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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA MESTRADO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE JÚLIA GONÇALVES MAYER COMPARAÇÃO DA ANÁLISE DE ÁCIDOS GRAXOS TRANS EM BISCOITO POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG-EM) E POR ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE FOURIER E REFLECTÂNCIA TOTAL ATENUADA (FT-IR- ATR) Niterói, 2017
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
MESTRADO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE
JÚLIA GONÇALVES MAYER
COMPARAÇÃO DA ANÁLISE DE ÁCIDOS GRAXOS TRANS EM BISCOITO POR
CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS
(CG-EM) E POR ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM
TRANSFORMADA DE FOURIER E REFLECTÂNCIA TOTAL ATENUADA (FT-IR-
ATR)
Niterói,
2017
JÚLIA GONÇALVES MAYER
COMPARAÇÃO DA ANÁLISE DE ÁCIDOS GRAXOS TRANS EM BISCOITO POR
CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS
(CG-EM) E POR ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM
TRANSFORMADA DE FOURIER E REFLECTÂNCIA TOTAL ATENUADA (FT-IR-
ATR)
Dissertação de mestrado apresentado ao
Programa de Pós Graduação em Ciências
Aplicadas a produtos para Saúde, da Faculdade
de Farmácia, da Universidade Federal
Fluminense, como parte dos requisitos
necessários para obtenção do título de mestre
em ciências.
Orientadora:
Professora Dra. KÁTIA GOMES DE LIMA ARAÚJO
Co-orientadora:
Professora Dra. JOSIANE ROBERTO DOMINGUES
Niterói,
2017
JÚLIA GONÇALVES MAYER
COMPARAÇÃO DA ANÁLISE DE ÁCIDOS GRAXOS TRANS EM BISCOITO POR
CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS
(CG-EM) E POR ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM
TRANSFORMADA DE FOURIER E REFLECTÂNCIA TOTAL ATENUADA (FT-IR-
ATR)
Dissertação de mestrado apresentado ao
Programa de Pós Graduação em Ciências
Aplicadas a produtos para Saúde, da Faculdade
de Farmácia, da Universidade Federal
Fluminense, como parte dos requisitos
necessários para obtenção do título de mestre
em ciências.
BANCA EXAMINADORA:
____________________________________________________________
Professora Dra. Kátia Gomes de Lima Araújo – Orientadora – UFF
____________________________________________________________
Professora Dra. Marcia Barreto da Silva Feijó - UFF
____________________________________________________________
Professora Dra. Silvia Regina Magalhaes Couto Garcia - UFRJ
Niterói,
2017
“Feliz é aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.”
Cora Coralina
AGRADECIMENTO
Agradeço a Deus por iluminar e proteger minha trajetória de vida.
Agradeço à minha mãe, Zelma, pelo seu constante carinho e dedicação. Sempre com
sua calma, me dando força e acreditando nos meus sonhos e minhas realizações.
Ao meu pai, Jorge Miguel sempre disposto a me ajudar, meu espelho de inteligência.
À minha avó, Zilá, pelo estímulo carinhoso e orações incessantes.
À minha orientadora, Kátia, por ter me incentivado a desafiar os limites do meu
conhecimento, por sua atenção, apoio incondicional e sempre acreditar que no final tudo vai
dar certo.
À minha co-orientadora, Josiane pela atenção e sempre disposta a ajudar.
Aos amigos conquistados no Laboratório de Biotecnologia de Alimentos
(LABIOTEC).
Aos professores e técnicos do Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a
Produtos para Saúde e aos funcionários da Faculdade de Farmácia.
À aluna de iniciação científica, Carolina Dinizr por contribuir com os resultados
alcançados.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão de bolsa de estudo durante o curso do mestrado.
Enfim, agradeço aos presentes em minha vida e aos que passaram por ela deixando
saudades.
RESUMO
Os métodos analíticos utilizados para medir o percentual de ácido graxo trans (AGT) em
alimentos envolvem cromatografia em fase gasosa com detecção de ionização de chama (CG-
DIC), espectrometria de massas (CG-EM) e espectroscopia no infravermelho com
transformada de Fourier e refletância total atenuada (FT-IR-ATR). O presente estudo teve
como objetivo investigar a viabilidade e a aplicabilidade do uso das técnicas de FT-IR-ATR,
sem extração, com extração prévia da gordura e após hidrólise e metilação dos ácidos graxos,
para avaliar o conteúdo de AGT em biscoitos recheados e comparar os resultados obtidos com
os encontrados para a determinação de ácido elaídico pela técnica de CG-EM. Foram
escolhidas 9 marcas de biscoitos recheados sabor chocolate e 1 pacote de gordura vegetal
hidrogenada, para ser usada como padrão secundário para análise de AGT por FT-IR-ATR.
As amostras foram analisadas, inicialmente, quanto aos seus conteúdos de umidade e lipídeos
totais. Para todas as amostras não foi observada concentração de umidade superior a 6,03
g/100 g. Os lipídeos totais variaram de 12,51±0,58 a 23,84±0,09 g/100 g. A presença de AGT
foi identificada por FT-IR-ATR pela visualização da banda próxima a 966 cm−1
e confirmada
com adição de padrão às amostras. Ao analisar as amostras de biscoito homogeneizadas e sem
outro preparo, não foi viável a utilização do método de FT-IR-ATR, visto que a absorção de
radiação infravermelha de substâncias da amostra se sobrepõe à absorção na região das
ligações duplas trans, o que demonstra que a matriz do alimento pode influenciar na análise.
Quanto a presença dos AGT, ácido elaídico (C18:1, n-9 trans) foi identificado e confirmado
em todas as amostras através de CG-EM. Ao comparar a quantificação pelos métodos CG-EM
e FT-IR-ATR em amostras de extratos e na forma de ácidos graxos metilados (FAME), foram
observadas concentrações baixas de ácido elaídico/ácidos graxos trans (de 0,03±0,01 a
0,86±0,01 g/100 g de biscoito) obtidas pelos diferentes métodos. Não foram encontradas
diferenças significativas entre as concentrações de AGT determinadas pelos três métodos
testados para oito das nove amostras analisadas. O presente trabalho mostrou que a técnica de
FT-IR-ATR, analisando o extrato lipídico e as amostras em forma de FAME foi adequado
para estimar os teores de AGT em biscoito recheado de chocolate, visto que proporciona uma
análise mais rápida, com um menor número de etapas e menor consumo de reagentes em
relação às análises por CG-EM.
Palavras-chave: Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier e refletância
total atenuada (FT-IR-ATR), cromatografia gasosa (CG), ácidos graxos trans
(AGT), ester metílico de ácidos graxos (FAME), biscoitos recheados de chocolate, lipídeos,
ácido elaídico.
ABSTRACT
The analytical methods used to measure the percentage of trans fatty acids in foods involve
gas chromatography with flame ionization detection (GC-FID), mass spectrometry (GC-MS)
and attenuated total reflectance fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FT-IR). The
aim of the present study was to investigate the feasibility and applicability of ATR-FT-IR
techniques, without extraction, with previous extraction of fat and after hydrolysis and
methylation of fatty acids to evaluate the content of TFA in filled biscuits, and compare the
results obtained with those found for the determination of elaidic acid by the CG-MS
technique. Were chosen 9 marks of chocolate filled biscuit and 1 packet of hydrogenated
vegetable fat to be used as a secondary standard for AGT analysis by ATR-FT-IR. The
samples were initially analyzed for their moisture contents and total lipids. For all samples, no
moisture content higher than 6.03 g/100 g. Total lipids ranged from 12.51 ± 0.58 to 23.84 ±
0.09 g/100g. The presence of TFA was identified by ATR-FT-IR through the visualization of
the band near 966 cm−1
and confirmed with addition of standard to the samples. When
analyzing the homogenized cookie samples and without further preparation, the use of the
ATR-FT-IR method was not feasible because the absorption of infrared radiation from sample
substances overlaps the absorption in the region of the trans double bonds, which
demonstrates that the food matrix may influence the analysis. Regarding the presence of TFA,
elaidic acid (C18: 1, n-9 trans) was identified and confirmed in all samples by GC-MS. When
comparing quantification by GC-MS and ATR-FT-IR in samples of extracts and in the form
of fatty acids methly esters (FAME), low concentrations of elaidic acid / trans fatty acids
were observed (0.03 ± 0.01 to 0.86 ± 0.01 g / 100 g of biscuit) obtained by the different
methods. No significant differences were found between the concentrations of TFA
determined by the three methods tested for eight of the nine samples analyzed. The present
study showed that the ATR-FT-IR technique, analyzing the lipid extract and the samples in
the form of FAME, was adequate to estimate the TFA contents in chocolate filled biscuit,
because it provides a faster analysis with a smaller number of steps and lower toxic chemicals
in relation to GC-MS analyzes.
Keywords: attenuated total reflectance fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FT-IR),
gas chromatography (GC), trans fatty acids (TFA), fatty acid methyl ester (FAME), chocolate
filled biscuits, lipids, elaidic acid.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Fórmulas estruturais de ácido graxo cis (ácido oleico) e seu isômero trans
(ácido elaídico), p.20
Figura 2. Esquema interno de funcionamento do cromatógrafo a gás com detecção de
espectrometria de massas, p.36
Figura 3. Diferentes formas de vibrações moleculares de deformação, p.41
Figura 4. Representação esquemática do interferômetro de Michelson, o interferograma
gerado e o espectro, p.43.
Figura 5. Cromatograma de íons totais (TIC) para identificação dos principais ésteres
metílicos de ácidos graxos obtidos da amostra de gordura vegetal hidrogenada por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (tempo de retenção (TR) versus
intensidade), p.54
Figura 6. Cromatograma de íons totais (TIC) para identificação dos principais ésteres
metílicos de ácidos graxos obtidos da amostra de biscoito B por cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massas (tempo de retenção (TR) versus intensidade), p.55
Figura 7. Zoom do TIC do padrão de elaidato de metila (visualização do TR 36.300 min),
p.68
Figura 8. Espectro de massas do do padrão de elaidato de metila (TR 36.30 min), p.68
Figura 9. Zoom do TIC da amostra G antes de fortificação com a solução padrão de elaidato
de metila, p.68
Figura 10. Zoom do TIC da amostra G após de fortificação com a solução padrão de elaidato
de metila (60 μL de solução padrão), p.69
Figura 11. Curva de calibração do ácido elaídico (área versus concentração em μg/mL), p.72
Figura 12. Espectro de FT-IR-ATR de Gordura vegetal hidrogenada, analisada por FT-IR-
ATR sem pré-tratamento, p.76
Figura 13. Espectros de FT-IR-ATR de amostras de biscoitos recheados homogeneizados (A,
B, C, D, F, G, H, I) analisadas por FT-IR-ATR sem pré-tratamento, p.79
Figura 14. Espectros de FT-IR-ATR de extratos gordurosos de biscoitos recheados de
chocolate, p.82
Figura 15. Espectros de FT-IR-ATR de amostras de biscoitos recheados de chocolate na
forma de FAME, p.84
Figura 16. Espectro de FT-IR-ATR de gordura vegetal hidrogenada na forma de FAME, p.85
Figura 17. Banda de absorção a 966 cm-1
do extrato da amostra E e após fortificação com
gordura vegetal hidrolisada (GV), p.85
Figura 18. Banda de absorção a 966 cm-1
da amostra E, como FAME e após fortificação com
padrão de elaidato de metila (AE), p.86
Figura 19. Espectro de FT-IR-ATR de óleo de soja, p.87
Figura 20. Curva de calibração para quantificar AGT nas amostras de extratos lipídicos, p.88
Figura 21. Curva de calibração para quantificar AGT nas amostras FAME, p.88
Figura 22. Curva de calibração para quantificar AGT nas amostras de extrato lipídicos (% de
ácido elaídico versus a altura da banda 966 cm-1
), p.89
Figura 23. Comparação da quantidade de ácido elaídico/ácidos graxos trans em biscoito
recheado sabor chocolate usando os diferentes métodos CG-EM, FT-IR-ATR extrato e FT-IR-
ATR com amostras na forma de FAME, p.94
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Regiões espectrais do infravermelho, p.40
Tabela 2. Determinação do conteúdo de lipídeos das amostras de biscoitos recheados de
chocolate analisados, p.52
Tabela 3. Estruturas químicas dos ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME), p.57
Tabela 4. Perfil dos principais ácidos graxos presente na gordura vegetal hidrogenada, p.58
Tabela 5. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado A, p.59
Tabela 6. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado B, p.60
Tabela 7. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado C, p.61
Tabela 8. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado D, p.62
Tabela 9 Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado E, p.63
Tabela 10. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado F, p.64
Tabela 11. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado G, p.65
Tabela 12. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado H, p.66
Tabela 13. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado I, p.67
Tabela 14. Amostras analisadas e os ingredientes declarados nos respectivos rótulos, p.70
Tabela 15. Concentrações de ácido elaídico (AE) por 100 g de gordura, por 100 g de biscoito
e por porção de biscoito recheado (30 g) (Análises efetuadas por CG-EM), p.73
Tabela 16. Ácidos graxos trans analisados (g/100g de gordura) por FT-IR-ATR extrato e FT-
IR-ATR FAME, p.90
Tabela 17. Ácidos graxos trans analisados (g/100g de biscoito) por FT-IR-ATR extrato e FT-
IR-ATR FAME, p.91
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
AG - ácidos graxos
AGE - ácidos graxos essenciais
AGI - ácidos graxos insaturados
AGS - ácidos graxos saturados
AGT- ácidos graxos trans
ANVISA – Agência Nacional da Saúde
AOAC- Association of Official Analytical Chemists
ATR- reflectância total atenuada
BF3 - trifluoreto de boro
CG – cromatografia gasosa
CG-DIC - cromatografia em fase gasosa com detecção de ionização de chama
CG-EM - cromatografia em fase gasosa com espectrometria de massas
CLA – ácido linoleico conjugado
EUA- Estados Unidos da América
FAMES – ésteres metílicos de ácidos graxos ou ácidos graxos metilados
FAO - Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação
FDA- Food and Drug Administration
FT-IR-ATR - espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier e
Reflectância Total Atenuada
HDL – lipoproteína de alta densidade
IE- Impacto de elétrons
IQ-Ionização química
IR - espectroscopia no infravermelho
LDL - lipoproteína de baixa densidade
LOD – Limite de detecção
LOQ- Limite de quantificação
M/Z –Massa/carga
OMS- Organização Mundial da Saúde
OPAS - Organização Pan Americana de Saúde
PCIE- perfil de corrente iônica extraída
PCR- proteína C reativa
POF- Pesquisa de Orçamento Familiar
RDC- Resolução da Diretoria da Colegiada
TIC- perfil de corrente iônica total
TOF- Analisador de massas por tempo de voo
TR - tempo de retenção
EU – União europeia
VET- valor energético total
VLDL- lipoproteína de muito baixa densidade
WHO- Organização Mundial da Saúde
SUMÁRIO
RESUMO, p.6
ABSTRACT, p.7
LISTA DE ILUSTRAÇÕES, p.8
LISTA DE TABELAS, p.10
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS, p.11
1.INTRODUÇÃO, p.15
2. OBJETIVOS, p.18
2.1 OBJETIVO GERAL, p.18
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p.18
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA, p.19
3.1 ÁCIDOS GRAXOS TRANS, p.19
3.1.1 SURGIMENTO DOS ÁCIDOS GRAXOS TRANS, p.20
3.1.2 OCORRÊNCIAS DE ÁCIDOS GRAXOS TRANS EM ALIMENTOS E SUAS
PROPRIEDADES, p.21
3.1.3 METABOLISMO E EFEITOS BIOLÓGICOS DOS ÁCIDOS GRAXOS TRANS, p.25
3.1.4 ESTIMATIVAS DE ÁCIDOS GRAXOS TRANS NOS PAÍSES E ESTRATÉGIA
PARA REDUÇÃO, p.28
3.2 MÉTODOS PARA ANÁLISE DE ÁCIDOS GRAXOS TRANS, p.32
3.2.1 CROMATOGRAFIA GASOSA, p.35
3.2.1.1 MÉTODOS DE EXTRÇÃO DE LIPÍDEOS, p.38
3.2.2 ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO, p.40
3.2.2.1 ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE
FOURRIER E REFLECTÂNCIA TOTAL ATENUADA (FT-IR-ATR), p.42
4 – MATERIAIS E MÉTODOS, p.45
4.1 AMOSTRAS, p.45
4.2 ANÁLISES QUÍMICAS DAS AMOSTRAS DE BISCOITOS RECHEADOS E
GORDURA VEGETAL HIDROGENADA, p.45
4.2.1 DETERMINAÇÃO DE UMIDADE DAS AMOSTRAS DE BISCOITO RECHEADO,
p.45
4.2.2 DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE LIPÍDEOS EM BISCOITO RECHEADO,
p.45
4.3 DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS DO BISCOITO E GORDURA
VEGETAL HIDROGENADA, p.46
4.3.1 HIDRÓLISE DE GLICERÍDEOS E ESTERIFICAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS
PARA ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA GASOSA, p.46
4.3.2 AVALIAÇÃO DA ANÁLISE DE AGT EM BISCOITO RECHEADO E GORDURA
VEGETAL HIDROGENADA POR CG-EM, p.47
4.3.3 AVALIAÇÃO DA ANÁLISE DE AGT EM BISCOITO RECHEADO POR FT-IR-
ATR COM EXTRAÇÃO DA GORDURA, SEM EXTRAÇÃO PRÉVIA DA GORDURA E
APÓS HIDRÓLISE DE GLICERÍDEOS E ESTERIFICAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS, p.48
4.3.3.1 AQUISIÇÃO DOS ESPECTROS, p.48
4.4 QUANTIFICAÇÃO DO ACÍDO GRAXO ELAÍDICO, p.49
4.4.1 QUANTIFICAÇÃO DO ÁCIDO ELAÍDICO POR CG-EM, p.49
4.4.2 QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS TRANS POR FT-IR-ATR, p.49
4.5 ANÁLISE DOS RÓTULOS DAS AMOSTRAS DE BISCOITO RECHEADO, p.50
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA, p.51
5- RESULTADOS E DISCUSSÃO, p.52
5.1 CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS ANALISADAS, p.52
5.2 AVALIAÇÃO DA ANÁLISES DE AGT EM BISCOITO RECHEADO POR CG-EM,
p.53
5.2.1 QUANTIFICAÇÃO DO ÁCIDO GRAXO TRANS ELAÍDICO POR CG- EM, p.72
5.3 AVALIAÇÃO DA ANÁLISES DE AGT EM BISCOITO RECHEADO POR FT-IR-
ATR, p.74
5.3.1 QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS TRANS POR FT-IR- ATR, p.86
5.4 COMPARAÇÃO ENTRE MÉTODOS, p.93
6. CONCLUSÃO, p.96
7. PERSPECTIVAS FUTURAS, p.97
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p.98
9. ANEXOS I, p.110
15
1. INTRODUÇÃO
No Brasil, os alimentos industrializados, como salgadinhos fritos ou assados,
chocolates, bolos, refrigerantes, pizzas, sanduíches e biscoitos estão entre os alimentos mais
consumidos, segundo a Pesquisa de Orçamento Familiar (BRASIL, 2010). Com o aumento do
consumo dos produtos industrializados, sugerem-se fontes potenciais de ácidos graxos trans
(AGT).
Os AGT são considerados substâncias prejudiciais à saúde, na maioria dos casos. São
encontrados naturalmente em pequenas quantidades em alimentos de origem animal, como
leite e carne bovina, devido à biohidrogenação. Estão também presentes nas gorduras vegetais
hidrogenadas industrialmente, a partir da reação de hidrogenação catalítica (GALVÍN et al,
2016).
A hidrogenação dos óleos vegetais causa a saturação de ligações duplas e também a
conversão de ligações duplas da configuração cis inicial para a configuração trans (SMOLIN;
GROSVENOR, 2008). O processamento transforma os óleos, inicialmente líquidos, em
materiais sólidos em temperatura ambiente, de mais fácil manuseio, melhora a qualidade
sensorial (principalmente a palatabilidade e a textura) dos alimentos e aumenta a vida de
prateleira devido à menor probabilidade de oxidação (MENAA et al, 2013).
O tipo de gordura consumida e o seu estado de oxidação influenciam o
desenvolvimento de doenças crônicas vasculares. O uso generalizado de óleos vegetais
parcialmente hidrogenados tem levantado questões sobre os efeitos na saúde decorrentes do
consumo de AGT. Em estudos abordando efeitos do consumo de AGT para doenças crônicas
verificam-se fatores de risco para doenças cardíacas, diabetes mellitus e síndrome metabólica
(ESTADELLA et al, 2013).
Apesar desses indícios, ainda não se estabeleceu a quantidade recomendada para
consumo de AGT que seja segura para a saúde, apenas que o consumo deve ser menor que
1% do valor energético diário, o que representa 2 g/dia, considerando-se uma dieta de 2.000
kilocalorias (BRASIL, 2014).
Verificou-se que biscoitos recheados são aceitos e consumidos por pessoas de todas as
idades (HISSANAGA; PASTORE; PROENÇA, 2012). O consumo de biscoitos por
adolescentes e crianças é elevado, de 3 a 4 vezes por dia, representando o consumo de grandes
quantidades de AGT (SREBERNICH; GONÇALVES; BAGGIO, 2013).
De acordo com a Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO), o ácido
graxo majoritário presente nos biscoitos recheados é o ácido elaídico (C18:1, n9t)
16
representando 91% dos ácidos graxos trans e 3,84% (m/m) no biscoito recheado de chocolate
(NEPA, 2011).
O ácido elaídico está presente nos óleos vegetais parcialmente hidrogenados
produzidos em escala industrial, contribuindo com a maior parte dos AGT presentes na
alimentação (MOZAFFARIAN; ARO; WILLETT, 2009). Portanto, é de grande interesse
para a saúde pública o estabelecimento de métodos analíticos confiáveis, porém de fácil
execução, para o controle dos produtos alimentícios disponíveis para as populações.
Os métodos analíticos utilizados para medir o percentual de AGT em óleos, gorduras e
alimentos envolvem cromatografia em fase gasosa com detecção de ionização de chama (CG-
DIC) ou espectrometria de massas (CG-EM) (TYBURCZY; MOSSOBA; RADER, 2013). O
método CG-DIC é o oficial recomendado pela Association of Official Analytical Chemists
(AOAC) para quantificar ácidos graxos trans (métodos AOAC 996.06 e AOAC 996.01)
(AOAC, 2001; AOAC, 2002).
O método oficial AOAC 2000.10 foi usado para desenvolver e validar espectroscopia
no infravermelho com transformada de Fourier com refletância total atenuada (FT-IR-ATR).
É aplicado a gorduras e óleos com níveis de ácidos graxos trans acima de 5 % e determina a
intensidade de absorção da banda de AGT, sem necessidade de converter em ésteres metílicos
de ácidos graxos (FAME) antes da análise, como é necessário na cromatografia gasosa
(AOAC, 2005).
As análises cromatográficas permitem determinar compostos em quantidades muito
pequenas e, por isso, são consideradas análises de alta sensibilidade. No entanto, estas
técnicas requerem operações de pré-tratamento da amostra como extração prévia das
substâncias de interesse, utilização de vários reagentes, vidrarias e equipamentos, o que as
tornam demoradas e geradoras de resíduos (SINELLI et al, 2010). Antes da injeção no
cromatógrafo, os ácidos graxos devem ser esterificados a ésteres metílicos, aumentando a sua
volatilidade e facilidade de análise, o que requer a utilização de reagentes de toxidez elevada
como, por exemplo o trifluoreto de boro (BF3) (CHO et al, 2011).
Neste contexto, FT-IR-ATR apresenta-se como uma técnica analítica rápida, seletiva,
sensível, de simples operação e baixo custo, além de apresentar elevada velocidade analítica e
de constituir um método não destrutivo e não poluente (MOHD; MOHAMAD; ABDUL,
2017). Esta técnica permite que dados espectrais de infravermelho sejam coletados com
amostras que não foram alteradas em relação ao seu estado original, sem a necessidade de
derivatização (YEBOAH et al, 2017).
17
Existem poucos estudos que comparam método FT-IR-ATR sem pré-tratamento da
amostra (extração), em comparação com FT-IR-ATR com extração e cromatografia gasosa
acoplada a espectrometria de massas (CG-EM).
Portanto, considera-se de importância a avaliação desta técnica para determinação de
AGT em biscoitos recheados industrializados, devido ao elevado consumo por parte de
diversas camadas da população brasileira.
18
2. OBJETIVOS
2.1 –OBJETIVO GERAL
Investigar a viabilidade e aplicabilidade do uso da técnica de FT-IR-ATR, sem
extração, com extração prévia da gordura e após hidrólise e metilação dos ácidos graxos, para
avaliar o conteúdo de ácidos graxos trans em biscoitos recheados e, comparar com os
resultados obtidos na determinação de ácido elaídico por CG-EM.
2.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Quantificar o ácido elaídico (C18:1, n9t) nas amostras de biscoito recheado sabor chocolate
por CG-EM.
- Aplicar a técnica de FT-IR-ATR para análise de AGT nos biscoitos recheados, com e sem
extração prévia da gordura e após a derivatização dos ácidos graxos, comparando os
resultados com os obtidos pela análise de ácido elaídico por CG-EM.
- Comparar os conteúdos de lipídeos totais e AGT dos biscoitos analisados aos valores
apresentados nos respectivos rótulos.
- Avaliar a variabilidade nos conteúdos de AGT nos biscoitos em função dos diferentes
produtos comercializados e fabricantes.
19
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 ÁCIDOS GRAXOS TRANS
Óleos e gorduras são formados pela união de três ácidos graxos (AG) a uma
molécula de glicerol, conhecendo-se essa união com o nome de triglicerídeos ou
triacilgliceróis. Os estados físicos destas substâncias variam de líquido para sólido,
dependendo da natureza dos AG incorporados nos glicerídeos e temperatura
(KHANDELIA et al, 2010).
Gorduras sólidas contém alta proporção de ácidos graxos saturados (AGS) de cadeia
longa. Já os produtos líquidos, como óleos comestíveis, contêm grande proporção de ácidos
graxos insaturados (AGI) (ESTADELLA et al, 2013).
Apenas 20 AG são encontrados na natureza. Destes, os ácidos palmítico, oleico,
linoleico e linolênico compõem aproximadamente 80% dos óleos e gorduras (GUNSTONE;
HARWOOD; DIJKSTRA, 2007).
Em produtos de origem vegetal, o AG mais comum é o ácido oleico (C18:1, n9 cis). Já
o seu isômero, o ácido elaídico (C18:1, n9 trans), é formado no processo de hidrogenação
catalítica dos óleos vegetais (KEEFE, 2008). Este representa o maior AGT presente na
alimentação (MOZAFFARIAN; ARO; WILLETT, 2009).
A configuração natural das ligações duplas em AGI é a configuração cis, porém a
configuração trans acarreta numa cadeia carbônica mais linear em relação à configuração cis,
tornando a molécula mais rígida e termodinamicamente mais estável (DAMODARAN;
PARKIN; FENNEMA, 2010).
Segundo o Comitê do Codex Alimentarius, AGT são definidos como todos os
isômeros geométricos de ácidos graxos mono-insaturados e ácidos graxos poli-insaturados
contendo dupla ligação carbono-carbono na configuração trans, não conjugado e interrompido
por, pelo menos, um grupo metileno (WHO, 2007a). Ácidos graxos conjugados com uma
ligação dupla trans, incluindo o ácido linoleico conjugado (CLA), estão excluídos desta
definição de gorduras trans (MOSSOBA et al, 2007).
A figura 1, abaixo, apresenta as fórmulas estruturais do ácido oleico e do seu isômero
trans, o ácido elaídico. Na forma cis, os átomos de hidrogênio estão no mesmo lado da
ligação dupla. Na forma trans, estão em lados opostos. O ácido graxo cis tem uma curvatura
na cadeia de carbono, ao passo que o ácido graxo trans tem um cadeia de carbono linear
semelhante à de um ácido graxo saturado (HUNTER, 2005).
20
Monoinsaturado cis (ácido oleico)
Monoinsaturado trans (ácido elaídico)
Figura 1. Fórmulas estruturais de um ácido graxo cis (ácido oleico) e seu isômero trans (ácido
elaídico) (HUNTER, 2005).
A conformação linear é o estado de menor energia e permite um melhor
empacotamento das moléculas, ficando mais próximas umas das outras e aumentando a
interação entre elas. Como consequência do aumento das forças intermoleculares, os AGS e
AGT possuem ponto de fusão maior que AGI. Os AGT são termodinamicamente mais
estáveis, sendo menos reativos e apresentam maior resistência aos processos do que a forma
cis correspondente (CURI et al, 2008).
3.1.1 SURGIMENTO DOS ÁCIDOS GRAXOS TRANS
Os químicos franceses Sabatier e Senderens descobriram, em 1887, que a diferença na
consistência entre óleos vegetais e manteiga e, entre gordura bovina e banha de porco era
devido à quantidade de átomos de hidrogênio presentes (MARTIN et al, 2007). Baseados nos
trabalhos de Sabatier na hidrogenação catalisada por metal em componentes orgânicos
insaturados, o químico Normann desenvolveu, em 1903, o método para hidrogenação de óleos
vegetais. Quimicamente, a hidrogenação de óleos é a redução das duplas ligações de ácidos
graxos insaturados para ligações simples saturadas, pela reação do gás hidrogênio na presença
de um metal catalisador. O metal usado na época era o níquel e permanece sendo utilizado nos
procedimentos de hidrogenação atuais (TARRAGO-TRANI et al, 2006).
O processo de hidrogenação foi aplicado na Inglaterra, ainda em 1903 (MARTIN et al,
2007). As gorduras vegetais hidrogenadas foram introduzidas nos produtos alimentícios dos
Estados Unidos da América (EUA) em 1911, quando uma empresa americana (Procter and
Gamble) lançou o Crisco, uma gordura hidrogenada feita de óleo de algodão parcialmente
21
hidrogenada, por interesse dos EUA em dar vazão à grande produção deste óleo (CURI et al,
2008). A demanda desses produtos para o consumo se intensificou durante tempos de guerra,
em virtude do baixo custo e da maior estabilidade oxidativa que confere aos alimentos um
maior período de validade (OKIE, 2007).
A indústria de hidrogenação teve um crescimento relevante resultante do consumo de
margarinas e gorduras hidrogenadas durante a Segunda Guerra Mundial. No final da década
de 1950, pesquisadores do Northen Regional Reserch Center descobriram que o ácido α-
linolênico estava relacionado à formação de odores desagradáveis quando os alimentos eram
feitos em óleo de soja. Foi proposto o desenvolvimento da hidrogenação seletiva como uma
alternativa para reduzir a quantidade desses AG no óleo de soja. Esta estratégia levou a uma
hidrogenação mais leve, processo para reduzir a quantidade de ácido α-linolênico para 3 % do
total de AG no óleo (MARTIN et al, 2007).
No Brasil, a indústria de hidrogenação surgiu por volta de 1950, inicialmente
produzindo gordura hidrogenada e margarina dura. De 1970 em diante, começou a produção
de margarina cremosa pela mistura de gordura hidrogenada com diferentes pontos de fusão. A
melhora no processo de hidrogenação pelo desenvolvimento da hidrogenação seletiva
possibilitou a produção de gordura cada vez mais específica e, o aumento de seu uso na
produção de alimentos, o que resultou na substituição quase total das gorduras animais na
dieta da população brasileira (ibid).
O processo de hidrogenação parcial de ácidos graxos poli-insaturados é o responsável
pela geração de maior parte dos AGT consumidos atualmente. O uso da gordura parcialmente
hidrogenada acelerou a partir da década de 1960, em resposta às recomendações contra o
consumo de gordura animal rica em gordura saturada e colesterol, devido a efeitos deletérios
sobre o perfil lipídico e o risco de aterosclerose (GAGLIARDI; MANCINI FILHO;
SANTOS, 2009).
3.1.2 OCORRÊNCIAS DE ÁCIDOS GRAXOS TRANS EM ALIMENTOS E SUAS
PROPRIEDADES
Os AGT podem ser produzidos industrialmente ou ocorrem naturalmente.
Industrialmente, eles são formados durante a hidrogenação parcial de óleos vegetais
(GALVÍN et al, 2016).
O processo de hidrogenação parcial concede aos óleos vegetais algumas propriedades
físicas das gorduras saturadas, como consistência mais firme, maior ponto de fusão e estado
físico semi-sólido em temperatura ambiente. A indústria usa para conferir maior plasticidade
22
aos alimentos, pelo aumento de solidez, maleabilidade e, para aumentar a estabilidade
oxidativa destes óleos, melhorando a resistência quanto à deterioração do sabor e aroma de
óleos e gorduras durante a fritura e, prolongando a vida útil dos alimentos (MARTIN;
MATSHUSHITA; SOUZA, 2004).
O processo de hidrogenação é controlado pelo ajuste de parâmetros da reação como a
temperatura, pressão de hidrogênio gasoso, tempo da reação, tipo e concentração do
catalisador empregado, que podem modular a produção de dupla ligação trans, para que se
obtenha um produto final de composição e propriedades funcionais desejadas (MARTIN et al,
2007).
A hidrogenação pode ser classificada como parcial ou total e seletiva ou não seletiva.
A seletividade refere-se à hidrogenação preferencial dos AG mais insaturados, que resulta na
menor formação possível de AGS (DIJKSTRA, 2012).
Na hidrogenação, a disponibilidade de hidrogênio no catalisador é um parâmetro
crucial no processo de isomerização cis/trans. Com o aumento da temperatura, diminui a
solubilidade do hidrogênio no óleo e aumenta a taxa da reação. Assim, a quantidade de
hidrogênio na superfície do catalisador é reduzida, resultando numa seletividade e formação
de isômeros trans elevada. Do mesmo modo, existe maior formação de AGT quando a
hidrogenação é realizada sob pressões baixas, com pouca agitação e com uma quantidade
menor de catalisadores (HASTENPFLUG; WOMMER, 2012).
Os AGT também podem estar presentes naturalmente na carne e leite de animais
ruminantes e são originados pela biohidrogenação no rúmen desses animais. Sua ingestão é
determinada principalmente pelo consumo de lacticínios ricos em gordura (GANGULY;
PIERCE, 2015).
Em animais ruminantes, os AGT são produzidos como intermediários durante a
biohidrogenação de ácidos graxos poli-insaturados provenientes de capins e plantas ingeridos
pelos animais, por bactérias (Butyrivibrio Fibrisolvens e Megasphaera Esdenii) anaeróbicas
no rúmen. A dessaturação bacteriana produz duplas ligações trans em toda a molécula de AG,
mas com preferência pela dupla ligação na posição 11 dos AG de 18 carbonos, como o ácido
vacênico (C18:1, n11t) que é o principal isômero presente na gordura de ruminantes
(HASTENPFLUG; WOMMER, 2012).
O ácido oleico também pode ser convertido em ácido esteárico pela biohidrogenação.
O isômero C18:2, 9c, 11t, chamado de rumênico também pode ser formado pelo ácido
vacênico por ação da enzima delta 9 dessaturase. Este isômero e o C18:2, 10t, 12c são os
CLA e, parecem ter efeitos distintos dos outros AGT no organismo humano (MARTIN et al,
23
2007). Esse isômero natural, diferente dos produtos hidrogenados, vem sendo associado a
benefícios para a saúde, como, por exemplo, a melhora no metabolismo plasmático de
lipoproteínas (HOLANDA; HOLANDA; MENDONÇA JUNIOR, 2011).
Estima-se que de 2% a 8% dos AGT da dieta sejam provenientes dessa fonte,
dependendo do percentual individual de consumo desses alimentos, já cerca de 90% dos AGT
da dieta são provenientes de óleos vegetais poli-insaturados que passaram pelo processo
industrial de hidrogenação (HISSANAGA; PASTORE; PROENÇA, 2012).
Os AGT também podem ser formados, em quantidades menores, por mecanismo
induzido termicamente em operações de frituras e durante o processo industrial de refino.
Durante a fritura, o óleo deteriora-se por processos de oxidação e hidrogenação, resultando
em aumento de gordura trans (GUALLAR-CASTILLON et al, 2012).
Durante o processo de refino, especialmente durante a etapa de desodorização, que
tem a função de remover compostos oriundos da oxidação, que dão aroma ruim ao óleo, é
necessária alta temperatura (180 °C e 270 °C). Esta condição pode modificar as duplas
ligações cis ocorridas naturalmente nestes óleos em dupla ligação trans (CRUZ et al, 2013).
Gorduras utilizadas em frituras também são fontes de AGT na dieta. A formação de
AGT durante a fritura de alimentos, assim como no refino dos óleos e processo de
hidrogenação, ocorre por mecanismo induzido termicamente e está relacionada à temperatura
do processo e ao tempo de uso do óleo. Há controvérsias se alimentos fritos podem ser
considerados uma fonte de AGT, já que estes AG seriam constituintes em quantidades
irrelevantes nestes alimentos. Mas a reutilização de óleos refinados no preparo dos alimentos
fritos pode tornar significativa a formação de isômeros trans, contribuindo na ingestão diária
de AGT. Durante o processo de fritura, a gordura ou óleo utilizado é absorvido pelo alimento
representando cerca de 30% do conteúdo lipídico destes. Quando a gordura vegetal
parcialmente hidrogenada é usada na fritura, a formação de AGT é geralmente menor, mas o
elevado conteúdo inicial desse AG resulta em uma concentração maior de isômeros trans nos
alimentos (URIARTE; GUILLÉN, 2010).
O ácido graxo majoritário presente nos biscoitos recheados é o ácido elaídico (C18:1,
n9t) apresentando entre 3,84% (m/m) (recheado de chocolate) e 4,21% (m/m) (recheado de
morango) e representando 91% e 93% dos ácidos graxos trans respectivamente, de acordo
com a Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO) (NEPA, 2011). Este AGT e o
isômero C18:1, n10t são os mais comuns presentes na gordura vegetal parcialmente
hidrogenada (GAYET-BOYER et al, 2014).
24
Margarinas, cremes vegetais, biscoitos, produtos de panificação e confeitaria, massas,
sorvetes, bolos e salgadinhos chips contribuem com cerca de 80 a 90% dos AGT provenientes
da alimentação (SZWARCWALD et al, 2014).
Os fabricantes de óleos e gorduras têm sido incentivados a desenvolver alternativas
tecnológicas aos produtos com AGT, com características funcionais semelhantes. No entanto,
estudos em diversos países demonstraram que, mesmo com as alternativas já disponíveis, os
AGT ainda estão presentes na composição de inúmeros alimentos (ROE et al, 2013).
O desafio para as indústrias de alimentos tem sido desenvolver estratégias para a
redução dos AGT nos alimentos com a mesma aplicabilidade industrial, mantendo as
características estruturais e sensoriais dos produtos sem o aumento de custos (MENAA et al,
2013).
Contudo, a opção mais comum é a substituição direta por gorduras saturadas, sejam
naturais (frações dos óleos de palma, de coco ou palmiste) ou por industriais (hidrogenação
total). No entanto, qualquer um dos casos não representa um grande avanço do ponto de vista
da saúde dos consumidores, dados os problemas já conhecidos deste tipo de gordura,
frequentemente associado ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DHAKA et al,
2011).
De acordo com Eckel et al (2007), o mercado de matérias primas (como óleo de coco,
de palma, palmiste) tem sido capaz de absorver as mudanças na demanda desses materiais. E
o custo com os processos de interesterificação e fracionamento não são maiores que o de
hidrogenação tradicional.
Estudo realizado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), em 2016,
identificou as dificuldades no uso de gorduras naturalmente mais sólidas e semi-sólidas (óleos
de palma, palmiste), como cristalização lenta, fácil derretimento, possível separação de fases,
infraestrutura e logística limitada. Além do Brasil não ser autossuficiente na produção destes
óleos e aumentar o consumo de gordura saturada. Quanto ao processo de interestificação
(enzimático ou químico) foi observado aumento no custo da produção de 5 - 15 %. Além da
necessidade de investimento em equipamentos para aplicação da tecnologia, aumento de
gorduras saturadas, falta de flexibilidade para elaborar gorduras adequadas para todas as
aplicações em virtude dos perfis limitados de cristalização e derretimento que se obtém com
essa tecnologia (BRASIL, 2016).
Embora o óleo de palma esteja sendo utilizado em substituição à gordura vegetal
hidrogenada, deve-se ter cautela com o consumo desse óleo. O estudo de Galdino e
colaboradores (2010) relata que a fração lipídica LDL-colesterol teve um aumento moderado
25
em jovens saudáveis do sexo masculino submetidos a uma dieta enriquecida com este óleo.
Isso pode ser explicado pelo fato do óleo de palma ser rico em gordura saturada, o que
promove efeito mais intenso sobre a colesterolemia (SPOSITO et al, 2007).
A manipulação da composição de AG de sementes de óleos comestíveis pode ser
realizada utilizando técnicas de melhoramento genético tradicional e de engenharia genética.
Essas ferramentas possibilitam, por exemplo, produção de semente de soja modificada com
menor quantidade de ácido linolênico e maior quantidade de oleico, o que gera maior
estabilidade à oxidação (SKEAFF, 2009).
O processo de interesterificação modifica as propriedades físicas da gordura pela
alteração do ponto de fusão e, em alguns casos pela modificação do comportamento de
cristalização, produzindo gorduras com baixas concentrações de AGT. O processo envolve o
rearranjo dos AG na estrutura do glicerol do triacilglicerol na presença de um catalisador
químico ou de uma enzima. Logo, o processo de interesterificação pode ser químico ou
enzimático. Ambos modificam o ponto de fusão e o comportamento de cristalização da
gordura, mantendo as propriedades físicas, sabor e estabilidade. Usualmente, o processo é
realizado pela mistura de gorduras ricas em AGS com óleos líquidos comestíveis para
produzir gordura com características intermediárias. As limitações deste processo incluem
maior tempo de reação, maior sensibilidade às condições de reação e maior custo (MENAA et
al, 2013).
3.1.3 METABOLISMO E EFEITOS BIOLÓGICOS DOS ÁCIDOS GRAXOS TRANS
Os AGT provenientes da alimentação são absorvidos e transportados até as células,
onde são utilizados como fonte de energia ou depositados nos tecidos para utilização futura
(VAZ et al, 2006).
Nos tecidos humanos, a absorção, o transporte, a incorporação e excreção dos AGT
ocorrem de forma similar a outros AG dietéticos (IOM, 2002). No entanto, o grau de
incorporação de isômero cis e trans difere no mesmo tecido ou em tecidos diferentes.
Estudos investigativos sobre a incorporação de AGT em tecidos de ratos concluíram
que os teores AGT adicionados às dietas foram suficientemente incorporados e
metabolizados, alterando o perfil de AG em tecidos desses animais (SABARENSE;
MANCINI FILHO, 2003).
A incorporação de AGT aos tecidos pode ser influenciada pelos níveis de ingestão
diária de ácidos graxos essenciais (AGE). Os AGT interagem de forma competitiva no
26
metabolismo dos AGE, inibindo sua incorporação aos fosfolipídeos de membrana e reduzindo
sua conversão a eicosanoides nas células. Ingestões inadequadas dos AGE permitem maior
incorporação dos isômeros trans. A incorporação dos AGT aos fosfolipídeos de membrana
pode influenciar as propriedades físicas da membrana, assim como atividade enzimática
associada a esta (ESTADELLA et al, 2013).
Devido aos efeitos sobre o metabolismo dos AG ɣ-linolênico e araquidônico, os AGT
também podem afetar o metabolismo das prostaglandinas e de outros eicosanoides. AGT inibe
a ciclo-oxigenase (COX-2), uma enzima que converte o ácido araquidônico a um eicosanoide
que é necessário para prevenir coágulos sanguíneos nas artérias e veias. O risco de enfarte
agudo do miocárdio, acidente vascular cerebral e trombose é aumentado (CHEN et al, 2015).
Foi observada associação positiva entre a ingestão de AGT e concentrações de
marcadores inflamatórios (interleucina 6, TNF α, receptores de TNF e de proteínas
quimiotrativa de monócito1). Ingestão de dieta com 8 % de energia proveniente de AGT em
comparação ao mesmo teor de ácido oleico, durante 5 semanas, aumentou o nível plasmático
de interleucina 6 e proteína C reativa (PCR) (BHARDWAJ; PASSI; MISRA, 2011).
Desordens cardiovasculares e metabólicas são comumente associadas à inflamação
sistêmica ou localizada e os AGT têm sido relacionados a eventos pró-inflamatórios em
diversos estudos, podendo agir em qualquer processo inflamatório, como por exemplo,
intestinal (OKADA et al, 2013).
A inflamação é um fator de risco para aterosclerose, morte súbita, diabetes e, portanto,
os efeitos inflamatórios dos AGT podem explicar, em parte, seus efeitos sobre a saúde
cardiovascular. Vários estudos sugerem que os AGT podem causar disfunção endotelial. Esta
apresenta papel no desenvolvimento e progressão da aterosclerose e outras doenças
cardiovasculares (REMING et al, 2010).
Em estudo realizado por Monge-Rojas e colaboradores (2017), em mulheres, foi
observada uma relação direta do consumo de AGT com PCR que é um marcador de
inflamação sistêmica.
Apesar de ainda não se conhecerem os mecanismos por meio dos quais os AGT
interferem na sensibilidade à insulina (apenas que interferem de forma única com o fígado,
músculo e tecido adiposo), sabe-se que uma alimentação rica em AGT de origem industrial
aumenta ainda mais a resistência à insulina, particularmente em indivíduos predispostos como
aqueles com adiposidade visceral aumentada, com resistência pré-existente à insulina ou
sedentários (DHAKA et al, 2011).
27
Os AGT são conhecidos por ter efeito indesejável sobre os perfis lipídicos séricos, e,
assim, estão associados ao aumento de doenças cardiovasculares. Quando absorvidos pelo
organismo humano, os AGT inibem a atividade da dessaturase D6, que converte o ácido
linoleico em ácidos graxos poli-insaturados (EBBESSON et al, 2012). Estes elevam a ação
das enzimas responsáveis pela transferência de ésteres de colesterol de moléculas do
lipoproteína de alta densidade (HDL) para lipoproteína de baixa densidade (LDL) e para
lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL). Dessa forma causam mudança do perfil
lipídico, devido ao acúmulo de LDL e VLDL no plasma, aumentando, assim, o risco de
desenvolver doenças crônicas vasculares (SHAO; FORD, 2014).
A relação entre a ingestão de AGT e cânceres tem sido estudada extensivamente (LIU
et al, 2007). Stender et al (2012) investigaram a associação entre AGT no tecido adiposo e
incidência de câncer de mama, próstata, cólon e demonstraram associação positiva entre AGT
e câncer de mama e cólon, mas não de próstata. Supõe-se que os AGT podem aumentar o
risco de desenvolver câncer através da alteração da resposta imune, da integridade da parede
celular e da síntese de prostaglandina (GEBAUER et al, 2011).
AGT provenientes da dieta da gestante são transferidos para o feto por via placentária
e também podem ser transferidos para a criança durante a amamentação, sendo incorporados
ao leite materno. Estas evidências decorrem do fato de serem encontrados os mesmos níveis
de AGT no sangue tanto das mães como dos recém-nascidos (DHAKA et al, 2011).
O consumo de AGT na gestação e na lactação pode modificar tanto o perfil lipídico
plasmático quanto alterar a expressão de adipocinas envolvidas com a resistência insulínica e
doença cardiovascular dos descendentes. O estudo ainda salienta que esses efeitos deletérios
estariam presentes mesmo após a retirada do fator causal (PISANI et al, 2008). A associação
entre um elevado consumo de AGT e o risco de pré-eclâmpsia foi também verificado. Neste
estudo, as mulheres que desenvolveram pré-eclâmpsia tinham uma quantidade maior de AGT
(cerca de 30% superior) nos glóbulos vermelhos que as mulheres que não desenvolveram esta
disfunção (DHAKA et al, 2011).
Outros estudos apontam relação positiva entre o consumo de AGT e outros malefícios
para a saúde, podendo ser citados: infertilidade feminina e masculina, depressão, obesidade,
doenças alérgicas (como asma, rinite, eczema) (THOMPSON; MINIHANE; WILLIAMS,
2011).
Ao nível neurológico, um consumo prolongado de gordura hidrogenada permite a
incorporação de AGT nas membranas neuronais, facilitando o desenvolvimento de processos
28
oxidativos e perturbações do movimento, estando assim associado às doenças degenerativas
(BANARD; BUNNER; AGARWA, 2014).
Os experimentos de Grimm et al (2016), in vitro, mostraram que AGT, em
comparação a conformação cis, aumentaram a produção, oligomerização e agregação de
peptídeos β-amilóide, principais componentes das placas senis, as quais são características da
doença de Alzheimer.
Quanto ao AGT de ruminantes, as evidências ainda são inconclusivas, no entanto,
estudos indicam que ácido vacênico (percursor do ácido rumênico (C18: 2, n9c, 11t), um
CLA, teria efeitos metabólicos positivos sobre a saúde humana (KALLAS; REALINI; GIL,
2014). Estudos em animais demonstraram que o consumo de CLA inibe a iniciação da
carcinogênese, reduz o teor de gordura corporal e aumenta a massa muscular, diminui a
aterosclerose, melhora a hiperinsulinemia, reforça o sistema imunitário e altera a razão
LDL/HDL (SERAFEIMIDOU; ZLATANOS; LASKARIDIS, 2012).
3.1.4 ESTIMATIVAS DE CONSUMO DE ÁCIDOS GRAXOS TRANS NOS PAÍSES E
ESTRATÉGIA PARA REDUÇÃO
Apesar de todas as evidências de que uma alimentação inadequada propicia o
desenvolvimento de vários tipos de doenças, muitas vezes desencadeadas na infância, cada
vez mais observa-se que as crianças consomem, em grande quantidade, alimentos contendo
excesso de gorduras e açúcar como balas, salgadinhos, fast food e biscoitos recheados
(SZWARCWALD et al, 2014).
Elevado consumo de biscoitos recheados também são observados pelos adolescentes,
estes chegam a comer 3 a 4 vezes por dia, representando o consumo de grandes quantidades
de AGT. Observa-se que os biscoitos recheados, entre outros alimentos industrializados, são
aceitos e consumidos por pessoas de todas as idades (SREBERNICH; GONÇALVES;
BAGGIO, 2013).
O Brasil é o quarto maior produtor mundial de biscoitos, com 1,2 milhão de t/ano em
2015, sendo superado apenas pela China (3,4 milhão de t/ano), Estados Unidos (2,3 milhão de
t/ano) e Índia (1,9 milhão de t/ano). O consumo per capita em 2015 foi de 6,0 kg/ano, dessa
forma ocupando a quinta posição global. No cenário nacional é um mercado que gerou mais
de 21 bilhões de reais no ano de 2015, representando assim um aumento de mais de 48% em
relação ao ano de 2011 no qual gerou pouco mais de 14 bilhões, demonstrando o crescimento
deste produto ao longo dos anos (ABIMAPI, 2016).
29
A Organização Mundial da Saúde (OMS) preconizava o controle no consumo de
alimentos com AGT desde 1995, mas não determinava o valor quantitativo desse consumo.
Em 2002, uma consulta promovida pela OMS para atualizar as recomendações sobre
alimentação, nutrição e prevenção de doenças crônicas reiterou que as dietas deveriam
fornecer no máximo 1% de gordura trans do total calórico diário (WHO, 2004).
A Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 359 de 23 de dezembro de 2003 da
ANVISA tornou obrigatória à declaração do teor de gordura trans relativa à porção do
produto. E, segundo a RDC nº 360 de 23 de dezembro de 2003, pode ser considerado e
divulgado como “não contém trans” todo alimento industrializado que apresentar teor de
gordura trans menor ou igual a 0,2 g/porção. Para gordura total, o teor é considerado não
significante, ou zero, quando menor ou igual a 0,5 g/porção do alimento (BRASIL, 2003a;
BRASIL, 2003b).
É admitida uma tolerância de + 20% com relação aos valores de nutrientes declarados
no rótulo. Essa tolerância é ainda um ponto que merece discussão e maior clareza na
definição, considerando principalmente os teores dos nutrientes (PIMENTEL; ZENEBON,
2009).
Em 12 de novembro de 2012, foi publicada uma nova resolução, a RDC nº 54, pela
qual somente é permitido que alimentos com teor de ácidos graxos trans menor do que 0,1
g/porção e com baixo teor de gorduras saturadas (máximo de 1,5 g da soma de gorduras
saturadas e trans) possam conter a alegação de “zero trans”. As empresas abrangidas por esta
Resolução tiveram o prazo até 1º de janeiro de 2014 para promover as adequações necessárias
nos produtos em atendimento a este regulamento técnico (BRASIL, 2012).
Ressalte-se, ainda que, “porção” é definida como “a quantidade média do alimento que
deveria ser consumida por pessoas sadias, maiores de 36 meses, em cada ocasião de consumo,
com a finalidade de promover uma alimentação saudável”, sugerindo que um consumo
superior a essa porção definida pode não ser nutricionalmente seguro (BRASIL, 2003b).
Em 2004, a OMS lançou a Estratégia Global para Promoção da Alimentação Saudável,
Atividade Física e Saúde com a meta de eliminação do consumo de gordura trans industrial
(WHO, 2004).
No Brasil, o Guia Alimentar para População Brasileira, restringe o consumo de
gordura trans a 1% do valor energético diário, o que corresponde a aproximadamente 2 g/dia
em uma dieta de 2.000 calorias (BRASIL, 2014).
Em 2007, após uma atualização científica sobre AGT, com a participação de peritos
científicos e representantes da Organização das Nações Unidas para Agricultura e
30
Alimentação (FAO), a OMS recomendou a revisão do limite tolerável de ingestão da gordura
trans, que era de até 1% do consumo energético diário e que atualmente continua em vigor em
muitos países, entre eles o Brasil (UAUY et al, 2009).
O Codex Alimentarius propõe que a informação nutricional seja apresentada por
porção ou por embalagem completa, no entanto, também recomenda que a medida para
quantificar nutrientes seja notificada por 100 g, para facilitar comparações entre os produtos.
Assim, permite que o consumidor saiba mais facilmente que o produto alimentício contém
AGT, sem precisar consultar a lista de ingredientes (WHO, 2007a).
Essa recomendação parece ser interessante para a declaração do conteúdo de AGT, já
que se o consumo for superior à quantidade da porção, pode ocorrer uma ingestão
considerável desses compostos. Por exemplo, sendo uma porção de biscoito equivalente a 2,5
unidades (30 g), se uma pessoa ingerir uma quantidade maior do que 2,5 unidades do biscoito,
elevará o consumo de ácidos graxos trans, podendo, eventualmente, alcançar o limite
destacado pelo Guia Alimentar para a População Brasileira, que é de 2 gramas/dia (BRASIL,
2014; MOSSOBA et al, 2007).
Principais indústrias alimentícias apoiaram medidas para eliminar as gorduras trans de
seus produtos, segundo o Relatório “Américas livres de gordura trans” da Organização Pan
Americana de Saúde (OPAS/OMS). Nas recomendações da OPAS/OMS, foi estabelecido o
limite de 5% de presença de AGT sobre o total de gorduras em alimentos processados e limite
de 2% de AGT em óleo vegetal e margarinas (WHO, 2007b).
Em março de 2010, foi publicada a proposta inicial do Projeto Latino-Americano de
Alinhamento dos Valores de Referência para Rotulagem Nutricional (LAVRON), visando
harmonizar os valores de referência para rotulagem entre os países latino-americanos. Essa
iniciativa de padronização é importante, tanto para comercialização de produtos entre os
países quanto para facilitar o entendimento do consumidor (PROENÇA; SILVEIRALL,
2012).
Considerando os efeitos adversos à saúde associado à ingestão de AGT, vários países
tem se esforçado para redução. Para isso, governos adotaram ou estão considerando adotar
ações de regulamentação, com legislação para eliminar o uso de AGT produzidos
industrialmente (ibid).
No Brasil, desde 2007, passou a ser declarado o conteúdo de AGT de seus produtos
alimentícios pré-embalados. No México e na Costa Rica, desde 2010, as empresas
alimentícias passaram a declarar o conteúdo de AGT (COLON-RAMOS; MONGE-ROJAS;
CAMPOS, 2014). No final do ano 2014, a Argentina obteve resultados efetivos na redução de
31
AGT, seguindo os parâmetros recomendados pela OPAS/OMS (RUBINSTEIN;
ELORRIAGA; GARAY, 2015).
Os níveis de AGT foram significativamente reduzidos, no período de 2015 -2016, nos
países da América Latina, no entanto, com aumento, pelas indústrias do conteúdo de ácido
palmítico (C16: 0) e ácido oleico (C18: 1, n9 cis) (MONGE-ROJAS et al, 2017).
No Brasil, a oferta de novas alternativas tecnológicas, como a interesterificação,
contribuiu para a redução do teor de AGT em margarina e biscoitos recheados de chocolate
durante o período 2015-2016. Na Argentina, a notável redução do AGT, no período 2015-
2016, coincide com um aumento no uso de óleos de espécies de plantas modificadas (como
óleo de girassol com alta concentração de ácido oleico) (MARTIN et al, 2016).
Em junho de 2015, nos EUA, a Food and Drug Administration (FDA) declarou que os
óleos parcialmente hidrogenados, que são a principal fonte de AGT fabricados, não são mais
"geralmente reconhecidos como seguros". E, estabeleceu um período de conformidade de três
anos para limitar a quantidade ingerida. Isso levará as empresas a formular produtos sem
óleos parcialmente hidrogenados (MOHD; MOHAMAD; ABDUL, 2017).
A Organização Mundial da Saúde (WHO), no seu plano de ação nos alimentos e
nutrição na União Europeia (UE), no período de 2012-2016, pretendia reduzir as doenças não
transmissíveis relacionadas com a alimentação, incluindo uma intervenção prioritária na
eliminação de AGT. Foi observado resultados eficientes na redução de AGT (WHO, 2015).
O Parlamento Europeu determinou que, até dezembro de 2014, os dados sobre a
presença de gorduras trans na alimentação geral da população da UE deveria ser conhecida, a
fim de implementar medidas adequadas para a sua redução. Simultaneamente, o Plano de
Ação Europeu de Alimentação e Nutrição 2015-2020, concentrou-se numa redução de
doenças relacionadas com a alimentação, incluindo uma intervenção prioritária na eliminação
de gordura trans, que deve ser limitada a < 1% do consumo diário de energia, incluindo os de
origem natural (COSTA, 2016).
Alguns países optaram pela restrição total das gorduras com AGT na sua composição,
outros pela declaração obrigatória do seu teor na rotulagem nutricional, enquanto outros
apenas emitiram recomendações para a sua redução direcionadas às indústrias. Os resultados
observados têm sido muito diferentes, mas somente nos países com total restrição se verificou
uma redução generalizada do consumo de AGT pela população (STENDER; ASTRUP;
DYERBERG, 2012).
A Dinamarca, em 2003, foi primeiro país a introduzir leis que regulam rigorosamente
a venda de alimentos contendo AGT, limitando o conteúdo de AGT a 2 % da gordura total de
32
alimentos, sendo exemplo de sucesso. A Áustria e a Suíça, em 2009, apresentaram uma
proibição semelhante à proibição da Dinamarca, seguida da Islândia em 2011, Hungria e
Noruega em 2014 e Letônia a partir de 2016 (STEEN; ARNE; DYERBERG, 2016). Os
Estados Unidos restringiu o uso do AGT, desde 2007, em restaurantes, o que reduziu
significativamente o seu uso nas grandes cadeias de restaurantes (ANGELL; COBB;
CURTIS, 2012).
No Brasil, não existe registro da ingestão de AGT de abrangência nacional. Em estudo
de Martin et al (2007) foi observado que, nas últimas três décadas, houve aumento
significativo no consumo de alimentos industrializados e análises de produtos brasileiros
indicam a presença de AGT.
O consumo de ácidos graxos trans pela população cresceu paralelamente ao aumento
do seu uso pelas indústrias de alimentos. No Brasil, ainda não foi identificado estudo que
estime o seu consumo, entretanto, dados da Pesquisa de Orçamento Familiar (POF) dos anos
de 2008 e 2009 demonstraram que, entre os anos de 2002-2003 e 2008-2009, o consumo de
produtos industrializados, fontes potenciais de ácidos graxos trans, como biscoitos aumentou
de 3,1% para 3,4%. Alimentos industrializados, como salgadinhos fritos ou assados,
chocolates, bolos, refrigerantes, pizzas, sanduíches e biscoitos estão entre os alimentos mais
consumidos, podendo sugerir aumento de produtos industrializados, fontes potenciais de AGT
(BRASIL, 2010).
3.2 MÉTODOS PARA ANÁLISE DE ÁCIDOS GRAXOS TRANS
A existência de poucas tabelas de composição de alimentos incluindo os valores de
AGT tem sido fator limitante para estimar a ingestão desses componentes em estudos
dietéticos no Brasil. Estudos analisaram que o relato da composição de alguns produtos
brasileiros nos rótulos muitas vezes não coincide com os teores encontrados nas análises,
destacando os teores elevados de AGT em amostras de biscoitos, sorvetes e batata fritas
(BLOCK; HERRERA, 2014). Enquanto a análise da composição dos produtos alimentares
não for obrigatória, serão sempre observados dados discrepantes com o real.
Diante da problemática relacionada aos efeitos à saúde causada pelo consumo de AGT
e as dificuldades para estimativa dessa ingestão, verifica-se a necessidade de análise
quantitativa do conteúdo de AGT em alimentos, incluindo os biscoitos recheados, visto serem
alimentos de grande consumo. Estas análises auxiliarão na avaliação mais precisa da ingestão
destes componentes (SREBERNICH; GONÇALVES; BAGGIO, 2013).
33
Os métodos analíticos utilizados para medir o percentual de AGT em óleos, gorduras e
alimentos envolvem cromatografia em fase gasosa com detecção de ionização de chama (CG-
DIC) ou espectrometria de massas (CG-EM) (TYBURCZY; MOSSOBA; RADER, 2013). O
método CG-DIC é o oficial recomendado pela Association of Official Analytical Chemists
(AOAC) para quantificar AGT (métodos AOAC 996.06 e AOAC 996.01) (AOAC, 2001;
AOAC, 2002).
Método oficial AOAC 2000.10 foi usado para desenvolver e validar FT-IR- ATR. É
aplicado a gorduras e óleos com níveis de ácidos graxos trans acima de 5 % sobre o total de
gordura e determina a intensidade de absorção da banda de AGT sem necessidade de
converter em FAME antes da análise, como é necessário na cromatografia gasosa (AOAC,
2005).
A FDA aprova a cromatografia gasosa e espectroscopia no infravermelho como
métodos de mensuração da composição de AG para a declaração do conteúdo de AGT nos
rótulos dos alimentos (ECKEL et al, 2007).
A FDA considera cromatografia em fase gasosa com detecção de ionização de chama
(CG-DIC) método adequado. Neste método, os triacilglicerois são extraídos dos alimentos e
ocorre a hidrólise dos triacilglicerois, formando glicerol e ácidos graxos. Em seguida, os
ácidos graxos sofrem metilação para ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME) utilizando
trifluoreto de boro (BF₃) em metanol. Os FAME são quantitativamente medidos por
cromatografia de gás em coluna capilar (AOAC, 2001).
A American Oil Chemists Society (AOCS) desenvolveu o método CE1h-05, método
de cromatografia gás-líquido (GLC) para a determinação da composição em ácidos graxos,
incluindo os isômeros trans, de ácidos graxos de óleos e gorduras de origem animal ou
vegetal. Os FAME da amostra são separados por cromatografia gasosa em coluna capilar
(colunas SP 2560 ou CP –Sil 88) com uma fase estacionária polar, de acordo com o seu
comprimento de cadeia, do grau de insaturação, da geometria e da posição das ligações duplas
(FIRESTONE, 2009a).
Comissão do Codex Alimentarius tem proposto métodos como o AOAC 996.06 para a
determinação de GT e AGS nos alimentos e o AOCS Ce 1h-05 para a quantificação de ácidos
graxos poli-insaturados e também AGT, no caso de disputas comerciais entre países (WHO,
2007a). No método AOAC 996.06, efetuado por cromatografia gasosa com detector de
ionização em chama (CG-DIC), recorre a análise Mojonnier para a extração seguida da
hidrólise ácida ou básica nos alimentos (AOAC, 2001).
34
A determinação de ácidos graxos trans por FT-IR baseia-se na ocorrência de banda de
deformação da ligação C-H em 966 cm-1
, sendo os carbonos envolvidos em ligações duplas
isoladas com configuração trans (TYBURCZY; MOSSOBA; RADER, 2013).
Métodos CG permitem determinar compostos em quantidades muito pequenas e, por
isso, são consideradas análises de alta sensibilidade. No entanto, estas técnicas requerem
operações de pré-tratamento da amostra como extração prévia das substâncias de interesse,
utilização de vários reagentes, vidrarias e equipamentos, o que as tornam demoradas e
geradoras de resíduos. Antes da injeção no cromatógrafo, os AG devem ser esterificados a
ésteres metílicos, aumentando a sua volatilidade e facilidade de análise, o que requer a
utilização de reagentes de toxidez elevada como, por exemplo, o BF3 (CHO et al, 2011). A
derivatização pode gerar erros, como conversão incompleta dos ácidos graxos (ligados ou
livres) aos ésteres desejados e a alteração da estrutura durante a liberação e esterificação dos
ácidos graxos (SINELLI et al, 2010).
Uma das vantagens descritas da espectroscopia no infravermelho é que não há
necessidade de um preparo da amostra para análise, ou seja, pode-se economizar grande
quantidade de reagentes, reduzir o tempo e o pessoal para as análises. Outra vantagem é que
não é uma técnica destrutiva para obter as medições de componentes químicos. É uma técnica
rápida de quantificação dos isômeros monoenoicos e dienoicos dos ácidos graxos e tem a
capacidade para fornecer informações sobre as propriedades químicas e estruturais de
materiais biológicos (MOSSOBA et al, 2011).
A quantificação para teores de AGT inferiores a 5% é prejudicada em gorduras que
contenham, por exemplo, ligações duplas trans de sistemas conjugados e outros interferentes
que alterem a região de absorção dos AGT. Avanços na técnica de infravermelho utilizando
reflectância total atenuada (ATR), associada ao processamento matemático dos espectros por
transformada de Fourier tem tornado possível à determinação dos AGT de forma mais rápida
e/ou mais acurada (KODALI; LIST, 2005; ELSOHABY et al, 2014). A técnica permite
determinar não só o teor de AGT de uma gordura ou óleo, como também capacidade de
extrair informações relativas à composição e conformação dos componentes dos alimentos, a
partir dos espectros de baixos níveis no picograma e sem a necessidade de derivatização
(MOSSOBA et al, 2007).
Transformada de Fourier no infravermelho (FT-IR) pode ser uma das técnicas ideais
para quantificar ácidos graxos trans com ligações trans-duplas isoladas.Várias modificações
têm sido propostas para melhorar precisão dos métodos FT-IR. No entanto, como é entendido
pelas fontes bibliográficas disponíveis, têm havido poucos estudos para implementar os
35
dados obtidos a partir FT-IR sem pré-tratamento da amostra (extração), em comparação com
cromatografia gasosa acoplado a espectrometria de massas (CG-EM)(TYBURCZY;
MOSSOBA; RADER, 2013).
Diante das provas conclusivas de que o consumo de AGT representa uma séria ameaça
para a saúde humana, a remoção e/ou redução significativa de AGT nos alimentos é questão
de saúde pública (MONGE-ROJAS et al, 2017), sendo necessário um monitoramento
continuo das situações atuais dos países, através de um método de análise oficial de rápida e
simples medição, como o FT-IR-ATR, que determine concentração de AGT <1% nos óleos e
gordura.
3.2.1 Cromatografia gasosa
A técnica de cromatografia em fase gasosa (CG) revolucionou o estudo de lipídeos,
tornando possível determinar a composição de ácidos graxos de um lipídeo em um curto
espaço de tempo. Para tal, os componentes de ácidos graxos são convertidos em um derivado
volátil mais simples, geralmente ésteres metílicos, apesar de outros ésteres poderem ser
escolhidos para fins específicos. A preparação destes ésteres é o tipo mais comum de reação
química para as análises de lipídeos (VISENTAINER, 2012).
O termo cromatografia gasosa (CG) refere-se a uma técnica de separação que envolve
duas fases distintas: uma fase estacionária, a qual pode ser sólida ou líquida, e uma fase
móvel, que é um gás que passa sobre a fase estacionária e que transporta a amostra. Este deve
ser um gás inerte relativamente à amostra e à fase estacionária, muitas vezes designado como
gás de arraste. No caso da coluna empacotada o nitrogênio é o gás de arraste mais utilizado,
seguido pelo hélio. No caso da coluna capilar ou tubular aberta, o gás de arraste mais usado é
o hélio, seguido por hidrogênio e nitrogênio. A fase estacionária é uma película fina de
líquido que pode revestir a superfície de partículas inertes sólidas contidas numa coluna de
aço inoxidável ou vidro (coluna de enchimento), ou que pode constituir um filme líquido que
reveste as paredes interiores de uma coluna capilar de sílica fundida (HARRIS, 2010).
O tipo de entrada e a técnica de injeção estão relacionados e são determinados pelo
tipo de coluna, propriedades da amostra e sensibilidade analítica necessária. As amostras são,
geralmente, injetadas diretamente na extremidade da coluna. No caso de colunas capilares, as
amostras são, geralmente, injetadas numa câmara separada da coluna, vaporizadas e
transferidas para a coluna na fase de vapor (HOLLER; SKOOG; CROUCH, 2009).
36
A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-EM) é um processo
analítico que permite analisar qualitativa e quantitativamente a amostra num único
instrumento, mesmo em concentrações baixíssimas (como 0,5%, em percentagem da gordura
total). Ou seja, o CG-EM não só separa os componentes de uma mistura complexa, como
também recolhe o espectro de massa de cada componente, o que permite expressar o tempo de
retenção (TR) obtido. O TR obtido através do CG está relacionado com propriedades
químicas específicas das moléculas presentes na amostra (volatilidade, polaridade, presença
de grupos funcionais específicos), enquanto o peso molecular é indicador da composição
atômica (GOUVÊA et al, 2012).
A separação das moléculas de uma mistura ocorre pelas diferenças das propriedades
químicas das mesmas à medida que percorre o comprimento da coluna, sendo o esquema de
funcionamento do cromatógrafo ilustrado na figura 2. As moléculas eluem do cromatógrafo a
gás em período de tempo distintos, permitindo que a corrente do espectrômetro de massa
capture, ionize, acelere, desvie e detecte as moléculas ionizadas separadamente. O
espectrômetro de massa divide cada molécula em fragmentos ionizados e detectando esses
fragmentos pela razão massa/carga (VISENTAINER, 2012).
Figura 2. Esquema interno de funcionamento do cromatógrafo a gás com detecção de
espectrometria de massas (CG-EM) (LANCASHIRE, 2013).
Em resumo, cada componente da amostra, ao chegar ao detector, origina um sinal
elétrico proporcional à quantidade de íons originados pelo composto. O registro é feito sob a
forma de um cromatograma ou perfil de corrente iônica total (TIC) em que se tem a
representação dos picos correspondentes à abundância de todos os íons no detector em função
do tempo. O software utilizado deve permitir obter, a partir do TIC, o registro da abundância
dos íons de uma massa específica versus tempo, o qual se designa por perfil de corrente iônica
extraída (PCIE). Da análise do TIC obtém-se informação sobre o tempo de retenção e a área
37
de cada pico. A identificação dos vários componentes da amostra é efetuada com base nos
tempos de retenção e na análise dos espectros de massa correspondentes a cada pico. O
software do equipamento processa o sinal obtido através da análise. Este possui uma
biblioteca que identifica os íons e os associa aos respectivos compostos. Estes são
identificados e quantificados por dois íons específicos denominados por íons de quantificação
(AHUJA; JESPERSEN, 2006).
Esses dois componentes usados em conjunto possibilitam um grau de identificação de
substância muito maior que se usados separadamente. Tal associação reduz a possibilidade de
erro, já que é improvável que duas moléculas diferentes se comportem da mesma maneira
tanto no cromatógrafo a gás como no espectrômetro de massa. Portanto, quando um espectro
de massa com tempo de retenção característico aparece em uma análise por CG-EM, a certeza
que o componente de interesse está presente na amostra aumenta (LANCASHIRE, 2013).
Os métodos de ionização mais empregados em CG-EM são ionização por impacto de
elétrons (IE) e a ionização química (IQ). Na IE, o analito de interesse, em fase gasosa, é
bombardeado com elétrons de alta energia (geralmente 70 eV). As moléculas do analito
absorvem esta energia desencadeando vários processos, dentre os quais o mais simples é
aquele em que o analito é ionizado pela remoção de um único elétron. Este processo requer
tipicamente 10 eV e o restante da energia gera fragmentação dos analitos. Isto consiste em um
dos maiores problemas encontrados na aplicação de IE, pois a fragmentação rápida pode
conduzir a não observação do íon molecular no espectro, perdendo-se, portanto, uma das mais
importantes informações analíticas oferecidas pelo EM (ARDREY, 2003).
A IQ é a técnica que foi desenvolvida especialmente para aumentar a produção do íon
molecular e reduzir as fragmentações associadas à ionização por elétrons. Nesta técnica, as
moléculas do analito, em fase gasosa, são introduzidas na câmara de ionização do
espectrômetro de massas, que contém um gás reagente. Esta mistura (moléculas do analito +
gás reagente) é bombardeada com elétrons, assim como na IE. Mas, como o gás reagente está
em excesso em relação ao analito (geralmente em proporção maior que 1000:1), ele é
ionizado quase que exclusivamente e passam a ocorrer reações entre os íons em fase gasosa
do gás reagente e as moléculas neutras do analito, dando origem aos íons pseudo moleculares
do analito [M+H]⁺. Por este processo ser relativamente de baixa energia, quase não é
observada fragmentação (VÉKEY, 2001).
Espectrômetros de massas com analisador quadrupolo é uma alternativa interessante,
uma vez que estão disponíveis na maioria dos cromatógrafos. Este analisador possui quatro
barras cilíndricas e paralelas que atuam como eletrodos. Uma combinação de corrente
38
contínua e radiofrequência é aplicada nas barras, que passam a atuar como filtros. Somente os
íons que apresentarem determinada massa carga (m/z), a qual esteja em ressonância com o
campo aplicado, irão passar pelas barras do quadrupolo e serão detectadas. Os demais íons
que entrarem no quadrupolo terão trajetórias instáveis e, como consequência, atingirão as
barras e serão eliminados pela bomba de vácuo (BLASE et al, 2014).
Outro analisador de massas que tem seu uso bastante difundido é o analisador de
massas por tempo de voo (TOF). Neste analisador os íons produzidos são acelerados e passam
por um tubo de separação.Todos os íons que entram no tubo, possuem a mesma energia, logo,
suas velocidades variam de forma inversa às suas massas, fazendo que os íons mais leves
cheguem primeiro ao detector (HOLLER; SKOOG; CROUCH, 2009).
Na cromatografia gasosa associada ao detector de ionização por chama (CG-DIC), o
eluente à saída da coluna é misturado com hidrogênio que atravessa uma chama alimentada
por ar. Existe uma diferença de potencial entre a saída da coluna e o eletrodo coletor. O
analito, depois de queimado na chama, gera uma nova corrente de íons que vai ser recolhida
no elétrodo coletor e a corrente de ionização resultante é amplificada e enviada para o sistema
de aquisição de dados (GOUVÊA et al, 2012).
O detector é aquecido a uma temperatura um pouco superior à do injetor e é
independente do valor da temperatura do forno, sendo que este já deve estar a uma
temperatura elevada antes da ignição. O aquecimento evita a condensação da água a partir da
chama (ADAM; COOPER, 2008).
A identificação do carbono presente na amostra baseia-se no tempo de retenção, em
condições cromatográficas constantes e bem definidas. A área do pico traduz a quantidade de
carbono na amostra (GOUVÊA et al, 2012).
3.2.1.1 Métodos de extração de lipídeos
Em matrizes complexas, como a dos biscoitos, é recomendado primeiramente que se
faça uma extração desses compostos, isolando e pré-concentrando, dessa forma, o analito de
interesse. Isso é importante principalmente porque os açúcares podem interferir na análise
devido a sua alta concentração (KASKONIENE; VENSKUTONIS; CEKSTERYTE, 2008).
A extração de lipídeos é uma etapa importante na determinação da composição de
ácidos graxos. A preparação da amostra deve ser cuidadosa, sendo que em alguns
procedimentos e matrizes pode ocorrer a co-extração dos não lipídeos, oxidação indesejada,
perda dos compostos mais voláteis e dificuldade de extração dos lipídeos ligados a outras
39
moléculas, influenciando na qualidade final da amostra e no perfil de ácidos graxos
(LUTHRIA, 2004).
A habilidade de recuperar os vários componentes dos lipídeos varia com o solvente de
extração. A ampla faixa de polaridade dos lipídeos, os diferentes tipos de ligações e energias
fazem com que a escolha do solvente seja uma tarefa difícil. Os solventes mais utilizados são:
éter etílico, éter de petróleo e clorofórmio-metanol. Todos estes solventes extraem
triacilgliceróis. O éter etílico e o de petróleo extraem mono, di e triacilgliceróis, esteróis e
ácidos graxos. Solventes mais polares, como a mistura de clorofórmio e metanol, também
extraem lipídios polares como fosfolipídios, esteróis, terpenos, ceras, hidrocarbonetos e outros
componentes não lipídicos (KASKONIENE; VENSKUTONIS; CEKSTERYTE, 2008).
Os métodos que empregam a mistura clorofórmio metanol, como por exemplo, o de
Bligh e Dyer (1959) e de Folch, Lees, Stanley (1957), são reconhecidos como os mais
adequados para a extração de todos os componentes dos lipídeos. Nestes métodos, as
proporções entre os solventes de extração, massa da amostra e solventes, o modo de
preparação da amostra, o tempo de agitação, o teor de gordura, água e o tipo de produtos, são
críticos, influenciando a eficiência de extração (PÉREZ-PALACIOS et al, 2008).
O método AOAC 996.01 foi avaliado e adotado como oficial para a determinação de
gordura e ácidos graxos para produtos à base de cereais contendo de 0,5 a 13% de GT. O
método AOAC 996.06, semelhante ao anterior, foi desenvolvido para a extração e
determinação da gordura total dos alimentos em geral, a partir da análise de ácidos graxos por
CG-DIC. Os métodos envolvem extração por hidrólise tipo Mojonnier, que causa quebra da
matriz do alimento, seguido de extração etérea, transesterificação do ácido graxo para seus
ésteres metílicos, usando BF3 em metanol (AOAC, 2001; AOAC, 2002).
Algumas técnicas mais modernas de extração de gordura têm sido propostas para
reduzir significativamente o tempo e o consumo de solvente e fornecer resultados
equivalentes. Entre estas técnicas, destacam-se a extração acelerada com solvente (EAS), a
extração com fluído supercrítico (EFSC), a extração dinâmica por ultra-som e com auxílio de
microondas. Entretanto, a desvantagem destes métodos é a necessidade de otimizar as
variáveis que influenciam na extração para cada tipo de produto, uma vez que os teores de
gordura e de água dos alimentos afetam a eficiência de extração (LUTHRIA, 2004).
Nas análises de rotina de muitos laboratórios brasileiros, visando gerar dados para a
informação da rotulagem nutricional, empregam-se extração a frio como no método de Bligh
e Dyer, utilizando a mistura de solventes de extração clorofórmio/metanol visando não alterar
a gordura original do alimento e, portanto, os AG (LOBANCO et al, 2009).
40
3.2.2 Espectroscopia no infravermelho
A espetroscopia de infravermelho tem sido adotada em muitas áreas científicas,
superando, por vezes, os métodos tradicionais. As principais razões para a popularidade desta
ferramenta analítica são a rapidez com que as amostras são caracterizadas, praticamente sem
manipulação e a grande versatilidade do equipamento. Obtém-se rapidamente informação
relativa aos grupos funcionais presentes na amostra em estudo, e consegue-se também obter
alguma informação sobre o tipo de ligações presentes na molécula (LIN; CHEN; HEY, 2012).
A espectroscopia de infravermelho é uma técnica analítica que utiliza radiação
infravermelha para produzir vibrações moleculares, a fim de adquirir impressões espectrais
que são únicas e reproduzíveis para um determinado produto (SMITH; SPANEL, 2005).
A espectroscopia no infravermelho estuda interações da radiação eletromagnética com
a matéria (gases, líquidos ou sólidos). Essas interações podem levar a transições entre os
níveis de energia dos átomos e moléculas e o resultado destas interações depende diretamente
da energia incidente, associada ao comprimento de onda da radiação (AOUIDI et al, 2012).
A região do infravermelho corresponde ao local do espectro eletromagnético situado
entre as regiões do visível e micro-ondas, engloba radiações com número de onda de 12.800
cm-1
a 10 cm-1
, ou com comprimentos de onda de 780 a 1,0x10⁶nm. O espectro de
infravermelho pode ser divido em infravermelho próximo, médio e distante, conforme é
apresentado na tabela 1 (HOLLER; SKOOG; CROUCH, 2009).
Tabela 1. Regiões espectrais do infravermelho
Fonte: HOLLER; SKOOG; CROUCH, 2009.
Para absorver a radiação infravermelha, uma molécula deve sofrer uma variação no
momento de dipolo durante seu movimento rotacional ou vibracional. Apenas sob estas
circunstâncias o campo elétrico pode interagir com a molécula e causar variações na
amplitude do movimento vibracional ou rotacional. O momento de dipolo é determinado pela
magnitude da diferença de carga e pela distância entre dois centros de carga (PAVIA et al,
2010).
41
As características de uma vibração atômica podem ser aproximadas por um modelo
mecânico, o qual considera que a ligação entre duas massas (átomos) é feita por uma mola,
em que a frequência de vibração da mola é descrita pela Lei de Hooke (OZAKI et al, 2007).
Uma perturbação de uma dessas massas ao longo do eixo da mola resulta em uma
vibração chamada movimento harmônico simples. As vibrações moleculares podem ser
classificadas em dois tipos, vibração de deformação axial ou estiramento e vibração de
deformação angular podendo estas deformações ser simétricas ou assimétricas. As
deformações de estiramento são oscilações radiais das distâncias entre os núcleos, e as
deformações angulares envolvem mudanças dos ângulos entre o plano que contém a ligação e
um plano de referência. As vibrações de deformação angular podem ser de quatro tipos:
simétrica no plano, assimétrica no plano, simétrica fora do plano e assimétrica fora do plano
(PAVIA et al, 2010). Na figura 3, é ilustrado as diferentes formas de vibrações moleculares de
deformação.
Figura 3. Diferentes formas de vibrações moleculares de deformação (BRUICE, 2006).
O espectro no infravermelho médio apresenta vibrações fundamentais, onde as bandas
são intensas e bem definidas. Este pode ser subdividido em duas regiões, sendo a região de
4.000 cm-1
a 1.400 cm-1
, correspondente a bandas de absorção da maioria dos grupos
funcionais. Já a região de 1.400 cm-1
a 600 cm-1
é conhecida como região de impressão
42
digital, onde cada substância apresenta um padrão específico de banda de absorção (PAVIA et
al, 2010).
As moléculas estão sujeitas ao desenvolvimento de vários efeitos inerentes às ondas
eletromagnéticas. A interação da radiação eletromagnética com a matéria pode ocorrer, por
exemplo, por meio de absorção, reflexão e espalhamento. Estas interações são características
dos átomos presente nas moléculas, bem como da região do espectro envolvida, permitindo a
identificação de compostos (POPESCU et al, 2015).
Para a caracterização de compostos na região do infravermelho pode-se utilizar entre
os mecanismos de medida, a absorbância, a transmitância e a reflectância, sendo que a técnica
de reflectância tem sido utilizada com a finalidade de determinar quantitativamente proteínas,
lipídeos e umidade em amostras sólidas (HOLLER; SKOOG; CROUCH, 2009).
A interação da radiação eletromagnética com a matéria pode sofrer diferentes tipos de
reflexão, tais como: reflexão difusa, reflexão especular, reflexão interna e reflexão total
atenuada (ibid).
Os espectros do FT-IR descrevem um sinal químico da amostra contendo informações
complexas onde as alterações na posição e intensidade das bandas no espectro estariam
associadas às alterações na composição química de uma amostra (ROHAETI et al, 2015).
3.2.2.1 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier e Reflectância
Total Atenuada (FT-IR-ATR)
Os espectrômetros de infravermelho começaram a ser usados na década de 40 do
século XX e têm sido alvo de inúmeras modificações. Um dos mais importantes avanços
nesta tecnologia foi à criação do espectrômetro de infravermelho com transformada de
Fourier (FT-IR). Este contém um interferômetro e explora um processo matemático
denominado transformada de Fourier. É utilizado para estudar desde impressões digitais
contaminadas, detectar falsificação, substâncias ilícitas até caracterizar materiais explosivos
(EWING; KAZARIAN, 2017).
A utilização da transformada de Fourier garante a otimização das funções da
espectrometria, permitindo maior sensibilidade e velocidade de análise (SALA, 2008).
A técnica baseia-se no interferômetro concebido por Michelson em finais do século
XIX. Neste aparelho, a radiação emitida interage com o divisor de feixe onde parte da
radiação segue na mesma direção e outra parte é refletida para um espelho fixo. Os espelhos
refletem a radiação de volta ao divisor de feixe onde se recombinam e interagem com a
43
amostra. Os movimentos do espelho móvel determinam a intensidade com que a radiação
interage com a amostra, em função do espaço que o espelho percorre. O movimento com
velocidade constante do espelho móvel forma o interferograma. Este é posteriormente
convertido num espectro através dos algoritmos matemáticos da transformada de Fourier
(HOLLER; SKOOG; CROUCH, 2009). Na figura 4, é ilustrado a esquemática do
interferômeto de Michelson, o interferograma gerado e o espectro.
O recurso da transformada de Fourier permite uma melhor manipulação dos dados,
uma vez que o sinal analógico é convertido num sinal digital, o ruído é minimizado, a
resolução é melhorada e é possível a leitura de espectros de amostras em movimento
(FORATO et al, 2010).
Figura 4. Representação esquemática do interferômeto de Michelson, o interferograma gerado
e o espectro (FORATO et al, 2010).
O princípio da reflectância atenuada (ATR) está baseado na ocorrência de reflexão
com a passagem de um feixe de radiação de um meio mais denso (cristal de ATR), com índice
de refração superior ao da amostra, para um menos denso (amostra), induzindo a reflexão
interna total da radiação incidente, a qual é atenuada e penetra na amostra como uma onda
evanescente. O elemento de reflexão interna pode ser um diamante, selenito de zinco (ZnSe),
germânio ou silício. A penetração da radiação na amostra é particular a cada comprimento de
44
onda e depende do índice de refração da amostra, do índice de refração do elemento de
reflexão interna e do ângulo de incidência da radiação (RASPE, 2011).
O feixe penetra uma fração de comprimento de onda para além da superfície refletora
e, quando o material que absorve seletivamente a radiação está em contato com a superfície, o
feixe perde energia no comprimento de onda em que o material absorve. É medida a radiação
atenuada resultante e usada pelo espetrofotômetro como uma função de comprimento de onda,
dando assim as características espectrais de absorção da amostra (HOLLER; SKOOG;
CROUCH, 2009).
A utilização de FT-IR-ATR permite obter maior precisão na medição, melhor relação
sinal/ruído, além de apresentar maior facilidade e agilidade na aquisição dos dados da amostra
(MAHAMUNI; ADEWUYI, 2009).
FT-IR-ATR fornece medições rápidas e reprodutíveis para amostras que contêm mais
do que 1% de AGT (MOSSOBA et al, 2011).
O método FT-IR-ATR, oficial AOAC 2000.10, tem sido ferramenta de escolha para a
determinação rápida de todas as ligações duplas trans isoladas em óleos e gorduras.
Proporciona redução significativa no tempo de análise total, quando comparados com os
outros métodos de análise, como AOAC 996.06. O impacto adverso sobre a precisão pode ser
observado, próximo de 5% trans do total de gordura, que é limite estabelecido pelo método
oficial (COLLISON et al, 2010).
45
4 – MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 AMOSTRAS
Foram escolhidas 9 marcas de biscoitos recheados sabor chocolate, de preços
variáveis, das quais foram comprados 3 pacotes de lotes distintos. Todas as amostras foram
compradas em mercado da cidade do Rio de Janeiro.
As amostras foram removidas das embalagens e homogeneizadas (os três lotes
diferentes de cada amostra juntos) em multiprocessador de alimentos (Black & decker,
modelo HC31) e armazenadas em sacos plásticos livres de ar, cobertos por papel alumínio e
mantidos congelados em freezer a -18°C.
As amostras foram denominadas de A, B, C, D, E, F, G, H, I.
Foi adquirido, em mercado da cidade do Rio de Janeiro, 1 pacote de gordura vegetal
hidrogenada para ser usada como padrão secundário para análise de AGT por FT-IR-ATR.
Todas análises foram feitas na Faculdade de Farmácia da UFF, Niterói, no período de
janeiro de 2016 até junho de 2017.
4.2 ANÁLISES QUÍMICAS DAS AMOSTRAS DE BISCOITOS RECHEADOS E
GORDURA VEGETAL HIDROGENADA
4.2.1 Determinação de umidade das amostras de biscoito recheado
A análise de umidade das amostras foi feita segundo as normas analíticas do Instituto
Adolfo Lutz (SÃO PAULO, 2008). Foram pesados cerca de 5 g de amostra em cápsulas de
porcelana, e o conjunto foi aquecido durante 6 horas em estufa a 105ºC e resfriado em
dessecador por 15 minutos para posterior pesagem. A operação de aquecimento por 1 hora e
resfriamento em dessecador por 15 minutos foi repetida até peso constante.
4.2.2 Determinação do conteúdo de lipídeos em biscoito recheado
O conteúdo total de lipídeos foi obtido pelo método de Soxhlet de acordo as normas
analíticas do Instituto Adolfo Lutz (2008), devido ao fato das amostras apresentarem
interferentes na sua composição que influenciaram na quantificação de lipídeos totais pelo
método Bligh- Dyer (1959).
Foram pesados, cerca de 5 g da amostra em cartucho de Soxhlet. A amostra foi coberta
com pedaço de algodão desengordurado. A extração foi levada a efeito em extrator contíuo
46
(Soxhlet), com éter de petróleo, por 6 horas. Ao término da extração, recuperou-se por
destilação, a maior parte do solvente utilizado. Finalizada a evaporação do solvente, balão
com resíduo foi colocado em estufa a 105ºC. Em seguida, o balão foi resfriado em dessecador
até a temperatura ambiente e pesado. Com os dados obtidos, foi calculada a concentração em
lipídeo de cada amostra.
Para as análises de AGT em biscoitos por cromatografia gasosa e FT-IR- ATR, os
lipídeos foram extraídos a frio de acordo com método Bligh- Dyer (1959), onde três gramas
de amostra previamente homogeneizada foram transferidos para erlenmeyer, sendo
adicionados 10 mL de clorofórmio, 20 mL de metanol e 8 mL de água destilada e vedado.
Quando a amostra contém teor de água acima de 10%, é preciso descontar a umidade da
amostra na água fornecida, com o objetivo de manter a relação dos solventes 1:2:0,8, para
coexistir uma solução homogênea.
Para isso foi analisada a umidade, previamente, das amostras. Em seguida, os
solventes com a amostra foram agitados em shaker (Lucadema, 222) por 30 minutos, em 175
rotações por minuto (rpm). Após, foi retirado o líquido e repetida mais duas vezes a etapa,
transferindo o sobrenadante para funil de decantação. Posteriormente, foram adicionados 20
mL de cloreto de sódio a 10% e 10 mL de clorofórmio. A adição de mais clorofórmio e mais
água muda a proporção para 2:2:1,8 (v/v/v), causando a separação total do clorofórmio que
carrega os lipídeos (camada inferior). Foi retirada a camada inferior (clorofórmio) e colocada
num tubo de 30 mL. Foi adicionado 1g de sulfato de sódio anidro. A solução foi tampada e
agitada para remover os traços de água. Em seguida, foi filtrada em um funil com papel de
filtro, dando origem a uma solução límpida. Posteriormente, foi colocada em balão de fundo
redondo (previamente tarado) e foi evaporado o solvente em evaporador rotativo, sob vácuo
(Fisatom, 801) a 40°C. Posteriormente foi pesado o balão. A operação foi realizada em
duplicata.
4.3 DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS DO BISCOITO E
GORDURA VEGETAL HIDROGENADA
4.3.1 Hidrólise de glicerídeos e esterificação de ácidos graxos para análise por
cromatografia gasosa.
A esterificação dos ácidos graxos foi realizada segundo a técnica por Hartman e Lago
(1973). Para ocorrer a hidrólise e esterificação dos ácidos graxos foram pesados de 100 a 400
mg do material lipídico em balão de fundo chato de 250 mL, aos quais foram adicionados 5
mL de solução metanólica de hidróxido de sódio 0,5 N, e deixou-se em ebulição com refluxo
47
por 3 a 5 minutos. Na solução quente foram adicionados 15 mL do reagente de esterificação
(2 g de cloreto de amônio e 3 mL de ácido sulfúrico concentrado, em 60 mL de metanol,
misturados em refluxo por 15 minutos) e deixou-se em refluxo por 3 minutos.
Depois do resfriamento, a mistura foi colocada em funil de decantação de 250 mL e
foram acrescentados 50 mL de água destilada e 50 mL de éter de petróleo. Após a separação,
a fase com éter foi lavada com mais duas vezes com 25 mL de água destilada e descartada a
camada aquosa. A fase com éter foi filtrada em sulfato de sódio anidro e, posteriormente, foi
evaporado o solvente com o uso do evaporador rotativo sob vácuo (Fisatom, 801), a 40°C, e
o extrato foi colocado em frasco eppendorf, que foi lacrado e colocado em freezer (-18°C)
para posterior análise por cromatografia gasosa.
4.3.2 Avaliação da análise de AGT em biscoito recheado e gordura vegetal hidrogenada
por CG-EM
Com intuito de identificar os principais ácidos graxos presentes nas amostras de
biscoitos recheados e de gordura vegetal hidrogenada e, quantificar o ácido elaídico (C18:1,
n9 trans), AGT majoritário nestes tipos de amostras, utilizou-se a cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massas (CG-EM).
Um microlitro de solução dos ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME), em hexano
grau HPLC, foi injetado no cromatógrafo da marca Shimadzu, modelo CG 210 Plus, acoplado
a espectrômetro de massas EM QP2010 ULTRA. A coluna usada foi capilar, com fase 5%
difenil/95% dimetil-polisiloxano, modelo Rtx - 5 MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm), usando o
hélio 5.0 como gás de arraste, com fluxo de 0,74 mL/minuto.
A temperatura inicial do forno da coluna foi 160 ºC por 1 minuto, que foi elevada até
182 ºC por 5 minutos na taxa de 0,5 ºC/min. Depois, foi elevada até 200 ºC na taxa de 3
ºC/min, chegando até 230 ºC, na taxa de 1 ºC/min, permanecendo por 15 minutos. A
temperatura de fonte de íons foi 180 ºC; a do injetor foi 220 ºC e a da interface foi 220 ºC. O
modo de injeção foi split/splitless e intervalo de m/z considerado foi 40.00 até 650.00.
O detector de espectrometria de massas operou com ionização por impacto de elétrons
(EI) de 70 eV. O analisador de íons foi quadrupolo e o modo de análise foi varredura de
íons (full scan).
O ácido elaídico, presente nas amostras, após hidrólise e metilação como elaidato de
metila foi identificado comparando o espectro de massa de fragmentação pela similaridade
dada pela biblioteca do aparelho (Nist- National Institute of Standards and Technology), pela
48
comparação com o tempo de retenção do padrão elaidato de metila (10mg/mL em heptano, da
Sigma-Aldrich) e após confirmação com fortificação das amostras com 60 μL de solução
padrão de elaidato de metila (100 μL/mL em hexano grau HPLC).
O perfil dos ácidos graxos de cada amostra foi determinada pelo cromatograma de
íons totais (TIC) e identificado pela similaridade do espectro de massa de fragmentação dada
pela biblioteca do aparelho (Nist- National Institute of Standards and Technology).
4.3.3 Avaliação da análise de AGT em biscoito recheado por FT-IR-ATR com extração
da gordura, sem extração prévia da gordura e após hidrólise de glicerídeos e
esterificação de ácidos graxos
4.3.3.1 Aquisição dos espectros
A aquisição dos espetros de infravermelho das amostras foi efetuada em
espectrôfotometro de FT-IR-ATR de bancada, modelo IR TRACER 100, da Shimadzu,
equipado com dispositivo amostrador horizontal por reflectância total atenuada (ATR) com
cristal de ZnSe e diamante, divisor de feixe de brometo de potássio (KBr) e detector de
sulfato de triglicina deuterado (DLATGS)
O tratamento de dados foi realizado com o software LabSolutions IR (Shimadzu).
Os espetros foram medidos na região entre 4.000 cm-1
e 600 cm-1
, com resolução de 4
cm-1
e 45 scans, com um tempo total de aquisição de cerca de 6 minutos. Após cada
varredura, ocorreu remoção da amostra da superfície do cristal, que foi limpo com álcool
isopropílico.
Antes da análise foi realizada um espectro de background do ar (45 scans), sendo o
mesmo utilizado para descontar a influência dos componentes do ar no espectro.
O erro das determinações de absorbância foi de 0,125 cm-1
.
As amostras de biscoito recheado sem a etapa prévia de extração (apenas
homogeneizadas), com auxílio de uma espátula, foram colocadas diretamente sobre o cristal
de ATR em quantidades suficientes para cobrí-lo e prensados para serem atravessadas pela
radiação.
Já as amostras com extração e derivatização, foram dissolvidas em hexano grau
HPLC. Foram colocados 10 μL de solução, com auxílio de uma pipeta, no cristal de ATR
sobre uma célula-contentora, e foram aguardados 5 minutos para a evaporação completa do
solvente.
49
A presença de AGT foi identificada por meio da visualização da banda próxima a 966
cm−1
e confirmada com adição de padrão às amostras. As amostras como extratos foram
fortificadas com, cerca de 1 mg de gordura vegetal hidrogenada (contendo ácido elaídico no
triglicerídeo) e amostras hidrolisadas e esterificadas foram fortificadas com cerca de 0,05 mL
do padrão de elaidato de metila (100 μL/mL em hexano grau HPLC).
Todas as análises foram realizadas em temperatura ambiente e em triplicata.
4.4 QUANTIFICAÇÃO DO ACÍDO ELAÍDICO
4.4.1 Quantificação do ácido graxo elaídico por CG-EM
Para a quantificação foi realizada padronização externa com curva de calibração
variando em cinco concentrações diferentes (6μg/mL, 30 μg/mL, 35 μg/mL, 40 μg/mL e 70
μg/mL).
Com os dados obtidos, foi calculada a conversão do elaidato de metila (massa
molecular 296,49 g/mol) presente nas amostras hidrolisadas e esterificadas (FAME) para
ácido elaídico (massa molecular de 281,45 g/mol, considerando um hidrogênico a menos,
devido a inserção do ácido elaídico no glicerol).
As amostras foram analisadas em g por 100g de gordura total e usado o teor de
lipídeo total analisado previamente para cada amostra, como base de cálculo para a
determinação do teor de ácido elaídico em g por 100 g de biscoito.
4.4.2 Quantificação de ácidos graxos trans por FT-IR-ATR
Estas análises foram feitas com base no estudo feito por CHO et al (2011), com
algumas modificações. As amostras, tanto de extrato quanto as que sofreram derivatização,
com concentrações padronizadas (100 mg/mL em hexano grau HPLC), foram colocadas
diretamente sobre o cristal de selenito de zinco e diamante do dispositivo para ATR do
aparelho, com auxílio de uma pipeta automática (colocando 10 μL de solução e aguardando 5
min para a evaporação por completa do hexano. A análise foi realizada em triplicata.
Para curva de calibração, foi feita adição de soluções padrões de calibração,
constituídas de misturas de gordura vegetal hidrogenada e óleo de soja. A análise prévia do
óleo de soja indicou que este não apresentou a banda de absorção em 966 cm−1
, característica
dos AGT. Sendo assim, foram elaborados padrões de gordura sem esterificação, através da
mistura do óleo de soja e gordura vegetal hidrogenada, de modo a serem obtidas amostras,
sem hidrólise e esterificação, de gorduras com diferentes concentrações de AGT.
50
Vale ressaltar que a análise de AGT foi feita previamente na gordura hidrogenada
(CG-EM), para determinar o teor de AGT neste material, de forma que esta gordura pudesse
ser usada como padrão secundário para AGT na forma esterificada nos triglicerídeos.
Destaca-se que o ácido elaídico foi o único AGT identificado na gordura vegetal hidrogenada
utilizada.
Foram construídas duas curvas-padrão para quantificação de ácido elaídico nas
amostras, na forma de extrato lipídico e em forma de FAME, por meio da mistura de gordura
vegetal hidrogenada e óleo de soja (curva 1) e da mistura de elaidato de metila e ésteres
metílicos dos ácidos graxos oriundos do óleo de soja (curva 2). Estes últimos foram obtidos
no laboratório, após, hidrólise de glicerídeos e esterificação da mistura.
Os padrões de calibração para a curva 1 foram preparados pela adição de gordura
vegetal hidrogenada ao óleo vegetal comercial, de modo que a concentração de ácido elaídico
na amostra fosse de 0,43%, 1,75%, 17%, 26%, 35%.
O resultado foi expresso em porcentagem de ácido elaídico na gordura. Foi obtido o
espectro de absorção no infravermelho, para cada padrão elaborado, e depois determinou-se a
área e a altura da banda próxima a 966 cm-1
. A curva de calibração foi construída
considerando a concentração de AGT na gordura versus a área ou altura da banda a 966 cm-1
.
Nas amostras metiladas, foi detectado o conteúdo de ácido graxo elaídico, por
conversão de massa molecular de elaidato de metila (296,49 g/mol) para ácido elaídico
(281,45 g/mol, considerando um hidrogênio a menos, devido a inserção do ácido elaídico no
glicerol) inserido na gordura.
Foi analisado AGT em g por 100 g de gordura total, posteriomente calculado para g
por 100 g de biscoito (com o valor do lipídeo total calculado previamente) e g por porção de
consumo (30 g).
4.5 ANÁLISE DOS RÓTULOS DAS AMOSTRAS DE BISCOITO RECHEADOS
Os rótulos das amostras dos biscoitos recheados sabor chocolate foram avaliados,
considerando-se a descrição dos ingredientes e nomeclatura usada para determinar, caso
presente, os AGT.
Foi identificado o teor de lipídeo total por porção (30g), como descrito na embalagem
do biscoito e, posteriormente convertido para 100 g de biscoito e comparado aos resultados
obtidos pela análise de lipídeo total realizada nos biscoitos.
51
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Comparações entre os resultados obtidos por CG-EM, FT-IR-ATR com extração e FT-
IR-ATR com amostras de FAME, para verificação de diferença significativa, foram feitas por
meio de análise de Variância (ANOVA one way), com pós-teste de Tukey.
Foi considerado p<0,05 para determinação de diferença significativa. Foi usado
cálculo de média e desvio padrão para todas as análises. Análises estatísticas foram efetuadas
com o programa GraphPad Prism 5.0.
Para a função de regressão linear da curva padrão de calibração foi utilizado o
programa microsoft Excel 2013.
52
5- RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Caracterização das amostras analisadas
Inicialmente determinou-se a concentração de umidade e de lipídeos totais das
amostras, cujos resultados médios de umidade variaram de 2,28 ± 0,16 a 6,03 ± 0,19 (g/100g)
e de lipídeos totais variaram de 12,51±0,58 a 23,84±0,09 (g/100 g), indicando
heterogeneidade entre as amostras de biscoitos analisados.
Em relação ao rótulo, as amostras C, D, G, H e I apresentaram valores menores de
lipídeos totais do que os declarados no rótulo, enquanto as demais amostras analisadas com
valores próximos aos declarados, como pode ser observado na tabela 2.
De acordo com a Comissão Brasileira de Normas e Padrões de Alimentos (CNNPA),
resolução nº 263 de 2005, a umidade máxima para biscoitos permitida é de 14% (MARTIN;
MATSHUSHITA; SOUZA, 2004). Para todas as amostras, não foi observada concentração de
umidade superior a 6,03 g/100g, estando dentro do preconizado pela legislação brasileira.
Tabela 2. Determinação do conteúdo de lipídeos das amostras de biscoitos recheados de
chocolate analisados
Amostras Umidade
(g/100 g)
Lipídeos
totais
analisados
(g/100 g)
Lipídeos
totais
analisados
(porção 30g)
Lipídeos
totais
declarados
no rótulo
(g/100 g)
Lipídeos totais
declarados no
rótulo
(porção 30 g)
Biscoito A 2,28±0,16 23,84± 0,09 7,15 ±0,04 23,67 7,1
Biscoito B 3,35±0,39 21,35±0,83 6,405±0,53 21,33 6,4
Biscoito C 4,19±0,84 17,40±0,06 4,32±0,02 18,00 5,4
Biscoito D 4,54±0,28 15,52±1,90 4,66±0,81 20,00 6,00
Biscoito E 6,03±0,19 12,51±0,58 3,753±0,25 13,00 3,90
Biscoito F 5,47±0,44 17,93±0,01 5,40±0,004 17,00 5,1
Biscoito G 3,96±0,31 14,02±1,93 4,206±0,82 17,00 5,1
Biscoito H 4,25±0,14 16,10±0,64 4,83±0,27 18,33 5,5
Biscoito I 3,55±0,27 13,74±0,01 4,12±0,004 15,00 4,5
53
Vale ressaltar que a ANVISA não exige a análise constante e periódica destes
produtos, no que se refere à sua composição. A exigência é de realização de análise, apenas,
uma vez, ao iniciar a comercialização do produto. Portanto, um produto que foi analisado há
dez anos pode ter variado sua composição, ou o lote, mas a empresa pode elaborar seu rótulo
por meio de tabelas de composição de alimentos e não da análise, o que justifica diferença
entre os resultados da análise e dos rótulos (SREBERNICH; GONÇALVES; BAGGIO,
2013). Esta constatação pode ser um problema quanto ao fornecimento de informações
acuradas ao consumidor.
Diferenças entre a composição química de alguns alimentos e o conteúdo apresentado
em tabelas nacionais de referência e rótulos sugerem que a intervenção nutricional possa estar
sendo comprometida em nosso meio (PINTO et al, 2016).
5.2 AVALIAÇÃO DA ANÁLISES DE AGT EM BISCOITO RECHEADO POR CG-
EM
A metodologia oficial para análise de ácidos graxos em alimentos, recomendada pela
AOAC, faz utilização da técnica de cromatografia gasosa com detector de ionização em
chama (DIC) e padrões com certificado de referência, de modo a comparar os tempos de
retenção dos padrões com o das amostras analisadas, bem como a utilizar o método de
calibração externa para a quantificação dos componentes (AOAC, 2001). Posteriormente,
foram propostas alterações no método AOAC 996.06, as quais preveem utilização da técnica
de cromatografia gasosa com detector de massas (CG-EM) para confirmar a identidade de
ácidos graxos (AUED- PIMENTAL et al, 2016).
A cromatografia a gás com detector de massas é um método analítico bastante eficaz
na identificação de compostos e também na quantificação, especialmente no caso dos AG dos
alimentos presentes em pequenas quantidades (THURNHOFER; VETTER, 2005).
Por meio da análise de CG-EM, foi possível identificar preliminarmente os ácidos
graxos e, posteriormente, identificar e quantificar o ácido graxo trans predominante, ácido
elaídico, em todas as amostras de biscoitos e gordura vegetal hidrogenada.
Nas figuras 5 e 6, são ilustrados cromatograma obtidos nas análises de gordura
vegetal hidrogenada comercial e de uma amostra de biscoito recheado de chocolate (amostra
54
B), sendo os demais cromatogramas apresentados no anexo I deste trabalho.
Figura 5. Cromatograma de íons totais (TIC) para identificação dos principais ésteres
metílicos de ácidos graxos obtidos da amostra de gordura vegetal hidrogenada por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (tempo de retenção (TR) versus
intensidade). NOTA: Compostos identificados: picos 2. C16:0 (ácido palmítico); 3. C18:2
(ácido linoleico); 4. C18:1, n9-cis (ácido oléico); 5. C18:1, n9-trans (ácido elaídico) 6. C18:0
(ácido esteárico).
55
Figura 6. Cromatograma de íons totais (TIC) para identificação dos principais ésteres
metílicos de ácidos graxos obtidos da amostra de biscoito B por cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massas (tempo de retenção (TR) versus intensidade). NOTA:
Compostos identificados: picos 1. C16:0 (ácido palmítico); 2. C18:2 (ácido linoleico);
3.C18:1, n-9-cis (ácido oleico) 4. C18:1, n9-trans (elaídico) 5. C18:0 (ácido esteárico); 6.
C18:2, n9- trans, n12-trans (ácido linolelaidico).
No presente trabalho, foram testadas diferentes condições cromatográficas para
obtenção de melhores separações dos picos, sendo descrita na metodologia a melhor
alternativa encontrada. Foram otimizados os parâmetros como: temperatura do injetor, que
deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize imediatamente, mas sem a
decomposição da amostra; volume injetado, de acordo com o tipo de coluna e o estado físico
da amostra; modo de injeção split/splitess, que previne a introdução de compostos não
voláteis da amostra; controle da temperatura do forno, para que em temperatura mais baixa,
os componentes mais voláteis sejam separados e em temperaturas mais altas, contribuir para
que os componentes menos voláteis eluam mais rapidamente.
No entanto, conforme foi demostrado nos cromatogramas acima, foram observadas
algumas sobreposições e co-eluições, justificadas sobretudo pela coluna de menor
comprimento (30 metros).
Ao analisar os cromatogramas, verifica-se que, na gordura vegetal hidrogenada,
apenas foi encontrado o AGT elaídico (C18:1, n9-trans), enquanto no cromatograma da
56
amostra de biscoito B, além do AGT elaídico, identificado também o ácido linolelaidico
(C18:2, n9- trans, n12-trans).
O ácido elaídico foi identificado em todas as amostras analisadas, já o ácido
linolelaídico não foi encontrado em todas as amostras de biscoito. Em função da limitação de
recurso financeiro na execução da pesquisa apresentada, foi apenas efetuada a identificação e
quantificação do ácido elaídico nas amostras, através do padrão elaidato de metila, o que não
compromete o resultado porque o ácido majoritário é o ácido elaídico.
Alguns picos de compostos trans podem sobrepor aos pico de seus isômeros cis. O
motivo é que a hidrogenação parcial pode alterar a configuração geométrica e mudar a
posição da dupla ligação. Assim, a dupla pode existir entre C4 e C16. Embora a sobreposição
de picos pode incorrer no erro analítico, o ácido elaídico (C18:1, n9 trans) ou ácido
octadecenoico (C18:1, n10 trans) podem ser separados o suficiente do majoritário (C18:1, n9
cis) (MCDONALD; MOSSOBA, 2002).
Utilização de colunas maiores podem otimizar a determinação do teor total de
isômeros C18:1 trans, minimizando a sobreposição desses (GANGULY; PIERCE, 2015).
Métodos oficiais, como Ce 1h-05 e 996.06, sugerem comprimento das colunas
capilares estendidas para 100 ou 120 m para melhor resolução do isolamento de isômeros cis /
trans (FIRESTONE, 2009a; AOAC, 2001).
Observa-se mesmo perfil de ácidos graxos encontrado nas amostras de biscoitos e
gordura vegetal. Em todas as amostras, foram identificadas prováveis estruturas do ácido
palmítico (C16:0) e esteárico (C18:0), dois ácidos graxos saturados. Quanto aos ácidos graxos
insaturados, em todas as amostras, foram identificadas estruturas prováveis de ácido oleico
(C18:1, n-9 cis) e linoleico (C18:2, n6 cis). Quanto a presença dos isômeros trans, ácido
elaídico (C18:1, n-9 trans) foi identificado e confirmado em todas as amostras. Também foi
encontrado ácido linolelaídico (C18:2, n9- trans, n12-trans) nas amostras A e B, além do
ácido trans 13-octadecenoico (C18: 1, n-13 trans) nas amostras E, F e H. Em todas as
amostras de biscoitos em que foi encontrado outro AGT, além do elaídico, foi observado, no
cromatograma, picos pequenos, sendo elaídico o pico em destaque.
Na tabela 3, são demonstradas as estruturas dos ésteres metílicos de ácidos graxos
(FAME) encontrados e nas tabelas 4 a 13 são apresentados os prováveis ácidos graxos,
identificados através de CG-EM, nas amostras de gordura vegetal hidrogenada e de biscoitos
recheados sabor chocolate.
57
Tabela 3 – Estruturas químicas dos principais ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME)
encontrados nas amostras analisadas
Provável ácido graxo Ésteres metílicos dos ácidos graxos
Ácido palmítico (C16:0)
Ácido linoleico (C18:2, n-6 cis)
Ácido oleico (C18:1, n-9-cis)
Ácido elaídico (C18:1, n9-trans)
Ácido esteárico (C18:0)
Ácido linolelaidico (C18:2, n9-
trans, n12-trans)
Ácido trans 13-octadecenoico
(C18:1, n-13 trans)
58
Tabela 4. Perfil dos principais ácidos graxos presente na gordura vegetal hidrogenada
Pico Tempo
de
retenção
(minutos)
Provável ácido graxo Índice de
similaridade*
2 20.847 ácido hexadecanoico
(ácido palmítico)
(C16:0)
94%
3 34.745 ácido cis, cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
96%
4 35,422 ácido cis 9-octadecenoico
(ácido oleico)
C18:1, n-9-cis
94%
5 36,463 ácido trans-9-octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
93%
6 38,290 ácido octadecanoico
(ácido esteárico)
(C18:0)
94%
*Expressa a precisão do resultado, quanto mais próximo de 100%, apresenta maior
confiabilidade entre a estrutura do ácido graxo encontrado e a sua identificação pela biblioteca
do aparelho.
59
Tabela 5. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado A
Pico Tempo
de
retenção
(minutos)
Provável ácido graxo Índice de
similaridade*
1 21.113 ácido hexadecanoico
(ácido palmítico)
C16:0
94%
2 34.808 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
94%
3 34.90 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
88%
4 35.021 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
92%
5 35.142 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
88%
6 35.965 ácido cis 9-octadecenoico
(ácido oleico)
C18:1, n-9-cis
94%
7 36.196 ácido trans 9-octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
93%
8 36.575 ácido trans 9-octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
91%
9 38.494 ácido octadecanoico
(ácido esteárico)
C18:0
95%
10 41.616 ácido trans, trans-9,12-
octadecadienoico
(ácido linolelaidico)
C18:2, n9- trans, n12-trans
92%
*Expressa a precisão do resultado, quanto mais próximo de 100%, apresenta maior
confiabilidade entre a estrutura do ácido graxo encontrado e a sua identificação pela biblioteca
do aparelho.
60
Tabela 6. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado B
Pico Tempo
de
retenção
(minutos)
Provável ácido graxo Índice de
similaridade*
1 21.055 ácido hexadecanoico
(ácido palmítico)
C16:0
94%
2 34.871 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
93%
3 35.8 ácido cis 9-
octadecenoico
(ácido oleico)
C18:1, n-9-cis
94%
4 36,124 ácido trans 9-
octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
93%
5 38,447 ácido octadecanoico
(ácido esteárico)
C18:0
95%
6 41,646 ácido trans, trans-9,12-
octadecadienoico
(ácido linolelaidico)
C18:2, n9- trans, n12-
trans
92%
*Expressa a precisão do resultado, quanto mais próximo de 100%, apresenta maior
confiabilidade entre a estrutura do ácido graxo encontrado e a sua identificação pela biblioteca
do aparelho.
61
Tabela 7. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado C
Pico Tempo
de
retenção
(minutos)
Provável ácido graxo Índice de
similaridade*
1 20.856 ácido hexadecanoico
(ácido palmítico)
C16:0
94%
2 34.765 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
96%
3 35.463 ácido cis 9-
octadecenoico
(ácido oleico)
C18:1, n-9-cis
94%
4 36.111 ácido trans 9-
octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
90%
5 38.281 ácido octadecanoico
(ácido esteárico)
C18:0
94%
*Expressa a precisão do resultado, quanto mais próximo de 100%, apresenta maior
confiabilidade entre a estrutura do ácido graxo encontrado e a sua identificação pela biblioteca
do aparelho.
62
Tabela 8. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado D
Pico Tempo
de
retenção
(minutos)
Provável ácido
graxo
Índice de similaridade*
1 20.966 ácido hexadecanoico
(ácido palmítico)
C16:0
95%
2 34.999 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
96%
3 35,769 ácido cis 9-
octadecenoico
(ácido oleico)
C18:1, n-9-cis
95%
4 36,267 ácido trans 9-
octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
93%
5 36,591 ácido trans 9-
octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
93%
6 38,461 ácido octadecanoico
(ácido esteárico)
C18:0
95%
*Expressa a precisão do resultado, quanto mais próximo de 100%, apresenta maior
confiabilidade entre a estrutura do ácido graxo encontrado e a sua identificação pela biblioteca
do aparelho.
63
Tabela 9. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado E
Pico Tempo
de
retenção
(minutos)
Provável ácido graxo Índice de
similaridade*
1 20.851 ácido hexadecanoico
(ácido palmítico)
C16:0
94%
2 34.735 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
96%
3 35.390 ácido cis 9-
octadecenoico
(ácido oleico)
C18:1, n-9-cis
92%
4 36.407 ácido trans 9-
octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
93%
5 37.108 ácido trans 13-
octadecenoico
(C18:1, n-13 trans)
82%
6 38.281 ácido octadecanoico
(ácido esteárico)
C18:0
94%
*Expressa a precisão do resultado, quanto mais próximo de 100%, apresenta maior
confiabilidade entre a estrutura do ácido graxo encontrado e a sua identificação pela biblioteca
do aparelho.
64
Tabela 10. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado F
Pico Tempo
de
retenção
(minutos)
Provável ácido graxo Índice de
similaridade*
2 20.791 ácido hexadecanoico
(ácido palmítico)
C16:0
94%
3 20.867 ácido hexadecanoico
(ácido palmítico)
C16:0
86%
4 34.725 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
96%
5 35.475 ácido cis 9-
octadecenoico
(ácido oleico)
C18:1, n-9-cis
95%
6 36.465 ácido trans 9-
octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
93%
7 37.133 ácido trans 13-
octadecenoico
(C18:1, n-13 trans)
92%
9 38.286 ácido octadecanoico
(ácido esteárico)
C18:0
95%
*Expressa a precisão do resultado, quanto mais próximo de 100%, apresenta maior
confiabilidade entre a estrutura do ácido graxo encontrado e a sua identificação pela biblioteca
do aparelho.
65
Tabela 11. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado G
Pico Tempo
de
retenção
(minutos)
Provável ácido
graxo
Índice de
similaridade*
1 20.927 ácido hexadecanoico
(ácido palmítico)
C16:0
94%
2 35.049 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
96%
3 35.760 ácido cis 9-
octadecenoico
(ácido oleico)
C18:1, n-9-cis
93%
4 36.275 ácido trans 9-
octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
94%
5 36.656 ácido trans 9-
octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
93%
6 38.492 ácido octadecanoico
(ácido esteárico)
C18:0
94%
*Expressa a precisão do resultado, quanto mais próximo de 100%, apresenta maior
confiabilidade entre a estrutura do ácido graxo encontrado e a sua identificação pela biblioteca
do aparelho.
66
Tabela 12. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado H
Pico Tempo
de
retenção
(minutos)
Provável ácido
graxo
Índice de
similaridade*
3 20,815 ácido
hexadecanoico
(ácido palmítico)
C16:0
94%
4 34,712 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
96%
5 35.358 ácido cis 9-
octadecenoico
(ácido oleico)
C18:1, n-9-cis
92%
6 36.362 ácido trans 9-
octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
93%
7 37.092 ácido trans 13-
octadecenoico
(C18:1, n-13
trans)
87%
8 38.249 ácido
octadecanoico
(ácido esteárico)
C18:0
95%
*Expressa a precisão do resultado, quanto mais próximo de 100%, apresenta maior
confiabilidade entre a estrutura do ácido graxo encontrado e a sua identificação pela biblioteca
do aparelho.
67
Tabela 13. Perfil dos principais ácidos graxos presente no biscoito recheado I
Pico Tempo
de
retenção
(minutos)
Provável ácido
graxo
Índice de
similaridade*
1 20.975 ácido hexadecanoico
(ácido palmítico)
C16:0
94%
2 21.017 ácido hexadecanoico
(ácido palmítico)
C16:0
93%
3 35.075 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
89%
4 35.150 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
92%
5 35.251 ácido cis cis 9,12
octadecadienoico
(ácido linoleico)
C18:2, n-6 cis
95%
6 35.901 ácido cis 9-
octadecenoico
(ácido oleico)
C18:1, n-9-cis
93%
7 36.203 ácido trans 9-
octadecenoico
(ácido elaídico)
C18:1, n9-trans
92%
8 38.599 ácido octadecanoico
(ácido esteárico)
C18:0
95%
9 56.415 ácido eicosenoico
(C20:1, n11 -cis)
93%
10 58.803 ácido eicosanoico
(C20:0)
89%
*Expressa a precisão do resultado, quanto mais próximo de 100%, apresenta maior
confiabilidade entre a estrutura do ácido graxo encontrado e a sua identificação pela biblioteca
do aparelho.
A confirmação da presença do ácido elaídico nas amostras de biscoito recheado e
gordura vegetal hidrogenada foi através da similaridade oferecida pela biblioteca do aparelho,
pelo tempo de retenção do padrão (figura 7), espectro de massas do TR médio (36.30 min) do
68
padrão (figura 8) e pela fortificação das amostras com 60 μL de solução de padrão de elaidato
de metila (100 μL/ml em hexano grau HPLC), observado nas figuras 9 e 10.
Figura 7. Zoom do TIC do padrão de elaidato de metila (visualização do TR 36.300 min)
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0
0
50
100
%
55
41 6974 97
264110123 222180152137 166 296223207 246
Figura 8. Espectro de massas do padrão de elaidato de metila (TR 36.30 min)
Apesar da comparação com o espectro de massa do padrão, sabe-se que não existe
uma característica que permite identificar a localização da dupla ligação, já que pode migrar
para qualquer posição quando a cadeia alquila é ionizada no espectrômetro de massa. Assim,
quase todos os isômeros cis e trans do C18:1, tem espectros virtualmente idênticos (CHEN et
al, 2015). Porém, com tempo de retenção do padrão da substância permite identificá-la, ao
fortificar as amostras com este padrão, observando-se o aumento da área do pico no tempo de
retenção do padrão, possibilitando identificar a presença da substância na amostra.
Figura 9. Zoom do TIC da amostra G antes de fortificação com a solução padrão de elaidato
de metila
69
Figura 10. Zoom do TIC da amostra G após de fortificação com a solução padrão de elaidato
de metila (60 μL de solução padrão)
Em todas as amostras foi identificada e confirmada a presença de ácido elaídico.
Ressalta-se que ao consultar a lista de ingredientes para detectar a presença da gordura trans,
na maioria das vezes o consumidor fica na dúvida se o componente indica presença ou
ausência desse tipo de gordura, pelo uso de denominações alternativas, observadas nas
amostras analisadas (“gordura vegetal, gordura vegetal interestificada, gordura vegetal
hidrogenada, óleos vegetais hidrogenados”). O que impossibilita a certeza da presença ou não
de AGT, já que não se sabe se sofreram o processo parcial de hidrogenação que pode formar
esses ácidos graxos.
O termo “gordura trans” pode ser encontrado na lista de ingredientes de alimentos
industrializados como gordura parcialmente hidrogenada, gordura vegetal hidrogenada, óleo
vegetal parcialmente hidrogenado, óleo vegetal hidrogenado, óleo hidrogenado e gordura
parcialmente hidrogenada ou interesterificada (GAGLIARDI; MANCINI FILHO; SANTOS,
2009).
O processo de interesterificação possibilita a produção de gorduras livres ou com teor
muito baixo de AGT, a partir do rearranjo dos ácidos graxos (AG) nas ligações éster do
glicerol e consequente modificação do ponto de fusão e de cristalização da gordura (LOPEZ-
HERNANDEZ, 2007). A indústria tem utilizado, como alternativa ao processo de
hidrogenação, o processo de interesterificação enzimática, que produz alimentos livres de
isômeros trans (CUNNINGHAM, 2007). No entanto, na amostra E foi observada a descrição
de gordura vegetal interestificada, mas esta amostra não é livre de AGT, já que foi
identificada, pela análise de CG-EM, presença de ácido elaídico e ácido trans 13-
octadecenoico.
70
Em relação aos óleos utilizados na fabricação dos biscoitos, as marcas apenas
informam a presença de gordura vegetal hidrogenada ou interesterificada, sem especificar o
tipo do processo aplicado (parcial ou completo) e os tipos de óleos contidos nestas misturas,
conforme é descrito na tabela 14.
Segundo Stroher et al (2012), a presença de C16:0 e C18:1 sugere gordura de palma.
Enquanto no óleo de girassol, milho e soja em sua composição química apresentam como
ácido graxo insaturado majoritário o ácido linoleico (C18:2, n-6 cis) (JORGE et al, 2005). No
entanto, nenhum dos rótulos foi especificado qual gordura vegetal foi usada, o que
impossibilita identificar a origem da gordura dos biscoitos analisados.
Apesar de não ser informação obrigatória em rótulo, a declaração dos tipos de óleos
utilizados é de interesse para o consumidor, pois uma quantidade inferior a 0,1 g de AGT por
porção pode ser legalmente considerada nula (BRASIL, 2012), mas pode ser significante
quando a ingestão é maior que uma porção de biscoito.
Tabela 14. Amostras analisadas e os ingredientes declarados nos respectivos rótulos.
AMOSTRAS INGREDIENTES DECLARADOS NO RÓTULO
A Açúcar, gordura vegetal, maltodextrina, farinha de trigo rica com
ferro e ácido fólico, cacau em pó, amido de milho, sal, emulsificante
(lecitina de soja), ácido cítrico, fermento químico, bicarbonato de
sódio e aromatizante.
B Farinha de trigo rica com ferro e ácido fólico, açúcar, gordura
vegetal, cacau em pó, leite em pó, açúcar invertido, maltodextrina,
amido de milho, sal, emulsificante (estearoil-2-tactil lactato de
cálcio e lecitina de soja), fermento químico, bicarbonato de sódio e
acidulantes (ácido cítrico e aromatizante).
C Farinha de trigo rica com ferro e ácido fólico, açúcar, gordura
vegetal, sulfato de zinco, cacau em pó, amido de milho, soro de
leite, carbonato de cálcio, sal, fumarato ferroso, vitaminas (PP, b6,
b2, açúcar), bicarbonato de sódio, lecitina de soja, acidulantes
(ácido cítrico e aromatizante).
D Farinha de trigo rica com ferro e ácido fólico, recheio sabor
chocolate (açúcar, gordura vegetal, cacau em pó, soro de leite,
liquor de cacau, aromatizante, emulsificante (lecitina de soja e
triesterato de sorbitana), açúcar, gordura vegetal, açúcar invertido,
farinha de rosca, cacau em pó, sal, corante caramelo, fermento
químico (bicarbonato de sódio e bicarbonato de amônio,
emulsificante (lecitina de soja).
E Farinha de trigo rica com ferro e ácido fólico, açúcar, gordura
vegetal interestificada, açúcar invertido, amido de milho, sal iodado,
acidulantes (ácido cítrico), fermento químico bicarbonato de sódio e
bicarbonato de amônio, lecitina, corante caramelo e aroma sintético
idêntico ao natural de cacau com baunilha.
F Farinha de trigo rica com ferro e ácido fólico, açúcar, gordura
71
vegetal hidrogenada, creme de milho, cacau em pó, açúcar
invertido, sal, fermento químico bicarbonato de sódio e bicarbonato
de amônio, pirofosfato, ácido de sódio, corantes naturais de
caramelo e de urucum, emulsificante lecitina de soja e aromatizante.
G Farinha de trigo rica com ferro e ácido fólico, açúcar, gordura
vegetal hidrogenada, amido de milho e ou fécula de mandioca,
açúcar invertido, cacau em pó, sal refinado, fermento químico
bicarbonato de sódio e bicarbonato de amônio, emulsificante
lecitina de soja, aromatizante e corante caramelo.
H Farinha de trigo rica com ferro e ácido fólico, açúcar, gordura
vegetal hidrogenada, amido de milho e ou fécula de mandioca,
açúcar invertido, cacau em pó, soro do leite em pó, sal refinado,
fermento químico bicarbonato de sódio, bicarbonato de amônio e
pirosfosfato de sódio, emulsificante lecitina de soja, aromatizante e
corante caramelo e natural carmim.
I Farinha de trigo rica com ferro e ácido fólico, açúcar, gordura
vegetal, óleo vegetal, cacau, açúcar invertido, amido de milho, sal,
fermento químico bicarbonato de sódio, bicarbonato de amônio e
fosfato monocálcico, corante caramelo, emulsificante lecitina de
soja, ésteres de mono e diglicerídeos de ácidos graxos com ácido
diacetil tartárico e mono e diglicerídeos de ácidos graxos e
aromatizante.
GORDURA
VEGETAL
HIDROGENADA
Óleos vegetais hidrogenados, antioxidante BHT e ácido cítrico.
No estudo de Galdino e colaboradores (2010), ao analisar rótulos de 25 pacotes de
biscoitos recheados, de 4 marcas diferentes, verificaram que biscoitos contendo gordura
vegetal como ingrediente possuíam maior quantidade de gordura saturada, enquanto biscoitos
produzidos com gordura vegetal hidrogenada apresentavam menor quantidade de AGS e
maior quantidade de AGT. As amostras fabricadas com gordura vegetal e margarina
apresentaram 0 g de AGT na porção de 30 g. Todas as análises realizadas basearam-se nas
informações nutricionais contidas nas embalagens dos produtos. A ausência de análise
química para determinar o conteúdo de gorduras dos biscoitos estudados foi uma limitação do
estudo.
Aued-Pimentel et al (2016) analisaram, por cromatografia gasosa, amostras de
alimentos com a alegação nos rótulos de “0% de gordura trans” (incluindo salgadinhos,
batatas fritas, sorvetes, produtos de panificação, bebida láctea, creme vegetal e macarrão
instantâneo), os autores destacaram que somente uma amostra apresentou claramente na lista
de ingredientes descrita no rótulo a presença de gordura vegetal parcialmente hidrogenada.
Os conteúdos reduzidos de AGT observados na maior parte das amostras, especialmente em
produtos de panificação, indicam que as indústrias alimentícias brasileiras estão de acordo
72
com as recomendações da Organização Mundial de Saúde para reduzir o conteúdo trans dos
alimentos o máximo possível.
5.2.1 Quantificação do ácido graxo trans elaídico por CG- EM
O ácido elaídico (C18:1, n9t) é produzido por isomerização do ácido oleico no
processo de hidrogenação (BROUWER; WANDERS, KATAN, 2010). Este é um dos que
surgem com mais frequência, devido ao fato do ácido oleico ser o AGI mais comum.
Em estudo dos gêneros alimentícios que continham óleos vegetais parcialmente
hidrogenados, o ácido elaídico foi o predominante dos AGT em comparação com os outros
isômeros (GAO et al, 2017).
Foi elaborada a curva de calibração, conforme observado na figura 11, para quantificar
o ácido elaídico, identificado em todas amostras por CG-EM.
Figura 11. Curva de calibração do ácido elaídico (área versus concentração em μg/mL)
Através da equação de regressão obtida pela curva de calibração (y= 2470739,6x-
13256911,03, com R²= 0,9989), em que x é a concentração do padrão e y é a área do pico, foi
quantificado o ácido elaídico. A análise quantitativa das amostras é mostrada na tabela 15. O
ácido elaídico variou nas amostras de 0,18± 0,005 a 4,76 ± 0,05 g por 100g de gordura
(extraída do biscoito) e 0,03 ± 0,01 a 0,85 g ± 0,01 por 100 g de biscoito. Observou-se
variabilidade nos conteúdos de ácido elaídico nas diferentes marcas de biscoitos recheados de
chocolate. As variações podem estar relacionadas às alterações nas formulações em função da
utilização de diferentes tipos de gordura.
73
Gagliardi, Mancini Filho e Santos (2009) analisaram biscoitos recheados doce por CG-
DIC e encontraram concentrações de ácidos elaídico e linoelaídico, em média, de 0,10 e 0,13
g/100g de biscoito, respectivamente, e média de 0,03g e 0,04 g/por porção, respectivamente.
Srebernich, Gonçalves e Baggio (2013) ao analisar por CG-DIC o perfil de AGT de 8
marcas de biscoito recheados observaram uma heterogeneidade nas concentrações de ácido
elaídico, que variaram de 0,02 g/ por 100 g de biscoito recheado a 3,05 g/ por 100 g.
Na gordura vegetal hidrogenada, foi encontrada concentração de ácido elaídico média
de 35,06±1,23 g/100 g de gordura. A literatura relata que a gordura vegetal hidrogenada
contém entre 29,1 e 39,7 % de ácido elaídico (MARTIN et al, 2007), o que está em
concordância com o resultado encontrado no presente trabalho.
Tabela 15. Concentrações de ácido elaídico (AE) por 100 g de gordura, por 100 g de biscoito
e por porção de biscoito recheado (30 g) (Análises efetuadas por CG-EM).
Amostras de
biscoitos
AE analisado (100
g de gordura)
AE analisado
(100g de biscoito)
AE analisado
(porção de 30g de
biscoito)
A 0,85±0,02 0,20±0,01 0,06±0,004
B 0,41±0,01 0,09±0,03 0,03±0,01
C 0,18± 0,005 0,03±0,01 0,01±0,004
D 0,86±0,08 0,12±0,02 0,05±0,008
E 1,30±0,05 0,16±0,01 0,05±0,002
F 4,76±0,05 0,85±0,01 0,26±0,004
G 4,26±0,01 0,60±0,02 0,18±0,008
H 1,07±0,04 0,17±0,01 0,05±0,004
I 0,64±0,04 0,09±0,07 0,03±0,03
Das 9 amostras de biscoitos analisadas, as amostras A, B, C e I declararam não conter
AGT na porção, sendo amostras em que foram encontradas baixas concentrações de ácido
elaídico (menor que 0,1 g/ por porção). De acordo com RDC nº 54, de 12 de novembro de
2012, da ANVISA, alimentos com teor de ácidos graxos trans menor do que 0,1 g/porção e
com baixo teor de gorduras saturadas (máximo de 1,5 g da soma de gorduras saturadas e
74
trans) podem conter alegação de “zero trans” (BRASIL, 2012). Nas amostras F e G, a
presença do ácido elaídico extrapola o limite exigido para alegar não conter AGT na porção,
no entanto, são marcas de biscoitos em que a presença dos AGT foi declarada. Amostras E e
H declararam, no rótulo, a presença de AGT, no entanto, foram encontradas concentrações
menores que 0,1 g/ porção de ácido elaídico, mas através da análise por CG-EM, foi
identificada, além do ácido elaídico, também a presença de outro isômero trans (C18:1, n13
trans), este não quantificado, apenas identificado, com pico menor no cromatograma que o do
ácido elaídico. Na amostra D, foi declarado presença de AGT por porção no rótulo, no
entanto, apenas encontrado na análise por CG-EM o ácido elaídico, como AGT, em
concentração menor que 0,1 g/por porção.
De acordo com Voci, Enes e Slater (2008), o consumo de biscoitos, principalmente
por crianças e adolescentes, não se limita a uma porção. E, sugere um alerta à tendência de se
consumir quantidade de AGT que ultrapasse as recomendações da OMS de 1% do valor
energético diário, o que representa 2 g/dia, considerando-se uma dieta de 2.000 kilocalorias.
5.3 AVALIAÇÃO DA ANÁLISES DE AGT EM BISCOITO RECHEADO POR FT-IR-
ATR
A FT-IR-ATR é considerada uma técnica útil quando se pretende efetuar análise não
destrutiva de amostras, através de uma caracterização imediata dos constituintes da amostra
em estudo (RAHMANIA; SUDJADI; ROHMAN, 2015).
A técnica de espectroscopia FT-IR, desenvolvida sem pré-tratamento de amostra,
poderia estimar o teor de ácidos graxos trans em 5 min enquanto que outros métodos de
controle exigiria pelo menos 2- 3 h até mesmo para extração de lipídios, de acordo com o que
foi indicado por Cho et al (2011).
FT-IR- ATR foi introduzido para medir a gordura trans em óleos e gorduras. Esta
técnica requer extração anterior de gordura de amostras de alimentos, enquanto a posterior
derivatização e uso de solventes tóxicos não seriam necessários (MOSSOBA et al, 2011).
Região do espectro de infravermelho entre 961 e 967 cm-1
pode detectar um ligação
dupla trans devido à deformação de ligações C-H adjacentes (GALVÍN, et al, 2016).
Segundo Rahmania, Sudjadi e Rohman (2015), a banda em 968 cm-1
revelou a
presença de um isômero trans de um éster metílico de ácido graxo (FAME).
75
De acordo com os métodos oficiais de AOCS, os ácidos graxos trans em
triacilgliceróis podem absorver próximo a região de 973 cm-1
, quando AGT estão em baixas
concentrações, menor que 5 % do total de gordura (SONG et al, 2015).
Os equivalentes de retinol adicionados para o enriquecimento de margarina podem
interferir com bandas trans em 964 cm-1
a 966 cm-1
. Mas o conteúdo de equivalente de retinol
das margarinas é aproximadamente 0,001%, em relação à gordura total (TYBURCZY et al,
2012).
As ligações duplas conjugadas não são interferentes da detecção de AGT por FT-IR, já
que apresentam bandas de absorção próximas de 985 cm-1
e 950 cm-1
(conjugado cis / trans
ou trans / cis, respectivamente) e perto de 990 cm-1
(conjugado trans / trans) (MOSSOBA et
al, 2007).
Inicialmente, as 9 amostras de biscoitos homogeneizadas e a gordura vegetal
hidrogenada, sem nenhum pré-tratamento, foram colocadas diretamente no cristal de ATR do
espectrômetro de infravermelho utilizado para análise. Foi possível detectar, na gordura
vegetal hidrogenada, a presença da banda em 964 cm-1
, como pode ser visto na figura 12. Para
os biscoitos homogeneizados, a banda em 966 cm-1
foi detectada em somente duas amostras
(G e H), como pode ser observado na figura 13. No entanto, mesmo nas amostras em que foi
identificada a banda de interesse, não foi possível quantificar, visto que a absorção de
radiação infravermelha de substâncias das amostras se sobrepõe à absorção na região das
ligações duplas trans.
Resultado diferente do obtido no presente trabalho foi encontrado por Cho et al
(2011), que identificaram e quantificaram AGT em batata-frita utilizando a espectroscopia de
FT-IR-ATR, com método sem extração de ácido graxos, ou seja, utilizando a amostra
homogeneizada sem nenhum pré-tratamento. A FT-IR- ATR sem extração da gordura da
amostra foi considerada por estes autores como uma técnica confiável. Considerando os
resultados de Cho et al (2011) e os resultados do presente trabalho, pode-se inferir que a
matriz do alimento influencia na análise de AGT por FT-IR-ATR
76
Figura 12. Espectro de FT-IR-ATR de Gordura vegetal hidrogenada, analisada por FT-IR-
ATR sem pré-tratamento.
77
78
79
Figura 13. Espectros de FT-IR-ATR de amostras de biscoitos recheados homogeneizados (A,
B, C, D, F, G, H, I) analisadas por FT-IR-ATR sem pré-tratamento.
Tanto nas amostras de extratos lipídicos de biscoitos e de gordura vegetal hidrogenada
(figuras 14 e 15) como amostras na forma de FAME obtidos de gordura de biscoitos e de
gordura vegetal hidrogenada (figura 16 e 17), foram detectadas bandas em 970 cm-1
, 968 cm-1
e 966 cm-1
, consideradas bandas características de AGT, de acordo com Song et al (2015),
Rahmania, Sudjadi e Rohman (2015), Galvín et al (2016), respectivamente.
80
81
82
Figura 14. Espectros de FT-IR-ATR de extratos gordurosos de biscoitos recheados de
chocolate
83
84
Figura 15. Espectros de FT-IR-ATR de amostras de biscoitos recheados de chocolate na
forma de FAME.
85
Figura 16. Espectro de FT-IR-ATR de gordura vegetal hidrogenada na forma de FAME.
Todas as amostras foram fortificadas para confirmação da banda de AGT, com padrão
elaidato de metila para amostras na forma de FAME e, para as amostras como extrato
gorduroso, com gordura vegetal hidrogenada, em que foi identificada, pela análise de CG-
EM, apenas a presença de ácido elaídico, como AGT.
Nas figuras 17 e 18 são demostrados exemplos das fortificações. Através da
fortificação, foi observado que intensidade do pico a 966 cm-1
depende diretamente da
concentração de AGT presente na amostra. Com aumento do valor de absorbância (pelo
aumento da área), ao acrescentar as soluções de fortificações.
Figura 17. Banda de absorção a 966 cm-1
do extrato da amostra E e após fortificação
com gordura vegetal hidrolisada (GV)
86
Figura 18. Banda de absorção a 966 cm-1
da amostra E, como FAME e após
fortificação com padrão de elaidato de metila (AE).
5.3.1 Quantificação de ácidos graxos trans por FT-IR- ATR
Para a curva de calibração, utilizaram-se misturas de gordura vegetal hidrogenada e
óleo de soja (este sem banda 966 cm-1
, como ilustrado na figura 19), o que garante não
interferência do óleo de soja na análise, conforme descrito na seção de metodologia.
A intensidade de uma banda de absorção é proporcional à concentração do grupo
funcional que a provocou, logo a quantidade de AGT presente nas amostras pode ser
determinada através da curva de calibração, que se traduz pela intensidade da banda versus
concentração (MOHD; MOHAMAD; ABDUL, 2017).
Para quantificação por FT-IR-ATR é necessária a diluição da amostra em uma gordura
de referência, livre de gordura trans, com ácidos graxos com composição similar à amostra de
interesse, sendo que, para amostras com composição desconhecida, é sugerido o uso de óleo
de soja para ser o diluente da gordura com AGT na construção da curva de calibração
(BANSAL et al, 2009).
87
Figura 19. Espectro de FT-IR-ATR de óleo de soja
O método oficial (AOAC 2000.10) para medir AGT indica adição dos padrões
trielaidina (C18: 1, n9t; TE) a trioleína (C18:1; n9c; TO). O teor total de AGT das amostras
expresso por % na gordura total, é determinado a partir da função de regressão linear da curva
padrão de calibração, utilizando a área da banda de absorção a 966 cm-1
(AOAC, 2005).
Entretanto, no presente trabalho, foi usada a gordura vegetal hidrogenada como padrão
secundário, diluída em óleo de soja, de modo a compor misturas gordurosas contendo de 0,43
a 35% de AGT na gordura, conforme foi descrito na seção de metodologia. Isto foi necessário
em função da não possibilidade de aquisição dos padrões de trioleína e trielaidina pelo nosso
laboratório.
Na figura 20 é demostrada a curva de calibração usada para quantificar AGT nas
amostras de extratos lipídicos dos biscoitos. Pelo método de FT-IR, obtém-se, apenas, o teor
de gorduras trans total, sem determinar o perfil de ácidos graxos (GAO et al, 2017).
88
Figura 20. Curva de calibração para quantificar AGT nas amostras de extratos lipídicos
Na figura 21, encontra-se a curva de calibração usada para quantificar as amostras na
forma de FAME.
Figura 21. Curva de calibração para quantificar AGT nas amostras FAME
O teor de AGT total foi calculado a partir da função de regressão linear das curvas de
calibração, em percentual de ácido elaídico na mistura de gordura vegetal hidrogenada e óleo
de soja para as amostras de extratos lipídicos. E em percentual de elaidato de metila na
mistura em forma FAME de gordura vegetal hidrogenada e óleo de soja para as amostras
FAME, substituindo o valor da área integrada da banda trans na equação de regressão linear
pelo Y.
89
Não foi possível detectar os AGT por meio da curva de calibração versus a altura da
banda 966 cm-1
, como observa-se na figura 22, apenas versus a área da banda, conforme é
recomendado pelo método AOAC 2000.10 (AOAC, 2005). A altura da banda não apresentou
variação proporcional à variação de concentrações diferentes de ácido elaídico na mistura.
O coeficiente de determinação (R²), calculado após medições experimentais usando o
método matemático conhecido como regressão linear, é o parâmetro que indica estimativa da
qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximos de 1,0 menor a dispersão do conjunto
de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados
(ARAGÃO; VELOSO; ANDRADE, 2009). Nas curvas de calibração construídas versus a
área da banda 966 cm-1
, observa-se R² próximo de 0,99 enquanto na curva de calibração
construída versus a altura da banda 966 cm-1
, R² abaixo de 0,90. O INMETRO recomenda um
coeficiente de correlação acima de 0,90 , já a ANVISA o R² de 0,99 (BRASIL, 2003c;
BRASIL, 2003d).
Resultados diferentes foram encontrados por Cho et al (2011), que por meio da
execução da curva de calibração, quantificaram os AGT em relação aos ácidos graxos totais
versus a altura da banda 966 cm-1
, como por meio da área da banda 966 cm-1
.
Estudo feito por Khan; Hassan, Rauf (2017) também relacionou a altura da banda de
absorvência com a intensidade dos picos a 966 cm-1
para calcular AGT.
Figura 22. Curva de calibração para quantificar AGT nas amostras de extrato lipídicos
(% de ácido elaídico versus a altura da banda 966 cm-1
)
As concentrações de ácido elaídico encontradas nas amostras situaram-se entre 0,44±
0,01 e 4,78 ± 0,04 g/100g de gordura quando medida por FT-IR- ATR com extração (bligh
90
dyer) e entre 0,45±0,02 e 4,72 ± 0,42 g/100g de gordura de amostras após a conversão a
FAMES e cálculos descritos.
Ao comparar a quantificação pelo método FT-IR-ATR extrato lipídico com FT-IR-
ATR com as amostras na forma de FAME, apenas houve diferença significativa para a
amostra C, com resultados expressos em ácido elaídico g/100g de gordura (valores
respectivos de 0,44 ±0,005 e 0,64±0,005) como ácido elaídico g/100g de biscoito (0,08±0,02
e 0,11±0,01, valores respectivos). Valores maiores foram encontrados para a amostra C na
forma de FAME. Para as demais oito amostras não houve diferença significativa (p˃0.05),
como observado nas tabelas 16 e 17.
Tabela 16. Ácidos graxos trans analisados (g/100g de gordura) por FT-IR-ATR extrato e FT-
IR-ATR FAME
Amostras de
biscoito recheados
FT-IR-ATR
Extrato
(g/100g de
gordura)
FT-IR-ATR
FAME
(g/100g de
gordura)
A 0,84±0,04ᵃ 0,87 ± 0,04ᵃ
B 0,44± 0,01ᵃ 0,45 ±0,01ᵃ
C 0,44±0,005ᵃ 0,64± 0,005ᵇ
D 0,91±0,10ᵃ 0,86±0,06ᵃ
E 1,46±0,11ᵃ 1,28±0,11ᵃ
F 4,78±0,04ᵃ 4,72 ± 0,42ᵃ
G 4,24±0,01ᵃ 4,18 ±0,08ᵃ
H 1,01 ±0 0,05ᵃ 1,06±0,05ᵃ
I 0,71±0,04ᵃ 0,71±0,06ᵃ
*Valores de média e desvio padrão com letras diferentes na mesma linha indicam diferença
significativa (p<0,05).
91
Tabela 17. Ácidos graxos trans analisados (g/100g de biscoito) por FT-IR-ATR extrato e FT-
IR-ATR FAME
Amostras de
biscoito recheados
FT-IR-ATR
Extrato
(g/100 g de
biscoito)
FT-IR-ATR
FAME
(g/100 g de
biscoito)
A 0,20±0,01ᵃ 0,21±0,02ᵃ
B 0,094±0,01ᵃ 0,11±0,01ᵃ
C 0,08±0,02ᵃ 0,11±0,01ᵇ
D 0,14±0,03ᵃ 0,13±0,01ᵃ
E 0,18±0,02ᵃ 0,16±0,02ᵃ
F 0,86±0,01ᵃ 0,85±0,20ᵃ
G 0,59±0,01ᵃ 0,59± 0,10ᵃ
H 0,16±0,01ᵃ 0,17±0,01ᵃ
I 0,10±0,01ᵃ 0,11±0,06ᵃ
*Valores de média e desvio padrão com letras diferentes na mesma linha indicam diferença
significativa (p<0,05).
No processo de hidrólise de glicerídeos e esterificação de ácidos graxos pode ocorrer
uma má conversão de FAME e ocasionar superestimação da gordura total do alimento. A
hidrólise seguida de extração com éter possibilita a extração de lipídeos neutros e outros
constituintes que não compõem a gordura. A presença de não lipídeos no momento do
processo de derivação pode levar a interferências com lipídeos e isso irá causar erros
potenciais com altos perfis de variáveis (HARMANESCU; GERGEN, 2012).
Além disso, os AG livres podem permanecer parcialmente não reagidos e a hidrólise
ou presença de vestígios de água também levar a baixas recuperações de FAME
(BASCONCILLO; MCCARRY, 2008).
A possibilidade de quantificar as amostras como extrato, sem a etapa de derivatização,
necessária nas metodologias envolvendo cromatografia, permite obter resultados quantitativos
favoráveis. Favorece a redução de materiais tóxicos, torna mais rápida a análise desejada, com
92
menor custo e ainda evita dificuldades processuais, como a conversão incompleta das AG em
FAME.
Os métodos IR foram rotineiramente utilizados na indústria de gorduras e óleos para
determinar o conteúdo trans em triacilgliceróis ou ésteres metílicos de ácidos graxos. No
entanto, a banda IR perto de 935 cm-1
, atribuída ao grupo -COOH em ácidos graxos livres, foi
relatada como causando uma interferência indesejada e, portanto, sugere-se primeiro ser
esterificadas, particularmente em níveis baixos (menos de 15%) (SONG et al, 2015).
Avanços com a transformada de Fourier tornaram possível determinar não só o teor
total de ácidos graxos trans de uma gordura ou óleo, mas também sua composição de ácidos
graxos sem a necessidade de derivatização prévia de derivados voláteis como necessário para
análise CG (MOSSOBA et al, 2007).
Baixas concentrações de AGT foram detectadas nas amostras de biscoito. Resultado
semelhante foi encontrado por Song et al (2015) que afirma que FT-IR-ATR pode determinar
menos de 1% gordura trans em gorduras comestíveis e óleos, incluindo palmeiras, amendoim,
soja e óleo de girassol.
No estudo feito por CHO et al (2011), detectaram concentrações baixas de AGT nas
batatas fritas (entre 0,10 ± 0,01% e 4,05 ± 0,26% do total de ácidos graxos (g/100g de batata
frita), sem diferença significativa entre os métodos FT-IR-ATR de amostras sem pré preapro e
FT-IR-ATR de amostras com extração.
No entanto, métodos oficiais de AOAC e AOCS são aplicados para determinação
quantitativa de AGT acima 5g/100 g de gordura e 1 g /100 g de gordura, respectivamente
(AOAC, 2005; FIRESTONE, 2009b).
As análises de FT-IR-ATR no presente trabalho foram feitas com equipamento de
relação sinal/ruído de 60:1, o que pode ter contribuído para os resultados obtidos, visto que
uma boa relação sinal/ruído é imprescindível para uma boa análise, reduz as flutuações
decorrentes da análise instrumental (ruído aleatório), como mistura de erros experimentais de
medida, de amostragem e de outras fontes de variabilidade (FERREIRA, 2015).
O alto índice de refração do elemento ATR é adequado para obtenção de espectros de
excelente qualidade para a maior parte das substâncias, com grau de penetração da radiação
na amostra em torno de 1-2 µm. O uso de selenito de zinco (ZnSe) com fina camada de
diamante na superfície, ambos com mesmo índice de refração (2,4), torna o cristal
quimicamente inerte e resistente mecanicamente aos riscos durante as análises (MOSSOBA et
al, 2011). A dureza e a estabilidade química do diamante permite a obtenção direta de
espectros de material em fase líquida e sólida, com bom contato entre a amostra e o cristal
93
(SIQUEIRA; DUTRA; DINIZ, 2008). O método oficial 2000.10 sugere o uso de ZnSe como
cristal (AOAC, 2005).
Os resultados obtidos no presente trabalho, em que notou-se a interferência da matriz
da amostra, ao passo que permitiu a quantificação de baixas concentrações de AGT nas
amostras, indica a importância de se efetuarem outros experimentos, com o objetivo de
validar a técnica de FT-IR-ATR, com o cristal usado neste trabalho, para diversas outras
amostras de alimentos.
5.4 COMPARAÇÃO ENTRE MÉTODOS
Há necessidade de abordar as diferenças no conteúdo total de AGT que são obtidas por
meio de técnicas cromatográficas e espectroscópicas. Problemas podem estar relacionados a
picos de AGT não identificados pelo método de CG, assim como compostos não lipídicos
como interferentes na absorção por FT-IR-ATR em algumas matrizes alimentares
(MOSSOBA et al, 2009).
Ao comparar a quantificação pelos métodos CG-EM (extrato via Bligh Dyer (1959) e
posterior derivatização via método de Hartaman Lago (1973), FT-IR- ATR (amostras de
extratos) e FT-IR- ATR (amostras na forma de FAME), foram observados valores baixos de
ácido elaídico/ácidos graxos trans detectados pelos diferentes métodos. Também foi
observado nos resultados entre as marcas de biscoitos analisados, o que indica a utilização de
gorduras diferentes quanto às suas composições.
Observou-se que as embalagens dos produtos analisados passam de 100 g do produto
(de 125g a 200g peso líquido), contribuindo para o maior consumo. Assim, biscoitos de
qualquer uma das marcas, quando consumidos em quantidades maiores que as porções
descritas no rótulo, podem levar a ultrapassar os limites recomendados para ingestão de
ácidos graxos trans.
Cabe destacar que, a quantidade de AGT varia de forma significativa em diferentes
tipos de alimentos industrializados e até mesmo dentro de uma mesma categoria de produto.
Essa variabilidade está associada às condições de hidrogenação e ao tipo de matéria-prima
utilizada (ESTADELLA et al, 2013).
Os resultados atuais referentes aos ácidos graxos trans e ácido elaídico nos biscoitos
recheados mostram uma tendência à redução de gorduras trans nos produtos industrializados,
sendo um ponto positivo com relação à saúde do consumidor. Resultados semelhantes foram
encontrados por Pinto et al (2016) e Stroher et al (2012).
94
O trabalho realizado por Monge-rojas (2017) afirma que as indústrias alimentícias que
atuam na America Latina têm se esforçado para reduzir a utilização de gorduras trans em seus
produtos, tendo havido, em alguns deles, a supressão total desse componente em sua
formulação.
Uma pesquisa de dois anos de fornecedores especializados elaborada pela Associação
Brasileira da Indústria de Biscoitos (ANIB) demonstrou que 65% dos biscoitos disponíveis
no mercado brasileiro já estão livres de trans (PRIEGO-CAPOTE et al, 2007).
Um estudo avaliou a composição em ácidos graxos de cinco biscoitos da Malásia e
verificou que tais produtos eram livres de ácidos graxos trans ou que a quantidade era muito
pequena; constataram também que esses biscoitos eram produzidos com óleo de palma em
substituição à gordura hidrogenada (NEO; TAN; ARIFFIN, 2007).
Quando Gagliardi; Mancini-Filho e Santos (2009) avaliaram a composição nutricional
de produtos alimentícios com alegação de zero gordura trans, encontraram redução de
lipídeos em alimentos como margarinas, biscoitos doces, biscoitos salgados, batatas fritas e
lanches tipo hambúrguer de redes de fast-food, mas não a sua ausência, como os
consumidores acreditam ao comprar o produto.
Diferenças significativas entre as três metodologias foi encontrado apenas na análise
da amostra C. Nas demais amostras, não houve diferença significativa, como pode ser
observdo na figura 23.
Figura 23. Comparação da quantidade de ácido elaídico/ácidos graxos trans em biscoito
recheado sabor chocolate usando os diferentes métodos CG-EM, FT-IR-ATR extrato e FT-IR-
ATR com amostras na forma de FAME. A presença de * indica diferença significativa entre os três
métodos (p <0,05).
95
A amostra C apresentou menor valor de ácido elaídico, pelo método CG-EM. Essas
discrepâncias entre CG e IR podem ser atribuídas a quantidades relevantes de gorduras
saturadas que podem interferir nos espectros FT-IR- ATR observados para gorduras trans
(MOSSOBA et al, 2007).
Diversos estudos encontraram diferença significativa entre FT-IR-ATR e CG-DIC, no
entanto, poucos trabalhos correlacionaram FT-IR-ATR com CG-EM.
Diferenças significativas nos resultados obtidos por FT-IR- ATR e CG-DIC foram
encontradas para óleos com um teor de gordura trans <2% da gordura total, em que a análise
por espectroscopia FT-IR- ATR de bancada produziu um teor de gordura trans
consistentemente maior (TYBURCZY et al, 2012).
Juanéda, Ledoux, Sebédio (2007) e Costa Filho (2014) também identificaram uma
superestimação, pelo método FT-IR, para as gorduras e óleos com teor de gordura trans <2%
da gordura total. A superestimação é justificada pelos sinais em parte, a partir de gorduras
saturadas ou por constituintes de não ácidos graxos (COSTA FILHO, 2014).
Acredita-se que certos constituintes de gorduras e óleos comestíveis poderiam
contribuir para a resposta a 966 cm-1
e aumentar erroneamente o teor aparente de gordura
trans e gerar as discrepâncias encontradas nos resultados comparativos entre os métodos
(MOSSOBA et al, 2011).
Resultado diferente foi encontrado por Cho et al (2011) que encontrou coerência nos
resultados entre FT-IR-ATR e CG-EM para quantificar quantificar ácidos graxos trans em
batata-frita.
Embora os métodos de CG forneçam informações detalhadas sobre a composição de
ácidos graxos, o método FT-IR- ATR é uma ferramenta de escolha para a determinação rápida
de AGT em óleos e gorduras.
A aplicabilidade dos métodos AOAC 996.01 e 996.06, para determinação de gordura
total e ácidos graxos, visando à informação na rotulagem nutricional já é comprovada para
diversas matrizes de alimentos com variadas quantidades de gordura (até níveis baixos como
0,5%, em percentagem da gordura total) (SATCHITHANANDAM et al, 2004). Para FT-IR-
ATR, Mossoba et al (2011) sugerem que a natureza da matriz da amostra é o principal
determinante para quantificação, ao em vez da sensibilidade do instrumento.
96
6. CONCLUSÃO
A aplicabilidade da técnica de FT-IR-ATR, no extrato lipídico e nas amostras FAME,
para identificar os AGT e quantificar o ácido elaídico (AGT majoritário nas amostras) foi
comprovada por meio das análises realizadas.
Não houve diferença significativa entre as três metodologias avaliadas CG-EM, FT-
IR- ATR no extrato lipídico e FT-IR-ATR de amostras FAME, o que viabiliza a análise mais
rápida, por FT-IR-ATR em extrato de amostras de biscoitos recheados.
Ao analisar as amostras sem pré preparo, não foi viável a utilização do método de FT-
IR-ATR, visto que a absorção de radiação infravermelha de substâncias da amostra se
sobrepõe à absorção na região das ligações duplas trans, o que demonstra que a matriz do
alimento pode influenciar na sua análise.
Observou-se concentrações de ácido elaídico baixas nos biscoitos recheados de
chocolate, no entanto, não sua ausência. A declaração “zero trans” por porção no rótulo não
significa não conter esse tipo de gordura, mas expressa que uma porção do alimento não
ultrapassa o valor recomendado (0,1g por porção), mas quando o consumo for superior à
quantidade da porção, pode ocorrer uma ingestão considerável desses compostos.
Ressalta-se, ainda, ao consultar a lista de ingredientes para detectar a presença de
AGT, o uso constante de denominações alternativas e informações incompletas quanto ao
processo aplicado a gordura, gera dificuldades em considerar apenas tais informações para
determinar a presença ou ausência de AGT em produtos alimentícios.
É necessário que a declaração dos nutrientes seja mais objetiva, de modo a minimizar
dúvidas quanto ao tipo de lipídeo empregado nos produtos.
A variação de lipídeos totais e de ácido elaídico entre as marcas de biscoitos indica a
utilização de gorduras muito diferentes quanto às suas composições. Sendo de suma
importância dispor de métodos analíticos rápidos e simples que disponibilizem informação
correta ao consumidor, garantido o seu direito de escolha de alimentos saudáveis.
97
7. PERSPECTIVAS FUTURAS
Aspecto importante a ser observado e analisado com a redução do ácido elaídico nas
amostras, consiste na substituição de óleos insaturados por gorduras saturadas, sendo
necessário analisar os ácidos graxos saturados e a analisar os AGT totais calculados pela soma
do ácido elaídico (C18:1,n9 trans), ácido vacênico (C18:1,n11 trans) e ácido linolelaidico
(C18:2, n9, n12, trans, trans) nas amostras de biscoitos recheados.
Reforça-se a necessidade de avaliação e validação das metodologias de CG-EM e FT-
IR-ATR para análise de AGT em outras matrizes alimentícias, que são bem consumidos pela
população, como margarinas, biscoito doce recheado, biscoito salgado sem recheio, batata
frita, sorvete, entre outros. Isso possibilitará a construção de ferramentas efetivas para a
análise, identificando as peculiaridades e influências das matrizes no processo.
98
8. REFERÊNCIAS BLIBLIOGRÁFICAS
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110
9. ANEXOS I
Cromatograma Gordura Vegetal hidrogenada
Cromatograma Biscoito A
111
Cromatograma Biscoito B
Cromatograma Biscoito C
112
Cromatograma Biscoito D
Cromatograma Biscoito E
113
Cromatograma Biscoito F
Cromatograma Biscoito G
114
Cromatograma Biscoito H
Cromatograma Biscoito I
