas para obtenção de ésteres utilizados como produtos alimentícios, farmacêuticos e cosméticos.

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APLICAÇÕES TECNOLÓGICAS

• Os processos catalíticos tradicionais envolvem ácidos (como ácido sulfúrico) e bases (como hidróxido de sódio) como aceleradores da reação.

• Porém, esses catalisadores têm sido, aos poucos estão sendo substituídos por enzimas, visto que essas apresentam como benefícios condições suaves de operação (temperatura, pressão e pH), especificidade e poucas perdas na reação.

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APLICAÇÕES TECNOLÓGICAS

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• Ano de 2009

• Utilização de enzimas na polimerização para produção de materiais derivados de fontes renováveis e com características como biocompatibilidade e biodegradabilidade.

• Evita a utilização de catalizadores tóxicos.

APLICAÇÕES TECNOLÓGICAS

• Ano de 2010

• Desenvolvimento de um biossensor enzimático para determinação de fenóis

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APLICAÇÕES TECNOLÓGICAS

70 Fonte: http://www.embrapa.br/imprensa/artigos/2011/catalise-enzimatica-produz-biodiesel-mais-verde/

Prós:

Propriedades físicas e químicas

similares ao biodiesel convencional

Substitui catalisador alcalino

Biodegradáveis

Contra:

Custo elevado dos Biocatalisadores

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ALBERT L. LEHNINGER DAVID L. NELSON MICHAEL M. COX Lehninger Princípios de

Bioquímica Ed. Sarvier, 2007

DONALD VOET & JUDITH G. VOET Bioquímica Ed. Artmed, 2007

Gomes, D. E. B. Estudo da Falcipaína-2 em Complexo com Ligantes por Modelagem e

Dinâmica Molecular como Suporte ao Desenvolvimento Racional de novos Fármacos

Antimaláricos Rio de Janeiro, UFRJ, IBCCF, 2006.

BIBLIOGRAFIA

http://graduacao.iqsc.usp.br/files/Aula12BioqIMecCatEnzExemplos201104072.pdf.

Acesso em Maio, 2011.

http://analgesi.co.cc/html/t13662.html. Acesso em Maio, 2011.

http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/en

zimas.html. Acesso em Maio, 2011.

http://www.gilvan.pro.br/bioquimica.pdf. Acesso em Maio, 2011.

http://deqb.ist.utl.pt/bbio/72/pdf/cataliseenz.pdf. Acesso em Maio, 2011

OBRIGADO!

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