DECLARAÇÃO DE CONFLITO DE INTERESSE

O AUTOR DESTA APRESENTAÇÃO DECLARA NÃO POSSUIR CONFLITOS DE INTERESSE

DNA E RNA PARA PESQUISA EM GENÔMICA E TRANSCRIPTÔMICA

MOISÉS ALVES FERREIRA FILHOMESTRE EM CIÊNCIAS - FISIOPATOLOGIA MÉDICA – UNICAMP

DOUTORANDO EM FISIOPATOLOGIA MÉDICA – UNICAMP

HEMO 2016 – ANEMIAS: BANCO DE DNA, RNA E CÉLULAS

Florianópolis-SC, 2016

CONSIDERAÇÕES GERAIS

Assim como os cuidados com a documentação técnica e organização de materiais biológicosarmazenados em Biorrepositórios/ Biobancos, é de fundamental importância a verificação emanutenção dos seus critérios de qualidade.

Utilizados de maneira ética e racional e conduzam ao(s) objetivo(s) para o qual foram obtidos.

A qualidade (pureza, integridade) do material depende de fatores como extração, técnicas deconservação e armazenamento e pode variar de acordo com os objetivos e necessidades doprojeto de pesquisa.

DNA E RNA HUMANOS: USOS EM BIOLOGIA MOLECULAR

DNA:

• PCR (reação em cadeia da polimerase);• Estudos com restrição enzimática;• Genotipagem;• Sequenciamento de DNA por Sanger;• Sequenciamento completo do genoma,

exoma ou de suas frações (sequenciamento de nova geração).

RNA:

• PCR Quantitativo em Tempo Real;

• Microarrays (microarranjos);

• Sequenciamento completo do transcriptoma ou de suas frações (RNA-Seq).

Simon R, Roychowdhury S. Nat Rev Drug Discov.2013.

Abordagens e aplicaçõesSEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO (NEXT-GENERATION SEQUENCING):

DNA PARA PESQUISA EM GENÔMICA

ESTABILIDADE DO DNA

FATORES QUE ALTERAM A ESTABILIDADE E A INTEGRIDADE DO DNA GENÔMICO:

• Exposição a flutuações de temperatura, tais como ciclos de congelamento / descongelamento;

• Tanto a água quanto a exposição ao oxigênio podem danificar o DNA por hidrólise ácida e outros danos oxidativos;

• Ação de nucleases que não foram devidamente removidas no processo de purificação.

Dissociative (DN+AN) mechanism for phosphate mono and diester-hydrolysis.

WILLIAMS, N. H. DNA hydrolysis: mechanism and reactivity. In: Artificial Nucleases. Springer Berlin Heidelberg, 2004. p. 3-17.

EXTRAÇÃO DE DNA

• Finalidade dos métodos de extração

• Desintegrar a membrana celular e conseguir eliminar ao máximo lipídios e proteínas para obter um DNA puro.

• A escolha do método de extração(Equilíbrio tempo de extração / qualidade do material obtido)

1. Objetivo do estudo (regiões regulatórias, somente codificantes, etc.);

2. O tipo de análise que se deseja realizar;

3. O tipo de ácido nucleico;

4. Custo.

Sirakov, I.N. Nucleic Acid Isolation and Downstream Applications. In:Nucleic Acids - From Basic Aspects to Laboratory Tools. INTECH, 2016.

PROTOCOLOS EMPREGADOS NA ROTINA DE EXTRAÇÃO DE DNA DE AMOSTRAS DE SANGUE

1. Soluções de Extração:

• Fenol-clorofórmio-álcool isoamílico:• Clorofórmio desnatura as proteínas e facilita a separação das fases aquosa e orgânica;• Pode deixar resíduos de EDTA/ fenol/ etanol. Particularmente EDTA é um conhecido quelante que pode

comprometer a atividade de enzimas de restrição em protocolos de sequenciamento de nova geração.

• Fenol e proteinase K:• Método de escolha quando grandes quantidades de DNA são necessárias;• Também leva EDTA no tampão de lise e etanol para precipitação.

• Cloreto de lítio

• Precipitação com sais:• NaCl 10 mM,Tris−HCl 10 mM, MgCl2 5 mM na solução de lise;• Proteinase K e EDTA.

Green, Michael R. et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual.-v.1. New York; Cold Spring Harbor; 2012.

PROTOCOLOS EMPREGADOS NA ROTINA DE EXTRAÇÃO DE DNA DE AMOSTRAS DE SANGUE

2. Minicolunas de Purificação:

• O DNA pode se ligar por adsorção à fase sólida (sílica ou outros), de acordo com o pH e

a concentração de sal do tampão utilizado;

• São preferíveis para obter DNA puro a ser utilizado em sequenciamento de nova geração.

Sirakov, I.N. Nucleic Acid Isolation and Downstream Applications. In:Nucleic Acids - From Basic Aspects to Laboratory Tools. INTECH, 2016.

INTEGRIDADE DO DNA

Amostras com “arraste” (smeared DNA).

A. B.

DNAs com quebras de dupla-fita (double-strand breaks)

C.

Bandas de DNAs não-degradados

Sirakov, I.N. Nucleic Acid Isolation and Downstream Applications. In:Nucleic Acids - From Basic Aspects to Laboratory Tools. INTECH, 2016.

Integridade do DNA genômico verificado através de eletroforese em gel de agarose 1%.

2100 Bioanalyzer

Perfil qualitativo de corrida eletroforética de gDNA – Agilent2100 Bioanalyzer (DNA 12000 kit).

Marcador maior

Marcador menor

High Sensitivity DNA: 50-7000pb

DNA 12000 Kit:100-12000pb

Tamanho em pb

INTEGRIDADE

A corrida em Bioanalyzer tem como objetivo analisar o perfil de integridade do DNA

(fragmentado, íntegro), bem como a distribuição do tamanho do DNA.

INTEGRIDADE

DNAs de Alto Peso MolecularBoa Integridade

DNAs com Baixa QualidadeAmostras com Degradação/ Arraste

Perfis de integridade retirados de “Ferreira Filho, Moisés Alves. Rastreamento De Variantes Genéticas Em Neoplasias Mieloides Familiares Por Sequenciamento Do Exoma. Dissertação. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas 2016.”

QUANTIFICAÇÃO

1. Espectrofotometria por absorção UV:

• Detecta ácidos nucleicos com baixa especificidade;• Contaminantes elevam os valores de concentração;• Não é recomendado como quantificador fidedigno

para DNAs destinados a sequenciamento de nova geração.

2. Bioanalyzer 2100:

• Não é recomendável para quantificação, pois sua análise é majoritariamente qualitativa;

• A sua acurácia é altamente dependente da diluição e do cuidado ao manuseio do material genético.

Robin, J. D. et al. (2016). Comparison of DNA Quantification Methods for Next Generation Sequencing. Scientific reports, 6.

3. Ensaios baseados em fluorescência por ligação aods-DNA: Qubit ou PicoGreen

• Detectam especificamente o DNA dupla-fita;• É recomendável para protocolos que exigem

quantificação com elevada acurácia;• Não discriminam bibliotecas de NGS com sequências

incompletas (com e sem adaptadores, por ex.).

4. qPCR:

• Ideal para quantificação específica de bibliotecas deNGS.

Robin, J. D. et al. (2016). Comparison of DNA Quantification Methods for Next Generation Sequencing. Scientific reports, 6.

QUANTIFICAÇÃO

PUREZA

Potenciais Fontes de ContaminaçãoLeitura Baixa Leitura Alta

Razão A260/A230

• Fenol residual da extração;• Presença de carboidratos

(frequentemente um problema com as plantas).

• Guanidina residual (muitas vezes usado em kits de microcolunas).

• Leituras da solução “branco” em pedestal “sujo”.• Uso de soluções inapropriadas para medição do branco. A

solução do branco deve ter o pH e força iônica semelhantes à da solução amostrada. Ex: Uso de água para a medição do branco para amostras dissolvidas em TE pode resultar em baixa relação 260/230.

Razão A260/A280

• Fenol residual ou outro reagente relacionado com o protocolo de extração.

• Concentrações muito baixas de ácido nucleico.

• RNA residual da extração de ácidos nucléicos.* Elevada razão 260/280 normalmente não é indicativa de qualquer problema.

• As razões de absorbância são utilizadas para avaliar a pureza dos ácidos nucleicos;• A razão A260/A280 recomendada para dsDNA é de ~1.8 (1.8-2.0);• Razões menores que 1.7 geralmente indicam significativa contaminação por proteínas.

RNA PARA PESQUISA EM BIOLOGIA MOLECULAR

ESTABILIDADE E INTEGRIDADE DO RNA

Fabre AL. An efficient method for long-term room temperature storage of RNA. Eur J Hum Genet. 2014.

O RNA é quimicamente instável → sofre clivagem espontânea das ligações fosfodiéster 3’-5’ por meio de reação de transesterificação via ataque nucleofílico dos átomos de fósforopelo grupo hidroxila-2’ adjacente.

O RNA é muito suscetível à oxidação por espécies reativas de oxigênio (ROS): O ozônio, por exemplo, é uma espécie reativa que reage rapidamente com o RNA em

solução ou em estado sólido.

Structure of RNase A

O RNA é particularmente sensível à ação de nucleases (RNAses): RNAses são onipresentes (pele, partículas de poeira, bactérias,

utensílios de laboratório, etc.); São liberadas após a lise celular; Sua inativação é relativamente difícil.

Cuidados ao manuseio do RNA:

UTENSÍLIOS/ EQUIPAMENTOS TRATADOS

• Preparar todas as soluções e tampões com H2O tratada com DEPC (Diethylpyrocarbonate/pirocarbonato de dietila) e vidraria livre de RNAses;

• Sempre que possível, tratar as soluções com DEPC 0,1% (overnight) seguido por autoclavagem(121°C, 30min);

• Utilizar pipetas e plataformas para géis exclusivas para RNA. Ponteiras e tubos livres de RNAses;

• Lavar utensílios, quando possível, com 0.1N NaOH/1mM EDTA e, em seguida, com H2O tratada com DEPC.

ESTABILIDADE E INTEGRIDADE DO RNA

Green, Michael R. et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual.-v.1. New York; Cold Spring Harbor; 2012.

PREPARO DE TAMPÕES/ SOLUÇÕES

• Soluções/ tampões contaminados com bactérias ou outros microrganismos → devem ser descartadas, uma vez que RNAses não podem ser removidas por autoclavagem;

• Sempre utilizar técnicas/locais assépticos para o preparo de soluções;

• Armazenar soluções em pequenas alíquotas e descartá-las após o uso;

• Aquecer previamente a vidraria a 300°C, 4 horas ou 250ºC overnight.

ESTABILIDADE E INTEGRIDADE DO RNA

Green, Michael R. et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual.-v.1. New York; Cold Spring Harbor; 2012.

EXTRAÇÃO

• Método mais utilizado para extração do RNA;

• Vantagens: melhor pureza, mais rápido;

• Agentes desnaturantes potentes, como o isotiocianato de guanidina e o cloridrato de guanidina:

• Ropem células, solubilizam os seus componentes e desnaturam RNAsesendógenas simultaneamente;

• Mantêm a integridade do RNA.

• Após homogeneização da amostra com Reagente TRIzol®, adiciona-se clorofórmio e obtém-se a separação de 2 fases distintas;

• O RNA é precipitado a partir da camada aquosa com isopropanol.

FENOL – ISOTIOCIANATO DE GUANIDINA – CLOROFÓRMIO (Método do TRIzol®)

EXTRAÇÃO

MINICOLUNAS DE PURIFICAÇÃO

• A razão A260/A280 recomendada para ssRNA é de ~2.0 (aceitável de1.8-2.0);

• Razões menores que 1.7 indicam significativa contaminação porproteínas.

• A razão A260/A230 para RNA e DNA deve ser aproximadamente igualà sua razão A260/A280 (e, portanto, ≥ 1,8). Razões mais baixaspodem indicar contaminação por compostos orgânicos (porexemplo, fenol, álcool ou carboidratos).

Xie, J. et al. (2015). Simultaneous extraction, separation and purification of microbial genomic DNA and total RNA from acidic habitat samples.Analytical Methods, 7(3), 909-917.

PUREZA

CONTROLE DE QUALIDADE

• Estão indicadas as bandas de rRNA 28S e 18S;

• Lanes 1 e 2: exemplos de RNA intacto com umarazão de 28S:18S rRNA de aproximadamente 2:1.

• Lane 3: exemplo de RNA degradado com arrasteabaixo das bandas 28S e 18S rRNA ;

• Lane 4: exemplo de degradação de RNA queresultou em perda da banda 28S rRNA e acúmulode RNA degradado na parte inferior do gel;

• Lane 5: RNA com significativa contaminação porDNA genômico (gDNA).

Wieczorek D, Delauriere L and Schagat T. Methods of RNA Quality Assessment. Promega Corporation Web site. http://www.promega.com.br/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment/ Updated October 2012.

Análise do RNA por eletroforese em gel de agarose

“Ninguém é tão grande que não possa aprender e nem tão pequeno que não possa ensinar”.(Autor desconhecido)

Obrigado!